復合酶法提取長白木根總黃酮工藝優化及抗氧化活性研究

段紅梅,王丹丹,洪 豆,江宇峰,王順余,吳淑清,*,王曉紅,*

(1.長春大學食品科學與工程學院,吉林長春 130022;2.浙江李子園食品股份有限公司,浙江金華 321031)

長白楤木(AraliacontinentalisKitagwa),又名草本刺嫩芽、牛尾大活等,藥名東北土當歸,與藥王人參同屬五加科多年生草本植物[1],營養物質極為豐富,是一種珍貴的山野菜,且具有保健功效。古醫書記載其根可入藥,具有祛風燥濕、解熱鎮痛、疏風活血和利尿解毒等功效[2]。現代臨床醫學表明長白楤木己得到廣泛關注:Lim等人研究表明長白楤木根的成分具有明顯的抗炎活性[3]。Kim等人研究證實長白楤木富含二萜、三萜、脂肪酸、黃酮類、揮發油等多種生物活性成分,并且從中分離得到一種三萜皂苷,其具有很強的降糖活性[4];長白楤木還富含黃酮類及苷類化合物,其具有較強的抗氧化活性[5]。王忠壯等人研究得到貝殼烯酸、貝殼杉醇酸、海松酸等二萜成分具有鎮靜作用[6]。除此之外,其根中其他成分還有降血脂、預防心腦血管、抗腫瘤和保護神經系統等功效[7]。

目前,黃酮類物質的主要提取方法有:水-有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、酶法提取及微波輔助提取法等[8-9]。而酶法提取主要采用酶破壞植物組織細胞,使細胞壁疏松、破裂,降低傳質阻力,且與溶劑乙醇聯用提取黃酮類物質還具有協同作用[10-11],酶法提取具有得率高、反應條件溫和、時間短、無污染等優點[12]。因此,酶法在天然產物提取方面越來越受到重視。近年來,關于酶法提取長白楤木根總黃酮的工藝及抗氧化活性的研究鮮有報道,因此試驗采用纖維素酶/果膠酶輔助乙醇提取長白楤木根總黃酮,以總黃酮提取量作為考察指標,在單因素分析的基礎上,通過響應面法優化,確定長白楤木根黃酮類物質的最佳提取工藝,并對三種自由基的抗氧化活性進行測定,以期為長白楤木根黃酮的研究奠定基礎,為進一步開發利用長白楤木根中活性成分提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長白楤木根 由長春大學園林學院王曉紅教授的實驗種植基地提供;蘆丁標準品(液相濃度≥98%) 國藥集團化學試劑有限公司;纖維素酶(400 U/mg)、果膠酶(50000 U/g) 美國sigma公司;水楊酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚 大連美侖生物技術有限公司;2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH) 上海麥克林生化科技有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵等試劑 均為分析純,北京化工廠。

WJX-A1000型高速多功能粉碎機 上海緣沃工貿有限公司;UV-2700紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司;TDL-50B低速離心機 上海安亭科學儀器廠;GZX-9070MBE電熱恒溫鼓風干燥箱 濟南榮星分析儀器有限公司;NTS-4000B型恒溫震蕩水槽 日本東京理化器械株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 長白楤木根預處理 將新鮮長白楤木根清洗干凈,置于溫度為50 ℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥24 h,用粉碎機將烘干的樣品粉碎,過80目(0.2 mm)篩,裝入密封袋,冷藏保存備用。

1.2.2 長白楤木根中總黃酮的提取工藝流程 長白楤木根粉→加入乙醇溶劑→酶法提取→沸水浴滅酶5 min→冷卻→離心→收集上清液→總黃酮測定

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 提取溫度對總黃酮提取量的影響 準確稱取1.0000 g長白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,以50%乙醇溶液為溶劑,液料比為40∶1 (mL/g),在pH5.0的情況下,添加復合酶為5%(果膠酶∶纖維素酶=1∶1),分別在30、40、50、60、70、80 ℃水浴振蕩下提取50 min,再經沸水浴滅酶5 min,樣液經4000 r/min速度離心10 min后,取上清液為樣品待測儲備液,測定提取溫度對總黃酮提取量的影響。

1.2.3.2 復合酶(果膠酶與纖維素酶)比例對長白楤木根總黃酮提取量的影響 準確稱取1.0000 g長白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,以液料比為40∶1 (mL/g),50%乙醇溶液為溶劑,在pH5.0的情況下,添加復合酶(質量分數為5%),即果膠酶:纖維素酶比例分別為1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1,并在50 ℃水浴振蕩下提取50 min,再經沸水浴滅酶5 min,樣液經4000 r/min速度離心10 min后,取上清液為樣品待測儲備液,測定復合酶比例對總黃酮提取量的影響。

