無花果總黃酮閃式提取工藝優化及其抗氧化活性

莫一凡,姚凌云,馮 濤,宋詩清,孫 敏

(上海應用技術大學香料香精技術與工程學院,上海 201418)

無花果(FicuscaricaL.)桑科榕屬,其新鮮果實極易腐敗,因而被加工為粉、粒、糕等[1]。研究表明,無花果在抗癌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、治療白癜風等方面有顯著作用[2]。抗氧化作用的探究一直以來是醫學研究的重要環節[3]。黃酮類物質是一種母核結構為2-苯基色原酮的多酚類化合物，多以糖苷的形式存在[4-5],它具有高度的化學反應性能,能夠清除生物機體內的自由基,具有良好的抗氧化功效[6-7],不同品種無花果中均有定量的黃酮。

本研究以新疆無花果干為原料,對其總黃酮進行了提取并且通過響應面優化最佳提取工藝,隨后將無花果總黃酮與抗壞血酸的抗氧化活性進行了對比分析，為無花果干總黃酮在功能性食品、藥品、化妝品等領域應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無花果干 新疆比巴哈農牧科技有限公司;無水乙醇、NaNO2、Al(NO3)·9H2O、水楊酸、FeSO4、H2O2、NaCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、KCl、NaOH、鹽酸、鄰苯三酚、叔丁基對苯二酚、三羥甲基氨基甲烷、抗壞血酸 分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蘆丁標品 純度>98%,上海源葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

FA1604型電子天平 上海天平儀器廠;JHBE-60T型閃式高速提取器 上海釩幟精密設備有限公司;SUS304型科滿仕高速多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司;UV2350型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海-恒科學儀器有限公司;SK5200BT型超聲清洗器 上?？茖С晝x器有限公司;FE20-Plus型實驗室pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無花果總黃酮的提取工藝 方法參考文獻[19]并做適當修改,無花果干粉碎過60目篩,精確稱取無花果粉末(1.000±0.001) g按一定液料比加入一定體積分數乙醇作為提取溶劑,在設定電壓下,在閃式提取器中提取一定時間,離心(4 ℃,10000 r/min,10 min)、過濾,將所得溶液用50%乙醇定容于70 mL即可得到提取物原液,最終將提取原液放置冰箱4 ℃冷藏保存。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇體積分數對無花果總黃酮提取的影響 固定提取電壓150 V,提取時間為60 s,料液比為50∶1 mL/g,考察乙醇體積分數分別為40%,50%,60%,70%,80%時對無花果總黃酮提取量的影響,確定適宜的乙醇體積分數。

1.2.2.2 電壓對無花果總黃酮提取的影響 固定乙醇體積分數為60%,提取時間為60 s,液料比為50∶1 mL/g,考察提取電壓分別為75、100、125、150、175 V對無花果總黃酮提取量的影響,確定適宜的提取電壓。

1.2.2.3 時間對無花果總黃酮提取的影響 固定提取電壓為150 V,固定乙醇體積分數為60%,液料比為50∶1 mL/g,考察提取時間分別為20、40、60、80、100 s時對無花果總黃酮提取量的影響,確定適宜的提取時間。

1.2.2.4 液料比對無花果總黃酮提取的影響 固定提取電壓為150 V,固定乙醇體積分數為60%,提取時間為60 s,考察液料比分別為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g時對無花果總黃酮提取量的影響,從而確定適宜的液料比。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗結果的基礎上,按照Box-Benhnken中心組合實驗設計原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗。本實驗以無花果總黃酮提取量為響應值,選取提取電壓、乙醇體積分數、提取時間以及液料比四個因素三水平進行實驗探究,因素水平見表1。

表1 因素水平編碼Table 1 Coded of factors and levels

1.2.4 黃酮提取量的計算

1.2.4.1 標準曲線的繪制 稱取蘆丁標準品25 mg置于50 mL容量瓶中,加入無水乙醇溶解并且將其定容至刻度線,搖勻即得蘆丁對照品溶液。精確吸取蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分別置于10 mL的容量瓶中,各加入5 mL蒸餾水,加入5% NaNO20.6 mL,搖勻后靜置6 min,加入10% AgNO30.6 mL,搖勻后靜置6 min,加入5% NaOH 3 mL,加水至刻度,搖勻后放置20 min。于波長510 nm處測定吸光度A,以吸光度為橫坐標,蘆丁濃度(mg/mL)為縱坐標,繪制標準曲線為:y=1.0472x+0.0116,R2=0.9996

