高光譜快速預測冷鮮雞胸肉中乳酸菌

何鴻舉,蔣圣啟,王 魏,王玉玲,馬漢軍,2,陳復生,朱明明,趙圣明,周浩宇

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003;2.河南科技學院博士后研發基地,河南新鄉 453003;3.河南工業大學糧油食品學院,河南鄭州 450001;4.河南科技學院生命科技學院,河南新鄉 453003)

作為禽肉重要組成的雞肉,因其脂肪和膽固醇含量低、蛋白質含量高且價格便宜等優點成為國內外消費者青睞的對象[1-3]。微生物指標直接反映了冷鮮雞肉品質好壞和腐敗程度。冷鮮雞肉在運輸、保藏和加工過程中,都會因為微生物的生長和繁殖導致品質下降[4]。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一群可以發酵糖類,并產生大量乳酸的革蘭氏陽性桿菌或球菌,廣泛存在于人、畜、禽的腸道以及許多食品、物料中[5-6]。冷鮮肉在冷藏過程中的腐敗變質主要是由于嗜冷性微生物的大量增殖代謝造成的,乳酸菌的生長繁殖加速了冷鮮肉的腐敗變質[7-8]。孫彥雨[9]研究發現,乳酸菌是真空冷鮮雞胸肉的優勢腐敗菌之一,會分解雞肉中的營養物質產生有機酸,使雞肉pH下降,感官品質下降。梁慧等[10]發現乳酸菌是冷鮮雞肉初始菌相中占比最大的菌群,達到35%。賴宏剛等[11]對冷鮮雞肉中腐敗微生物進行分離鑒定,結果表明乳酸菌是冷鮮雞肉中主要腐敗菌群之一。

傳統檢測乳酸菌的方法有平板法、PCR擴增產物法和凝膠電泳檢測法等[12-14]。雖然這些方法結果準確可靠,但存在費時費力,消耗大量藥品,以及對原有樣品造成破壞性等缺點。這些傳統方法已經無法滿足現場快速分析檢測和工業化實時在線檢查的要求。此外,這些傳統技術也不適用于測量大量樣品的場合。因此,需要開發快速檢測乳酸菌的相關方法和技術來滿足生產者和消費者對乳酸菌快速無損檢測的需求。

高光譜技術(Hyperspectral imaging,HSI)將光譜和成像結合起來,可同時獲得樣品的光譜信息和圖像信息[15],該技術被廣泛應用于肉類無損檢測的各個領域。Barbin等[16]通過高光譜技術對雞胸肉的持水力、色澤L*和pH進行建模預測,其預測模型的相關系數0.84、0.95和0.9;Yang等[17]用400～2500 nm的HSI對雞肉進行等級分類,其模型相關系數達到了0.85。王莉等[18]針對灘羊肉的菌落總數和揮發性鹽基氮進行400～1000 nm HSI的建模分析,得到預測模型的相關系數分別為0.87和0.88;王慧等[19]對雞肉嫩度的高光譜數據分析建模,最終獲得最優預測模型R為0.94,效果較好。目前,已報到的肉類乳酸菌無損檢測研究較少,大多數見于近紅外光譜技術領域。光譜技術只能夠提供被測樣品的光譜信息,其不足之處是不能反應樣本的空間分布信息,且結合高光譜技術對雞胸肉的乳酸菌含量進行無算檢測的研究鮮有報道。

本試驗基于高光譜成像技術的優勢,通過分析波長900～1700 nm高光譜數據,構建快速穩定預測模型,旨在實現對冷鮮雞肉中乳酸菌的無接觸快速檢測。為建立一種快速無損檢測雞肉中乳酸菌方法和雞肉品質在線監測設備的開發提供數據支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮雞胸肉 河南眾品股份有限公司;CM361乳酸菌培養基、CM0509蛋白胨 英國Oxoid公司;氯化鈉 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司。