1.2.3.3 提取時間對總黃酮提取量的影響 準確稱取1.0000 g長白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,以液料比為40∶1 (mL/g),50%乙醇溶液為溶劑,在pH5.0的情況下,添加復合酶為5%(果膠酶∶纖維素酶=1∶1),并在50 ℃水浴振蕩下分別提取20、30、40、50、60、70 min,再經沸水浴滅酶5 min,樣液經4000 r/min速度離心10 min后,取上清液為樣品待測儲備液,測定提取時間對總黃酮提取量的影響。

1.2.3.4 液料比對總黃酮提取量的影響 準確稱取1.0000 g長白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,以50%乙醇溶液為溶劑,分別在液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g,pH5.0的情況下,添加復合酶為5%(果膠酶∶纖維素酶=1∶1),并在50 ℃水浴振蕩下提取50 min,再經沸水浴滅酶5 min,樣液經4000 r/min速度離心10 min后,取上清液為樣品待測儲備液,測定液料比對總黃酮提取量的影響。

1.2.3.5 乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響 準確稱取1.0000 g長白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,液料比為40∶1 (mL/g),分別以30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液為溶劑,在pH5.0的情況下,復合酶添加量為5%(果膠酶∶纖維素酶=1∶1),并在50 ℃水浴振蕩下提取50 min,再經沸水浴滅酶5 min,樣液經4000 r/min速度離心10 min后,取上清液為樣品待測儲備液,測定乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上固定提取溫度為50 ℃,根據Box-Behnken設計原理,以總黃酮提取量作為響應值,固定選擇果膠酶與纖維素酶的比例、提取時間、液料比、乙醇體積分數4個因素作為自變量,并根據單因素試驗結果進行響應面試驗,試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 長白楤木根總黃酮提取量的測定 將蘆丁標準品經110 ℃恒溫干燥至恒重并冷卻至室溫備用,準確稱取蘆丁標品10 mg,用30%的乙醇超聲溶解5 min,并定容于50 mL容量瓶中,得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液,冷藏保存備用[13]。分別精密吸取0、1、2、3、4、5、6 mL的蘆丁標準溶液置于25 mL容量瓶,各加30%乙醇溶液至6 mL,再加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻靜置6 min,再加入10%硝酸鋁1 mL,搖勻靜置6 min,再加4%氫氧化鈉溶液10 mL,最后用30%乙醇定容至刻度線,搖勻靜置15 min,在最大吸收波長500 nm處測定吸光度,記錄數據,并繪制以吸光度為縱坐標以濃度為橫坐標的標準曲線,所得回歸方程:y=10.232x+0.0049(R2=0.9992),式中y為吸光度,x為蘆丁質量濃度(mg/mL),結果表明蘆丁在0.008～0.048 mg/mL濃度范圍內與吸光度呈現出良好的線性關系[14-15]。

測定樣液時,精密吸取1 mL樣液于25 mL容量瓶中,按照制作標準曲線的方法處理,在500 nm處測定其吸光度,根據標準曲線計算長白楤木根中總黃酮含量,按公式(1)計算如下:

式(1)

式中,T:總黃酮物質的含量,mg/g;C:通過公式計算所得的總黃酮質量濃度,mg/mL;V:總黃酮提取液體積,mL;m:稱量的長白楤木根的質量,g;n:稀釋倍數。

1.2.6 長白楤木根總黃酮抗氧化活性的研究

1.2.6.1 清除DPPH·測定 根據Zheng[16]的方法稍作修改,分別配制不同質量濃度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg/mL的長白楤木根總黃酮和VC溶液。準確吸取不同質量濃度的總黃酮溶液2 mL和0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL于試管中,充分混勻,在37 ℃恒溫水浴鍋中避光保存30 min,以無水乙醇為參比,以VC作為陽性對照,在517 nm處測定吸光度。按公式(2)計算DPPH·清除率。

式(2)

式中:A0為2 mL DPPH-乙醇溶液和2 mL蒸餾水的混合液吸光度;A1為2 mL DPPH-乙醇溶液和2 mL樣品溶液的吸光度;A2為2 mL無水乙醇和2 mL樣品溶液的吸光度。

1.2.6.2 清除羥基自由基(·OH)的測定 由李多[17]的方法稍作修改,配制不同質量濃度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg/mL的長白楤木根總黃酮提取液,同時以VC作為對照進行試驗,取各質量濃度的黃酮提取液2.0 mL于試管中,向各試管中分別依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液、6 mmol/L水楊酸溶液,在37 ℃下反應1 h,以蒸餾水為參比,在517 nm波長處測定其吸光度,每個實驗平行3次。按公式(3)計算羥自由基清除率。