1.2.4.2 無花果黃酮含量的測定及提取量計算 準確量取0.7 mL的樣液于10 mL的比色皿中,在紫外可見分光光度計中測得樣液的吸光度,根據標準曲線計算黃酮濃度,按照公式(1)即可計算出無花果黃酮提取量。

式(1)

式中:W為無花果總黃酮提取量(mg/g),c為總黃酮濃度(mg/mL),D為提取溶液體積(mL),m為無花果粉的質量(g)。

1.2.5 無花果總黃酮體外抗氧化試驗

1.2.5.1 無花果總黃酮對DPPH自由基清除活性測定 方法參照文獻[20-22]并做適當修改,取最佳提取工藝條件下的無花果總黃酮提取物,加無水乙醇配制成含總黃酮濃度為0.03、0.06、0.08、0.10、0.14、0.20、0.26、0.30 mg/mL的樣品溶液。抗壞血酸標準品為陽性對照,加無水乙醇配制成與總黃酮濃度相同的8種不同濃度。于試管中加入3 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液,再分別加入1 mL配制好的無花果溶液或抗壞血酸溶液(0.03～0.3 mg/mL),充分混勻,并在室溫避光放置30 min后在517 nm處測定各組吸光度A1,以無水乙醇為空白對照組在517 nm處測定吸光度值A2,對照組用無水乙醇代替樣品測定吸光度A0,按公式(2)計算清除率以及IC50。

DPPH自由基清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

式(2)

1.2.5.2 無花果總黃酮對OH自由基清除能力的測定 方法參照文獻[23]并做適當修改,雙氧水與二價鐵離子反應生成OH,加入水楊酸與OH生成有色物質,在517 nm處有最大吸收峰。取1 mL配制好的樣品溶液或抗壞血酸溶液(0.03～0.3 mg/mL)分別加入1 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸,然后加入1 mL濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵,最后加入1 mL濃度為9 mmol/L雙氧水,反應30 min,在517 nm處測定吸光度A1。空白對照組用1 mL水代替雙氧水,其余步驟同上,測定吸光度A0。最后用水代替黃酮提取液,測定吸光度A2。按公式(3)計算清除率以及IC50。

OH自由基清除率(%)=[1-(A1-A0)/A2]×100

式(3)

1.2.5.3 無花果總黃酮對ABTS+自由基清除能力的測定 方法參考王晶晶[24]以及Re等[25]的測定方法并作適當調整,測定無花果總黃酮對于ABTS自由基的清除能力。配制磷酸緩沖鹽(PBS),用PBS作為溶劑配制出濃度為7 mmol/L的ABTS溶液并置于0～4 ℃保存。用PBS作為溶劑配制濃度為2.5 mmol/L的K2S2O8溶液。取50 mL ABTS溶液與50 mL K2S2O8溶液等體積混合,25 ℃避光反應12～16 h,使用前用無水乙醇將其稀釋,使其在25 ℃,734 nm波長下吸光度為0.7±0.02。分別取1 mL配制好的樣品溶液或抗壞血酸溶液(0.03～0.3 mg/mL)和3 mL ABTS工作液充分混勻,在室溫下反應30 min后,于734 nm波長下測定吸光值為A1。取1 mL PBS溶液加3 mL ABTS自由基稀釋液并測定吸光值為A0,取1 mL無花果總黃酮稀釋液加3 mL PBS溶液測定其吸光度值為A2按(4)即可計算出清除率以及IC50值。

ABTS+自由基清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

式(4)

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對無花果總黃酮提取量的影響 由圖1可見,乙醇體積分數對無花果總黃酮的提取有較大影響。當乙醇體積分數為40%～50%時總黃酮提取量隨著乙醇體積分數的增大而增大,進一步提高乙醇體積分數后總黃酮提取量呈下降趨勢,這與蘇適等[26]、黃丹丹[27]的無花果黃酮提取研究結果一致。這是由于在乙醇體積分數大于50%時,無花果中的色素,脂溶物質和糖類等雜質大量溶出從而降低了總黃酮物質的溶解[28]。在乙醇體積分數為50%時,溶劑與無花果黃酮類物質極性最接近因而總黃酮提取量達到最大,為28.53 mg/g。

圖1 不同乙醇體積分數對無花果總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of different ethanol concentrationson the yield of total flavonoids in figs

