植物乳桿菌KLDS1.0386聯合色氨酸對潰瘍性結腸炎的影響

王娜娜,李柏良,李 娜,史佳璐,宋 月,霍貴成,李艾黎

(東北農業大學食品學院,乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性和復發性胃腸道炎癥性疾病,主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)[1]。IBD病因復雜,其發病機制與嚴重程度受到多種因素影響,其發病機制與嚴重程度受到多種因素影響,其中主要包括遺傳因素、免疫反應、腸道菌群和氧化應激等因素[2]。目前治療IBD的藥物主要是抗炎或免疫抑制藥物,如氨基水楊酸、皮質類固醇和硫嘌呤,但這些藥物往往會引起嚴重的副作用[3]。

色氨酸為動物體內必需氨基酸,對腸道免疫、抑制炎癥具有重要的調節作用[4]。最新的研究表明色氨酸調節腸道免疫的本質并不是色氨酸本身,而是在腸道菌群的作用下,色氨酸分解為吲哚及吲哚酸衍生物,例如吲哚丙烯酸、吲哚乙酸、吲哚-3-乳酸等可作為芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)的配體,激活免疫系統,增強腸上皮屏障,以及腸道激素的分泌,從而發揮抗炎、抗氧化或抗毒性作用[5-8]。Takamura等[9]發現乳酸菌OLL1181激活芳基烴受體途徑,抑制結腸炎。目前研究發現大腸埃希菌、梭狀芽孢桿菌、擬桿菌、消化鏈球菌具有降解色氨酸的功能,馬梅蕾[10]從豬結腸中篩選出一株能夠利用色氨酸的腸球菌屬,但菌株存在安全性問題。乳酸菌作為有益于宿主健康的微生物,在降解色氨酸方面還未引起人們的重視。本研究以實驗室保藏的16株乳酸桿菌為研究對象,篩選出一株具有降解色氨酸能力最高的菌株植物乳桿菌KLDS1.0386,其中植物乳桿菌KLDS1.0386具有降膽固醇、生長性能優良、黏附性較好等益生功能[11-12]。將植物乳桿菌KLDS1.0386作為目標菌株用于葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的潰瘍性結腸炎小鼠進行體內預防實驗,從而評估目標菌株對腸炎小鼠的預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(KLDS1.0317、KLDS1.0318、KLDS1.0386、KLDS1.0344、1-2、2-2、4-5、1-5、4-4、8-6)、嗜酸乳桿菌(KLDS1.0901、KLDS1.0902、KLDS1.1003)、鼠李糖乳桿菌(1.0911、1.0912、LGG) 東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室保藏;C57BL/6N小鼠 雄性,清潔級,8周齡,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006;甲醇 天津市大茂化學試劑廠;L-色氨酸標準品 天津市津科精細化工研究所;葡聚糖硫酸鈉(DSS) 天津阿爾法生物科技有限公司;便隱血試劑盒 上海源葉生物科技有限公司;IL-6試劑盒、IL-10試劑盒 泉州科諾迪生物技術有限公司。

DHP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;LDZF-50KB-Ⅱ立式蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司;TGL-16G離心機 上海安亭科技儀器廠;UV-2401PC型紫外分光光度計 日本島津公司;Waters 2695高效液相色譜儀 配2996二極管陣列檢測器,美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MRS培養基 蛋白胨5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,乙酸鈉5.0 g,酵母提取物5.0 g,葡萄糖20.0 g,吐溫-80 1.0 g,硫酸錳0.25 g,檸檬酸氫二銨2.0 g,硫酸鎂0.58 g,磷酸氫二鉀2.0 g,牛肉膏5.0 g,用蒸餾水定容至1 L,調節pH至5.8,121 ℃條件下滅菌15 min。

1.2.2 色氨酸培養基 按照上述MRS培養基配方的劑量溶解于800 mL蒸餾水,調節pH至5.8,121 ℃條件下滅菌15 min。稱取2 g色氨酸加入200 mL無菌水中,使其充分溶解,用0.22 μm水系濾膜過濾除菌之后加入滅完菌的MRS培養基,混勻后即為色氨酸培養基。

1.2.3 菌株的活化 將凍存于-80 ℃條件下的16株乳酸桿菌以2%的接種量接種在MRS培養基中,37 ℃培養24 h,連續培養兩代,37 ℃培養18 h備用。