式(3)

式中:A0為FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸和蒸餾水混合液的吸光度;A1為FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸和樣品溶液混合液的吸光度;A2為FeSO4溶液、蒸餾水、水楊酸和樣品溶液混合液的吸光度。

式(4)

式中:v0為鄰苯三酚自氧化時反應速率;vt為加入樣品溶液后鄰苯三酚自氧化時反應速率。

1.3 數據處理

試驗均設置三次重復,采用Excel 2010軟件進行實驗數據處理并作圖,所得試驗數據采用“平均數±標準差”表示,采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對總黃酮提取量的影響 由圖1可知,隨著提取溫度的升高,長白楤木根總黃酮的提取量也逐漸增加;當提取溫度為50 ℃時,提取量達到最高為7.0 mg/g;當提取溫度繼續升高,長白楤木根總黃酮的提取量逐漸下降,由于溫度過高會使黃酮類化合物降解,導致酶活性部分喪失,但溫度過低不利于黃酮類化合物的溶出[19]。因此,選取提取溫度為50 ℃。

圖1 提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of extraction temperatureon extraction rate of total flavonoids

2.1.2 復合酶比例對總黃酮提取量的影響 由圖2可知,當果膠酶與纖維素酶的比例為1∶2～1∶1時,總黃酮提取量逐漸增大,并且當復合酶比例為1∶1時,此時長白楤木根總黃酮的提取量最大,為7.1 mg/g,這是由于果膠酶與纖維素酶的比例逐漸增加,其對長白楤木根細胞壁中網狀結構破壞力增強,增加了細胞壁通透性,進而溶解流出更多的黃酮類物質,增強了酶促反應速率,使提取量逐漸增加,而在非最佳酶配比溶液中,反而導致酶的作用受到抑制,黃酮的提取量開始降低[20]。因此,選取果膠酶與纖維素酶的比例為1∶1。

圖2 果膠酶與纖維素酶的比例對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of pectinase to cellulase ratioon total flavonoids extraction

2.1.3 提取時間對總黃酮提取量的影響 由圖3可知,隨著提取時間的延長,總黃酮提取量先升高后降低,當提取時間為50 min時,黃酮提取量達最大值6.9 mg/g,之后提取量下降,是由于時間增加,溶液溫度略升高,從而導致長白楤木根黃酮提取物有效成分的結構被破壞,發生分解或轉化為其他物質[21]。因此,選取提取時間為50 min。

圖3 提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction timeon extraction rate of total flavonoids

2.1.4 液料比對總黃酮提取量的影響 由圖4可知,當液料比低于40∶1 (mL/g)時,提取量隨著液料比的增大逐漸上升,在40∶1 (mL/g)時達到最大8.2 mg/g,由于溶劑的增加,增大了提取液乙醇與提取物長白楤木根總黃酮的接觸面積,使溶出的黃酮類化合物量增大;而液料比在50∶1～70∶1 (mL/g)時,提取量呈現下降趨勢,可能由于其它雜質的溶出對總黃酮化合物產生拮抗作用。所以,選擇液料比為40∶1 (mL/g)。

圖4 液料比對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-to-liquid ratioon extraction rate of total flavonoids

2.1.5 乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響 由圖5可知,隨著乙醇體積分數的增大,長白楤木根總黃酮提取量呈現上升趨勢,當乙醇體積分數為50%時,長白楤木根總黃酮提取量達到最大為7.5 mg/g;當乙醇體積分數為50%～80%時,總黃酮提取量則逐漸減小。由于不同濃度的乙醇溶液極性不同,乙醇體積分數越大,其溶劑極性越小,而黃酮類化合物的極性一般都較小,根據相似相容原理[22],所以乙醇體積分數越高其黃酮提取量越低。因此,選擇乙醇體積分數為50%。

圖5 乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fractionon extraction rate of total flavonoids

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果分析 在單因素試驗的基礎上,基于Box-Behnken實驗設計原理,以長白楤木根總黃酮提取量為響應值,運用Design Expert 8.0.6軟件設計響應面實驗,固定提取溫度為50 ℃,考察果膠酶與纖維素酶的比例(A)、提取時間(B)、液料比(C)、乙醇體積分數(D)間交互作用對長白楤木中總黃酮提取量的影響,因素水平設計見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface test design and results