2.1.2 提取電壓對無花果總黃酮提取量的影響 從圖2可見,提取電壓對無花果總黃酮的提取有較大影響。當提取電壓為75～150 V時,總黃酮提取量隨著電壓的增大而增大,進一步提高提取電壓后無花果總黃酮提取量呈下降趨勢。這是由于當提取電壓大于150 V,閃式提取器的刀頭轉速也增大,無花果粒徑變小從而引起表面能增大,使其被吸附在固體表面或細微粒間相互粘聯,不易溶解,因而總黃酮提取量降低[29]。當提取電壓為150 V時,總黃酮提取量達到最大,為19.16 mg/g。

圖2 不同提取電壓對無花果總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of different extraction voltageson yield of total flavonoids in figs

2.1.3 提取時間對無花果總黃酮提取量的影響 從圖3可見,提取時間對無花果總黃酮的提取有較大影響。當提取時間為20～80 s時,無花果總黃酮提取量隨著溫度的升高而增大,進一步延長提取時間后無花果總黃酮提取量呈下降趨勢。當提取時間大于80 s時,黃酮提取量下降可能是由于隨著提取時間延長,閃式提取器頭部產生大量的熱量,提取溶劑溫度升高,使黃酮類物質發生如氧化或分解等副反應,從而導致黃酮類化合物含量下降[30]。在提取時間為80 s時,總黃酮提取量達到最大,為20.48 mg/g。

圖3 不同提取時間對無花果總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of different extraction timeson the yield of total flavonoids in figs

2.1.4 液料比對無花果總黃酮提取量的影響 從圖4可見,液料比對無花果總黃酮的提取有影響。當液料比為30～50 mL/g時,無花果總黃酮提取量隨著液料比增大而增大,進一步加大液料比后,無花果總黃酮提取量呈下降趨勢,這與彭珊珊等[31]的無花果黃酮研究結果一致。這是由于當液料比過小時溶劑未能與樣品充分接觸,細胞內外的濃度差較低影響了總黃酮的傳質效率所以其提取量較低,隨著液料比的增大,無花果總黃酮提取量隨之增大,當液料比大于50 mL/g時單位體積溶劑內總黃酮含量降低,被溶解的黃酮容易發生變性分解,因而總黃酮提取量降低[32]。液料比為50 mL/g時,總黃酮提取量達到最大,為19.16 mg/g。

圖4 不同液料比對無花果總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of different liquid materialson the yield of total flavonoids in figs

2.2 Box-Behnken響應面法試驗結果

2.2.1 響應面回歸模型建立與分析 采用Box-Behnken的中心組合的原理為依據,以乙醇體積分數(A)、提取電壓(B)、液料比(C)、提取時間(D)為自變量,無花果總黃酮提取量為因變量,采用四水平三因素響應面優化無花果總黃酮提取工藝條件,結果見下表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface experiment results and analysis

利用軟件對試驗結果進行二次多項式回歸模型擬合獲得如下的回歸模型Y=36.94-0.94A-0.82B-1.29C+0.049D-1.36AB-4.47BC-1.06BD+1.3CD-7.88A2-7.98B2-8.17C2-8.62D2

式中:Y為無花果總黃酮提取量。

表3 回歸模型分析Table 3 Regression model analysis

由四個自變量的F值可以得出各因素對無花果總黃酮提取量的影響順序為提取電壓>液料比>乙醇體積分數>提取時間,提取時間對無花果總黃酮提取量有較大的影響,模型一次項B、C,二次項A2、B2、C2、D2以及交互項AB、BC對指標影響極顯著(P<0.01),一次項A對指標影響顯著(P<0.05),而一次項D,交互項BD、CD對指標影響不顯著(P>0.05)。

2.2.2 響應曲面分析 通過多元回歸模型,進行兩因素交互分析,可以得到兩因素對類黃酮提取量的影響的響應面及等高線圖,如圖5。

圖5 提取參數顯著性交互作用對無花果總黃酮提取量的響應面曲面圖Fig.5 Response surface plots of the significant interactionson the yields of fig total flavonoids

對于響應面來說,三維圖曲面越陡峭說明這兩個因素對于因變量影響就越大,而曲面越平緩,說明這兩種因素對于因變量的影響就越小。如圖5所示,在有交互作用的影響下,乙醇體積分數和提取電壓、液料比和提取電壓的曲面比較陡峭,說明這些因素對于無花果黃酮提取量影響較大。