1.2.4 可降解色氨酸乳酸菌的篩選

1.2.4.1 色氨酸含量的測定 配制1 g/L的色氨酸溶液,并依次將濃度稀釋至0.020、0.030、0.035、0.045、0.100、0.200、0.300 g/L,進樣前經0.22 μm濾膜過濾。HPLC條件:色譜柱為島津C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為0.03%磷酸二氫鉀溶液∶甲醇=90∶10 (V∶V),使用前需經0.45 μm濾膜過濾,超聲脫氣;流速為1.0 mL/min;二極管檢測器,檢測波長為278 nm;柱溫為39 ℃;進樣量設置為20 μL[13]。色氨酸標準曲線為y=3.2×107x-6638.6,R2=0.9997,具有良好的相關系數,可用于樣品中色氨酸含量的測定。

1.2.4.2 色氨酸降解率的計算

式中:A為各菌株發酵后培養液的色氨酸含量,g/L;C為空白對照組的色氨酸含量,g/L;重復實驗3次,取平均值。

1.2.4.3 發酵液樣品的處理 將活化好的乳酸菌接種于色氨酸培養基,以未接菌的色氨酸培養基作為空白對照,培養24 h后,4 ℃ 8000 r/min離心15 min,將上清液稀釋一定的倍數,混合均勻后取1 mL上清液于無菌EP管,0.22 μm水系濾膜過濾置于液相進樣小瓶測定樣品中色氨酸的含量。

1.2.5 DSS誘導小鼠潰瘍性結腸炎的預防效果探究

1.2.5.1 動物實驗 將75只8周齡C57BL/6N雄鼠適應性飼養一周后隨機分為5組,每組15只,即正常組、模型組、色氨酸組、1.0386組、1.0386+色氨酸組。適應性飼養7 d后,正常組和模型組在整個實驗階段內正常飲食與用水,每天灌胃無菌PBS 0.2 mL;色氨酸組每天灌胃無菌色氨酸溶液0.2 mL(含2 mg色氨酸)[14],1.0386組每天灌胃109CFU/mL的菌懸液0.2 mL;1.0386+色氨酸組每天灌胃109CFU/mL的色氨酸菌懸液(含2 mg色氨酸)。

表1 實驗設計方案Table 1 The experimental design

除正常組外,其它四組從第22 d飲用2.5% DSS水溶液7 d;同時,造模期間,根據疾病活動指數評分細則每天進行評分,灌胃結束后,眼球取血,斷頸處死小鼠,對所需指標進行檢測。

1.2.5.2 疾病活動指數(DAI)的測定 在小鼠造模及灌胃期間每天觀察記錄小鼠的生長狀態,包括眼神毛發、體重變化、糞便形狀及便血狀況。參照Joh等[15]的評分方法,計算小鼠的疾病活動指數DAI,評分細則如表2所示。

表2 DAI評分細則Table 2 DAI score rules

1.2.5.3 小鼠結腸組織長度的測定 小鼠處死后,測量盲腸末端和近端直腸之間的結腸,測量結腸長度[16]。

1.2.5.4 小鼠器官指數的測定 小鼠解剖后,分離心臟、脾臟、肝臟、腎臟,用生理鹽水清洗并用濾紙吸干表面水分,然后迅速稱量[17]。

器官指數(%)=器官重量(g)/體重(g)×100

1.2.5.5 小鼠結腸組織病理評估 取小鼠遠端結腸(距肛門1 cm處)1 cm浸泡于甲醛中固定組織,然后石蠟包埋切片,經二甲苯脫蠟后染色,用于結腸組織病理評估[18]。

1.2.5.6 小鼠血清細胞因子的測定 灌胃結束后,眼球取血,室溫下自然凝固1～2 h,7000 r/min離心5 min,收集血清,凍存于-20 ℃冰箱,收集完畢后,通過 ELISA 試劑盒,用于IL-6、IL-10的檢測[19]。

1.3 數據處理與分析

采用SPSS 17.0進行顯著性差異分析,實驗結果采用Mean±SD表示,P<0.05為差異有顯著性意義,Origin 9.0 進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 降解色氨酸的乳酸菌的篩選