采用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的數據進行二次多項式回歸分析,結果表明,得到總黃酮提取量對果膠酶與纖維素酶的比例(A)、提取時間(B)、液料比(C)、乙醇體積分數(D)的二次多項回歸方程:

總黃酮含量=8.11+0.068A+0.28B-0.080C-0.38D-0.49AB-0.32AC-0.48AD-0.12BC-0.36BD+0.096 CD-1.19A2-1.45B2-1.33C2-2.05D2。

根據響應面設計方案,進行方差分析,見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

采用Design-Expert 8.0.6軟件對復合酶添加量、提取時間、液料比、乙醇體積分數4個因素間交互作用進行響應面分析,得到以總黃酮提取量為響應值的響應面。各因素之間的交互作用對響應值的影響可用響應面圖和等高線表示。當響應面圖的曲面坡度越陡峭,說明兩因素之間交互作用就越大[23],兩個因素交互作用的響應面和等高線圖,如圖6、圖7所示,且由表3的方差分析表可知,AB、AD偏回歸系數差異顯著(P<0.05),說明果膠酶與纖維素酶的比例與提取時間、果膠酶與纖維素酶的比例與乙醇體積分數兩兩之間的交互作用對長白楤木根總黃酮提取量的影響顯著。而等高線是響應面中水平方向的投影,等高線的形狀可反映出交互作用的顯著性[24]。當等高線趨于橢圓形,表示兩因素之間交互作用顯著,趨于圓形則恰好相反。由圖6、圖7等高線圖可知,其中果膠酶與纖維素酶的比例和提取時間的交互作用、果膠酶與纖維素酶的比例和乙醇體積分數的交互作用影響顯著,這與表3顯著性檢驗結果完全一致。

圖6 果膠酶纖維素酶的比例與超聲提取時間交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.6 The response surface diagram and contour plot ofthe interaction between the ratio of pectinase and cellulaseand the time of ultrasonic extraction

圖7 果膠酶纖維素酶的比例與乙醇體積分數交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots ofthe interaction between the ratio of pectinase cellulaseand the volume fraction of ethanol

以總黃酮提取量為評價指標,分析得出響應面法優化長白楤木根總黃酮的最佳工藝條件為:復合酶添加量(質量分數為5%,纖維素酶∶果膠酶=1∶1.2)、提取時間為50.45 min、液料比為40.85∶1 (mL/g)、乙醇體積分數為49.95%,此時總黃酮的提取量為8.6±0.04 mg/g。

2.2.2 驗證試驗 為了實際操作的方便性和可行性,將其改為復合酶比例(質量分數為5%,纖維素酶∶果膠酶=1∶1)、提取時間為50 min、液料比為40∶1 (mL/g)、乙醇體積分數為50%。在此條件下進行3組平行試驗驗證,實際測得黃酮提取量的平均值為8.6±0.05 mg/g,與預測值8.6±0.04 mg/g相接近,由此可見,該模型可以較好的預測總黃酮的提取量。

2.3 抗氧化性試驗

2.3.1 長白楤木根總黃酮對DPPH·的清除能力 由圖8可知,隨著長白楤木根總黃酮濃度的增加,DPPH·的清除作用逐漸增大,質量濃度從0.03～0.15 mg/mL時,長白楤木根總黃酮對DPPH·的清除率從81.1%增加到96.3%,而對照組VC對DPPH·的清除率僅從19.1%增加到78.7%,并且在相同濃度下,與VC相比,長白楤木根總黃酮具有更高的DPPH·清除能力。由此可見,在一定濃度范圍內,長白楤木根總黃酮對DPPH·有很好的清除作用。

圖8 長白楤木根總黃酮對DPPH·的清除能力Fig.8 DPPH· scavenging ability of total flavonoidsfrom root of Aralia continentalis Kitagwa

2.3.2 長白楤木根總黃酮對·OH的清除率能力 由圖9可知,隨著長白楤木根總黃酮濃度的增加,黃酮提取液的·OH清除能力與質量濃度呈正相關,在黃酮濃度為0.03～0.09 mg/mL時,清除率明顯上升,之后呈緩慢上升趨勢,與VC相比,長白楤木根總黃酮具有更高的清除·OH的能力。當長白楤木根總黃酮濃度在0.15 mg/mL時,清除率最大為70.1%,而VC清除率最大為36.9%。

圖9 長白楤木根總黃酮對·OH的清除率能力Fig.9 ·OH scavenging The ability of total flavonoidsfrom root of Aralia continentalis Kitagwa

圖10 長白楤木根總黃酮對的清除率能力 scavenging ability of total flavonoidsfrom root of Aralia continentalis Kitagwa

3 結論