HSI-eNIR-XC130型推掃式高光譜成像設備 臺灣Isuzu Optics公司;3900-ER光源 美國Illumination Technologies公司;ImSpector V10E光譜儀 芬蘭Spectral Imaging公司;CCD探測儀 愛爾蘭Andor公司;OLE2鏡頭 德國 Schneider公司;移動平臺 中國Isuzu Optics公司;SW-CJ-1D雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HV-85全自動高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;BF240微生物培養箱 德國Binder公司;Scientz-04拍打式均質機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冷鮮雞胸肉預處理 將新鮮的雞胸肉置于帶冰袋的無菌冷藏箱內,運至微生物實驗室。分割樣品前將案板和刀具放入超凈工作臺中開紫外光燈滅菌30 min。把整塊雞胸肉在超凈工作臺中分割成3.0 cm(長度)× 3.0 cm(寬度)× 1.0 cm(厚度)的小塊,共獲得119塊樣品;用一次性塑料盒將樣品分裝編號,置于0～4 ℃的冰箱內,每24 h取出若干樣本,進行高光譜數據的采集和肉樣中乳酸菌的測定。最長儲存時間為7 d。

1.2.2 高光譜數據采集 將高光譜成像設備打開預熱30 min使其光源穩定,減少光譜設備不穩定帶來的誤差。將待測樣品從0～4 ℃冰箱中取出,待其溫度恢復至室溫。然后將樣品置于設備載物臺上掃描樣品高光譜圖像,基于本實驗室前期和Wang等[20]研究成果,高光譜設備參數設置如表1所示。相機自身暗電流會使樣品圖像采集過程有附帶很多噪聲信息,需對原始圖像進行黑白校正,減少部分噪聲對高光譜數據的影響,具體校正方法和公式參考He等[21]研究。

表1 高光譜成像設備參數設置Table 1 Parameters setting of hyperspectral imaging system

1.2.3 乳酸菌測定 樣品采集完高光譜圖像之后,根據GB 4789.35-2016 《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》的要求進行檢測乳酸菌菌落總數[22]。

1.2.4 光譜數據提取及預處理 通過HSI Analyzer軟件校正高光譜圖像,提取圖像中感興趣區(Region of interest,ROI)內的每個像素點的光譜信息,計算所有像素點光譜信息的平均值。獲得的原始光譜會附帶外在的干擾和噪聲信息,影響樣品數據的真實性,因此需要對原始光譜進行預處理來消除或減弱外界光線和噪聲等因素對真實數據的影響[23]。數據采用多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction,MSC)、基線校正法(Baseline Correction,BC)、移動平均平滑(Moving Average Smoothing,MAS)、標準變量變換(Standard Normalized Variate,SNV)、歸一化法(Normalize,NOR)、中值濾波平滑(Median Filter Smoothing,MFS)、卷積平滑(Savitzky Golay Smoothing,SG)和高斯濾波平滑(Gaussian Filter Smoothing,GFS)預處理原始光譜數據,對比每一種預處理效果,獲取最佳預處理方法[24-26]。

1.2.5 預測模型構建、評價及優化

1.2.5.1 偏最小二乘模型構建及評價 偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)是一種高效率多元數據分析方法,融合了多元線性回歸(Multiple Linear Regression,MLR)和主成分回歸法(Principal Component Regression,PCR)的功能,具有適用范圍廣和預測能力強的優勢[27-28]。本試驗將900～1700 nm波長的反射率作為自變量,乳酸菌參考值作為因變量,通過PLS回歸,構建預測雞肉中乳酸菌含量的PLS模型。模型的性能通過相關系數(r)、校正誤差(Root Mean Square Error of Calibration,RMSEC)、內部交叉驗證均方根誤差(Root Mean Square Error of Cross Validation,RMSECV)和外部預測均方根誤差(Root Mean Square Error of Prediction,RMSEP)的數值大小來衡量。r越接近1,RMSE值越小,模型的精度越高,預測效果越好[29]。魯棒性和剩余預測偏差(Residual Predictive Deviation,RPD)也可以評價模型的性能。魯棒性是通過(RMSEC-RMSEP(表示,(RMSEC-RMSEP(的值越小,模型越穩定[30]。RPD是預測集所有樣本參考值的標準偏差和預測標準偏差的比值,參考Malley等[31]的RPD反映效果表,RPD在1.75～2.25,反映模型是比較有用的;RPD在2.25～3,反映模型是比較成功的;RPD在3～4,反映模型是成功的;RPD大于4,反應模型是優秀的。以上評價參數指標按式(1)～(4)計算:

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

1.2.5.2 模型優化 本試驗采用的900～1700 nm范圍內共有486個波長。采用全部波長作為建模的輸入變量,可以達到較好地的預測效果,但全波段數據量龐大且含有較多冗余信息,會降低模型運算效率,影響模型預測能力。雖然采用不同的預處理方法處理原始數據可以去除系統噪聲的影響,但預處理不能消除冗余信息、并保留對乳酸菌含量模型貢獻的有用信息。因此需要將與乳酸菌含量關系最大的最優波長從全波段中篩選出來進行建模,剔除無關信息,提取有用信息,減少數據計算量,提高建模效率和預測精度。

本試驗采用回歸系數法(Regression Coefficient,RC)[32]、逐步回歸法(Stepwise)[33]和連續投影算法(Successive Projections Algorithm,SPA)[34]篩選最優波長。這三種方法被廣泛應用于光譜模型變量選擇上,可以在建模過程中篩選有用變量、剔除不相關變量達到變量降維的效果,從而減少原始光譜數據的奇異性的和不穩定性。通過比較三種化學計量學算法篩選出最優波長的數量、波長減少量以及優化后模型的性能,挑選出最好的篩選乳酸菌特征波長的方法。

1.3 數據處理

數據整理:每個樣品的乳酸菌含量參考值對應每個樣本的光譜信息,在Excel 2010軟件中整理。

數據分集:將所有樣本按乳酸菌含量參考值從小到大排列,隨機取出樣本總數的三分之二作為校正集,剩下三分之一作為預測集。

全波段模型構建:將樣本的光譜信息作為自變量x,乳酸菌含量參考值作為因變量y。通過The Unscrambler 9.7建模軟件建立全波段偏最小二乘預測模型。

最優波長篩選:SPA法是在MATLAB R2006a程序開發軟件的工作區域中輸入樣本的光譜信息Xc,乳酸菌含量參考值Yc。然后輸入SPA的程序相關指令,通過軟件計算得到相應的最優波長。中Stepwise法是在MATLAB R2006a程序開發軟件的工作區域中輸入樣本的光譜信息Xc,乳酸菌含量參考值Yc。然后輸入Stepwise的程序相關指令,通過軟件計算得到相應的最優波長。RC法在軟件Unscrambler 9.7中通過挑選在全波段模型建立中回歸系數最大的波長,即為最優波長。

模型優化:將樣本的最優波長光譜信息作為自變量x,乳酸菌含量參考值作為因變量y。通過The Unscrambler 9.7建模軟件建立優化的偏最小二乘預測模型。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌測量結果

本試驗共獲得119個乳酸菌菌落總數參考值,按照1.3取其中40個作為預測集樣品,其余的79個作為校正集樣品,對應的光譜數據按同樣的方式分組。統計結果如表2所示。

冷鮮雞胸肉0～4 ℃儲藏7 d的乳酸菌含量變化,如圖1所示。該試驗的初始乳酸菌為2.55lg CFU/g,隨著儲藏時間的延長,在1～5 d內乳酸菌快速生長,5～7 d生長趨于緩慢。雞胸肉的品質在1～2 d內正常,無明顯變質現象;在3～4 d內黏度開始增加,彈性下降,開始出現腐敗氣味,感官品質明顯變差;在5～6 d內雞胸肉的顏色變暗,出現乳黃色崩解液體;第7 d的乳酸菌數量達到7.50lg CFU/g,雞肉已經完全發臭腐敗[35]?？赡苡捎趧傞_始冷鮮雞胸肉營養豐富適合乳酸菌的生長,腐敗微生物的總數較少,菌種之間的競爭作用較小,導致乳酸菌在前5 d快速生長。隨著乳酸菌和其他腐敗微生物的共同增殖,營養物質的慢慢耗盡,比例失調導致環境條件越來越不適宜乳酸菌的生長,衰亡的細胞數增多,導致在最后2 d生長速度變慢[36]。

圖1 冷鮮雞肉儲藏期內乳酸菌含量變化Fig.1 Change of lactic acid bacteria contents infresh chicken breast during storage period

2.2 冷鮮雞胸肉的光譜特征

圖2整體上反映119個樣品的光譜曲線高低位置不同,但趨勢一致,說明肉樣的化學成分含量不同。雖然光譜上找不到明顯的乳酸菌吸收峰,但是乳酸菌的生長離不開雞肉中的各種化學組分,可以通過化學計量學手段挖掘光譜信息,尋找到特征光譜信息與乳酸菌之間的定量關系。圖2顯示不同預處理之后雞肉樣品光譜和原始光譜在形狀上有不同的變化,這表明每種預處理消除噪聲的方法和消除效果不同。