根據高效液相色譜儀檢測發酵液中色氨酸的含量,乳酸菌對色氨酸的降解作用如圖1所示,其中植物乳桿菌對色氨酸具有更好的降解作用,植物乳桿菌KLDS1.0317、KLDS1.0386、KLDS1.0344、4-5對色氨酸的降解率分別為12.78%、20.43%、18.77%、15.45%,顯著高于其他菌株(P<0.05)。嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌對色氨酸的降解作用較弱,其中參考菌株LGG對色氨酸的降解率為5.51%。16株乳酸菌對色氨酸均具有不同程度的降解作用,不同菌株之間具有差異性,降解率為3.83%～20.43%,根據乳酸菌對色氨酸的降解作用的不同,選取植物乳桿菌KLDS1.0386作為后續動物實驗的優良菌株。馬梅蕾[10]從豬腸道內分離出一株可以利用色氨酸的腸球菌,其降解率為21.59%,而本研究篩選出的植物乳桿菌KLDS1.0386對色氨酸的降解率為20.43%,兩者對色氨酸的利用程度相似,但腸球菌可能是一種具有潛在致病性的菌株,菌株的安全性不能保證,而本研究所使用的乳酸菌作為益生菌的主要來源,是被公認為安全的食品級微生物,因此篩選出一株能夠高效降解色氨酸的乳酸菌,為開發具有緩解結腸炎的功能性乳酸菌提供理論基礎和數據支持。

圖1 16株乳酸菌對色氨酸的降解作用 Fig.1 The degradation effect oftryptophan by 16 lactic acid bacteria注:不同小寫字母表示各組差異性顯著(P<0.05);字母相同表示差異不顯著(P>0.05);圖4同。

2.2 KLDS1.0386聯合色氨酸對DSS誘導小鼠潰瘍性結腸炎的預防作用

2.2.1 潰瘍性結腸炎小鼠體重變化 在造模期間,每日稱量小鼠體重,各組小鼠的體重變化如圖2所示,正常組小鼠體重平緩增加,實驗結束時體重達到(27.83±0.77) g;模型組在造模前4 d時,體重保持緩慢增加,而第5 d之后,體重開始大幅度下降,在第7 d時,體重降到最低為(19.76±1.08) g,顯著低于正常組(P<0.05),這與王碧瑩[20]的結果一致;而其它處理組的體重也從第5 d開始出現不同程度的降低,在第7 d時,色氨酸組體重為(21.25±1.22) g,1.0386組小鼠體重為(21.73±0.98) g,1.0386+色氨酸組小鼠體重為(23.35±0.89) g。造模之前的初始體重雖略有差異,但差異不顯著,而隨著飲用DSS時間的延長,DSS組小鼠體重下降幅度較大,1.0386+色氨酸組能夠明顯緩解小鼠體重降低的趨勢。

圖2 各處理組對各組小鼠體重的影響Fig.2 Effect of different treatments on body weight in mice

2.2.2 KLDS1.0386聯合色氨酸對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠DAI的影響 DAI可以反映出小鼠體重變化、大便狀態以及便血情況三個方面的總體特征,DAI評分越高,說明腸炎癥狀越明顯[21]。由圖3可知,正常組小鼠的糞便正常,DAI基本為0,小鼠毛色光澤,眼神靈敏,行動反應迅速;模型組小鼠飲用DSS第4 d開始大便呈現松散的情況,部分小鼠糞便出現血跡,體重大幅度下降,DAI值逐漸升高,隨著飲用DSS時間延長,模型組小鼠的糞便不成型,出現肉眼可見的紅褐色血跡,黏附于肛門,DAI值達到最大值,為7.21±0.21,且小鼠毛色無光澤,精神萎靡,行動遲鈍,體型消瘦,易聚堆;其它處理組在一定程度上均緩解了與模型組相似的癥狀,降低DAI值,色氨酸組的DAI值為3.67±0.59,1.0386組的DAI值為5.01±0.93,1.0386+色氨酸組小鼠DAI值為2.96±0.41,數據表明1.0386+色氨酸顯著降低了小鼠DAI值(P<0.05)。

圖3 各處理組對各組小鼠 DAI 指數的影響Fig.3 Effect of different treatments on DAI index in mice

2.2.3 KLDS1.0386聯合色氨酸對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度的影響 飲用DSS可使小鼠結腸縮短,結腸長度可直接反映結腸炎癥的嚴重程度[22]。由圖4可看出正常組的結腸長度最長,為(7.03±0.25) cm,而模型組小鼠結腸顯著縮短,為(3.80±0.1) cm;而與模型組相比,其它處理組在一定程度上都增加了小鼠結腸長度,色氨酸組和1.0386組的結腸長度分別為(4.30±0.2)和(4.27±0.06) cm,而1.0386+色氨酸組的結腸長度為(4.77±0.06) cm,與單獨使用色氨酸、1.0386相比,色氨酸+1.0386混合處理改善結腸組織縮短的效果最佳,且具有顯著性(P<0.05)。