2.3 最佳提取條件的確定及驗證

軟件分析結果顯示,無花果總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分數49.44%,提取電壓149.29 V,液料比49.83∶1 mL/g,提取時間81.04 s。考慮實際實驗操作因素,可將實驗條件調整為:乙醇體積分數50%,提取電壓150 V,液料比50∶1 mL/g,提取時間80 s。無花果總黃酮提取量的實際實驗值為(36.94±0.02) mg/g,而預測值為36.98 mg/g,預測誤差僅為0.103%,小于3%,因此證實了預測值的準確性。

2.4 無花果總黃酮體外抗氧化活性研究

2.4.1 無花果總黃酮對DPPH自由基清除作用 在無花果總黃酮提取液濃度為(0.03～0.08 mg/mL)范圍內,隨著濃度的增加,黃酮對DPPH自由基的清除能力呈上升趨勢。在濃度為(0.08～0.14 mg/mL)時其清除能力隨著濃度的增加而緩慢增加,當濃度到達0.14 mg/mL時,無花果總黃酮對于DPPH溶液的清除率高達98.79%,此后清除率基本不變。由此可知無花果總黃酮對DPPH自由基具有很好的清除能力且具優于相同濃度的對照(抗壞血酸)(圖6)。

圖6 無花果總黃酮對DPPH自由基清除作用Fig.6 Determination of DPPH free radicalscavenging rate of figs total flavones

2.4.2 無花果總黃酮對OH自由基清除作用 隨著無花果總黃酮的濃度從0.03 mg/mL提升到0.10 mg/mL時,對OH自由基的清除能力呈現上升趨勢。當總黃酮濃度達到0.10 mg/mL后,進一步增大總黃酮濃度,清除率繼續提高但趨勢變緩,當濃度達到0.30 mg/mL時,對OH自由基的清除率高達95.2%,表明無花果總黃酮具有較好的清除OH自由基的能力,且均高于相同濃度的對照(抗壞血酸)(圖7)。并計算得到無花果總黃酮IC50=0.098 mg/mL,抗壞血酸的IC50=0.159 mg/mL,說明在同等濃度下無花果總黃酮對于OH自由基的清除效果較好。這是由于無花果總黃酮中某些成分與OH自由基進行結合,同時還阻止了Fenton反應的發生[2]。

圖7 無花果總黃酮對OH自由基清除作用Fig.7 Determination of OH free radicalscavenging rate of figs total flavones

2.4.3 無花果總黃酮對ABTS+自由基清除作用 在(0.03～0.14 mg/mL)濃度范圍內,隨著無花果總黃酮濃度的提升,ABTS+自由基的清除率在不斷提高,當總黃酮濃度達到0.14 mg/mL時,進一步增大總黃酮濃度,清除率繼續提高但趨勢變緩。當濃度為0.30 mg/mL時,ABTS+·清除率達到79.8%,表明無花果總黃酮有較好的清除ABTS+自由基的能力,但低于相同濃度的抗壞血酸對照(ABTS+自由基清除率為93%)(圖8),說明在相同濃度條件下抗壞血酸對于ABTS自由基的清除效果較好。

圖8 無花果總黃酮對ABTS+自由基清除作用Fig.8 Determination of ABTS+ free radicalscavenging rate of figs total flavones

3 討論與結論

本實驗在單因素實驗的基礎上,通過響應面建立了無花果提取工藝的二次項回歸方程,該模型顯著性良好,所得的方程擬合度高。最終確定的最佳提取方案條件為:提取電壓150 V,提取時間80 s,液料比50∶1 mL/g,乙醇體積分數50%,并且最終提取量高達(36.94±0.02) mg/g。無花果總黃酮的提取量比文獻[8]和[9]分別提高了76.84%、47.53%?？赡苁翘崛》椒ú煌?閃式提取法更有利于黃酮的充分溶解;也可能與產地有較大的關系,具體新疆無花果與別的地區所產無花果的總黃酮提取量和抗氧化性能有何差異,還待進一步研究。

抗氧化實驗結果顯示無花果總黃酮具有較好的抗氧化活性,與對照抗壞血酸相比,其對DPPH自由基和OH自由基清除效果更好,而對于ABTS+自由基的清除效果弱于抗壞血酸。人體內過量的自由基會導致炎癥、腫瘤等健康問題[33],相關結果表明無花果總黃酮具有應用在抗氧化功能性食品、藥品上的潛能。