圖2 不同預處理下的雞肉樣品近紅外光譜特征Fig.2 NIR characteristics of chicken samples under different pretreatment注:(a)原始光譜;(b)NOR預處理光譜;(c)MAS預處理光譜;(d)SNV預處理光譜;(e)SG預處理光譜;(f)MSC預處理光譜;(g)MFS預處理光譜;(h)BC預處理光譜;(i)GFS預處理光譜。

2.3 基于全波段光譜預測乳酸菌

本試驗采用PLS回歸算法挖掘雞胸肉中乳酸菌參考值與全波段光譜信息之間的相關性,即建立F-PLS回歸模型,結果如表3所示。

表3 F-PLS模型預測雞胸肉中乳酸菌含量結果Table 3 Results of predicting lactic acid bacteria by F-PLS model in chicken breast

由表3得知,利用原始光譜和預處理光譜構建的9種F-PLS回歸模型預測冷鮮雞胸肉中乳酸菌含量效果良好。rC都達到了0.963以上,rP達到了0.913以上,模型精度都較高;ΔE均在0.200以下,模型穩定性較好;RPD在2.3～3.2之內,模型建立都比較成功。但每種預處理光譜所建立的F-PLS精度、穩定性和預測能力有各有不同。通過8種預處理光譜所建F-PLS模型的各種參數與原始光譜所建F-PLS模型進行對比,SG預處理光譜的RPD最大,為3.121,參考Malley等[31]的RPD反映效果表,說明該模型是成功的。且rC為0.981,rCV為0.936,rP為0.950,模型的相關性較好,預測能力較強;ΔE為0.152,維持在較低水平,模型的魯棒性較好,性能穩定。SG預處理光譜所建F-PLS模型為最佳模型。

2.4 最優波長篩選結果

以SG預處理光譜和SG預處理光譜構建的F-PLS模型為基礎,采用RC、Stepwise和SPA算法從486個波長中篩選最優波長優化F-PLS回歸模型。結果如表4所示:三種篩選方法選出的最優波長數都在20～30之間,波長減少量在94%～96%之間。用Stepwise法篩選出來的最優波長數量最少為20個,與SPA篩選出的21個數量接近。相比較486個全波長數,RC法、Stepwise法和SPA法篩選出的最優波長數量分別減少了94.86%、95.88%和95.68%。SPA法篩選的波長具體位置如圖3所示。在SPA法篩選最優波長位置圖3中,篩選對象是900～1700 nm的486個波長,紅色方塊標識的位置即為最優波長所在位置,共21個。

表4 三種方法篩選最優波長結果比較Table 4 Comparison of optimal wavelengths selected by three methods

圖3 SPA法篩選的最優波長位置圖Fig.3 Optimal wavelength location selected by SPA

2.5 基于最優波長預測乳酸菌

利用三種方法篩選出的最優波長,分別建立優化模型,結果如表5所示。

表5 優化PLS模型預測雞胸肉中乳酸菌含量結果Table 5 Results of predicting lactic acid bacteria by optimized PLS model in chicken breast

由表5可得,與全波段F-PLS回歸模型相比較,優化后的PLS模型相關系數整體上都有所降低,誤差也都有增加。其中用Stepwise法篩選出的20最優波長,雖然波長數量最少,但所構建的SW-PLS模型效果不理想?；赗C和SPA構建的RC-PLS模型和SPA-PLS模型相比,后者使用的波長數最少,RPD最大,為2.787,rP最大,為0.949,ΔE最小,為0.135lg CFU/g。說明基于SPA法篩選出的21個最優波長建立的SPA-PLS模型精度最高,預測穩定性最好。

3 結論

對近紅外高光譜數據對冷鮮雞胸肉的乳酸菌含量進行快速無接觸檢測,采用MSC等8種不同方法預處理原始光譜后,分別構建全波段F-PLS模型預測雞肉乳酸菌,其中基于SG預處理光譜所構建的F-PLS模型效果最好。使用RC、Stepwise和SPA篩選最優波長,其中通過SPA篩選的21個最優波長建立的SPA-PLS模型預測效果最好,rP達到0.949,RMSEP為0.439lg CFU/g。結果表明,采用合適的化學計量學算法挖掘近紅外高光譜數據構建模型快速無接觸檢測冷鮮雞肉中乳酸菌是可行的。