圖4 各處理組對小鼠結腸長度的影響Fig.4 Effects of different treatmentson colon length in colitis mice

2.2.4 KLDS1.0386聯合色氨酸對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠器官指數的影響 器官指數可表明不同處理組小鼠的生長狀態。由表3可知,模型組的脾臟指數明顯高于正常組(P<0.05),色氨酸組和1.0386組的脾臟指數低于模型組,但差異不顯著(P>0.05),而1.0386+色氨酸組的脾臟指數明顯低于模型組(P<0.05),與正常組無顯著差異(P>0.05)。在心臟指數、肝臟指數和腎臟指數,各處理組無顯著差異(P>0.05),這說明1.0386+色氨酸可有效改善腸炎小鼠的脾臟指數。脾臟與機體免疫情況相關,腸道炎癥增加,使免疫系統活化,便會引起脾臟重量的增加,因此模型組的脾臟指數顯著高于正常組,這與劉凌云等[23]的研究一致。

表3 各處理組對小鼠臟器指數的影響Table 3 Effects of different treatments on organ coefficients of mice

表4 各組小鼠血清炎癥因子含量Table 4 Serum inflammatory factors in each group

2.2.5 KLDS1.0386聯合色氨酸對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理學的影響 HE組織染色可以反映出腸道的病變狀態,腸道上皮作為腸道粘膜的重要組成部分,以自身的更新能力來保護腸道受到不同的損傷[24]。由圖5 HE染色可知,正常組小鼠正常的結腸黏膜層見有豐富的杯狀細胞,黏膜表層黏膜上皮細胞呈高柱狀,排列整齊;隱窩呈瓶狀結構,中央見有小腔或無明顯腔狀結構;模型組黏膜全層固有結構消失,結締組織增生及炎性細胞浸潤;與模型組相比,其它各處理組的都在一定程度上緩解了結腸組織的損傷,其中1.0386+色氨酸組明顯改善了飲用DSS對小鼠結腸帶來的腸道損傷,由圖5e可以看出,1.0386+色氨酸組結腸粘膜層保留了大部分的杯狀細胞,腸上層結構完整,炎癥細胞浸潤顯著減輕,說明1.0386+色氨酸對結腸結構組織的保護效果最好。

圖5 各處理組小鼠結腸 HE染色(×100)Fig.5 Colonic HE staining results of different groups(×100)注:a為正常組;b為模型組;c為色氨酸組;d為1.0386組;e為色氨酸+1.0386組。

2.2.6 KLDS1.0386聯合色氨酸對血清細胞因子的影響 潰瘍性結腸炎與炎癥因子水平密切相關,采用酶聯免疫吸附試劑盒在450 nm處采用酶標儀檢測小鼠血清 IL-6和IL-10的含量[25]。細胞因子的標準曲線相關系數良好,如圖6所示。與正常組相比,DSS組的促炎性細胞因子IL-6含量顯著升高,抑炎性細胞因子IL-10的含量顯著下降(P<0.05)。與模型組相比,色氨酸組、1.0386組、1.0386聯合色氨酸組均可顯著降低IL-6水平(P<0.05)。其次,色氨酸組和1.0386組可一定程度上提高IL-10水平,與模型組相比無顯著性差異(P>0.05),而1.0386聯合色氨酸可顯著提高IL-10水平(P<0.05)。

圖6 細胞因子的標準曲線圖Fig.6 Standard curve of the serum levels of cytokines

3 結論

本實驗通過高效液相色譜法篩選出一株高效降解色氨酸的乳酸菌作為優勢菌株,并對優勢菌株和色氨酸對潰瘍性結腸炎的預防作用進行研究。通過飲用DSS建立潰瘍性腸炎小鼠模型,以使用色氨酸、1.0386以及兩者聯合對小鼠結腸炎進行干預實驗,根據小鼠臨床狀態表現、體重變化、DAI指數、結腸長度、器官指數、結腸組織病理學以及細胞因子為指標評估,發現1.0386與色氨酸聯合對潰瘍性結腸炎的緩解作用明顯優于其它兩組,在兩者的聯合作用下,有效降低DAI指數,增加結腸長度,減小脾臟指數,減輕結腸組織損傷,下調促炎因子IL-6含量,并上調抑炎因子IL-10的含量。從本實驗結果來看,KLDS1.0386聯合色氨酸能夠更好的改善潰瘍性結腸炎小鼠的效果,但具體的作用機制尚未明確,有待深入研究。