響應面優化泡沫法提取辣木葉蛋白工藝

孫勁毅,盧彥軒,惠永海,張世奇,*

(1.嶺南師范學院化學化工學院,廣東湛江 524048;2.廣東省辣木資源開發與利用工程技術研究中心,廣東湛江 524048)

辣木(MoringaoleiferaLam),又稱鼓槌樹、辣根樹、奇跡樹、生命之樹等,原產于非洲和印度的熱帶、亞熱帶等地區[1-2],經引種后,目前在我國的廣東、廣西、海南、云南及臺灣等省均有種植。辣木樹富含蛋白質、氨基酸、礦物質等營養成分,其根、葉、花、綠莢和種子等均可食用[3],具有較高的營養和藥用價值[4]。研究表明,辣木葉是目前已知最好的植物蛋白來源之一,其蛋白質的含量為10.74%～30.29%[5-7]。由于辣木在熱帶和亞熱帶地區被廣泛種植,因此一些發展中國家將辣木葉作為食品用以解決營養不良和糧食安全等問題[8-9]。辣木葉中的VC、VA、鈣、鉀、鐵和蛋白質的含量均高于橙子、胡蘿卜、牛奶、香蕉和酸奶等食品[10-11],且已被用于改善嬰兒、孕婦、哺乳母親的營養不良和增加哺乳期母親的母乳量等方面[12]。此外,辣木葉作為家畜飼料中蛋白質、抗生素和抗氧化劑等的優質來源,能夠改善動物生長性能、肉類氧化穩定性和感官質量[13-15],具有降低肉制品加工和冷藏后微生物生長的速度等作用[16]。

辣木葉蛋白作為優質的植物源蛋白,用何種方法提取這一問題被眾多研究者所關注。植物蛋白的提取方法主要有等電點沉淀法[17]、鹽析法[18]、酶提法[19]等,但上述方法均存在一定的弊端,諸如酸堿的使用,有機溶劑的大量浪費以及工藝的繁瑣等問題,缺少工藝簡單、環境友好型的提取方法。針對上述問題,本研究采用泡沫法提取辣木葉蛋白。泡沫法目前主要應用于廢水處理,在植物蛋白分離中的研究相對較少,其原理是利用溶液中不同物質表面活性差異對物質進行分離,表面活性強的能夠吸附在氣液相界面處形成泡沫,而表面活性弱的則停留在溶液中,使泡沫和溶液分離,然后達到分離提取的目的[20]。辣木葉蛋白作為天然的高分子表面活性劑,其具有優良的表面活性能力,因此可以通過攪打、鼓氣等方式使蛋白質吸附到氣液相交界處進行定向排列,產生大量泡沫,將泡沫收集起來可得到蛋白質溶液[21]。泡沫法運行成本低,工藝簡單,在分離過程中不需要大量的有機溶劑,能夠有效降低對環境的污染,提取后剩余的水體液及殘渣仍可添加在家畜飼料中,因此可用于工業化生產[22]。

本研究以辣木葉為原料,通過單因素試驗研究氯化鈉濃度、料液比、提取溫度對泡沫法提取辣木葉蛋白工藝的影響,在單因素實驗的基礎上,利用響應面法優化提取工藝并確定最佳工藝,旨在為辣木蛋白資源深度開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木葉 采摘于湛江市佳池塘辣木種植基地;氯化鈉、85%磷酸、無水乙醇、考馬斯亮藍G-250、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸 分析純,國藥集團;牛血清蛋白(標準品) 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

SHZ-D3循環水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;JA3002電子分析天平 上海蒲春計量儀器有限公司;TGL16M醫用離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司;TU-1810DASPC紫外可見光光度計 北京普析通用有限責任公司;MJ-BL25B3攪拌機 廣東美的生活電器制造有限公司;DDQ-B01K1打蛋機 廣東小熊電器有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州榮華儀器制造有限公司;KDN-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉蛋白的提取 參考文獻[23]的方法并加以改進,將新采摘的辣木葉洗凈后自然晾干,粉碎過100目篩,精確稱取5.000 g辣木葉粉,按實驗設計條件加入一定濃度和一定體積的氯化鈉溶液,在一定溫度下浸泡2 h,6000 r/min離心10 min,棄去殘渣,按上述條件重復離心兩次,收集上清液,在與浸泡溫度相同的溫度下用打蛋器攪打起泡,收集泡沫至無泡沫產生,靜置消泡后得到辣木葉蛋白提取液。

1.2.2 單因素試驗 以辣木葉蛋白為考察指標,按照1.2.1的提取方法分別研究氯化鈉濃度、料液比、提取溫度對辣木葉蛋白得率的影響。

固定料液比為1∶80 g/mL,提取溫度為35 ℃,其余條件與1.2.1相同,研究不同濃度氯化鈉溶液(0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%)對辣木葉蛋白得率的影響。

固定氯化鈉濃度為0.7%,提取溫度為35 ℃,其余條件與1.2.1相同,研究不同料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100 g/mL)對辣木葉蛋白得率的影響。

固定料液比為1∶80 g/mL,氯化鈉濃度為0.7%,其余條件與1.2.1相同,研究不同提取溫度(25、35、45、55、65 ℃)對辣木葉蛋白得率的影響。

1.2.3 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上,根據Box-Benhnken設計原理,以氯化鈉濃度、液料比、提取溫度為響應因素,辣木葉蛋白得率為響應值,設計響應面優化試驗。響應面試驗的各因素水平見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design experimental

1.2.4 蛋白標準曲線的制作 分別吸取100 μg/mL 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的牛血清蛋白標準液,加蒸餾水至1.0 mL,再加入5.0 mL 0.1 mg/mL考馬斯亮藍G-250溶液,混合均勻后避光反應5 min;在595 nm的波長處測定各濃度標準液的吸光度,繪制標準曲線,得到回歸方程為Y=0.008X+0.0259,其中Y為吸光度值,X為蛋白質的質量濃度(μg/mL),R2=0.9998,說明該方程在蛋白含量為10～60 μg/mL之間的線性關系良好。

1.2.5 辣木葉蛋白得率的測定 測量辣木葉提取液體積,采用1.2.2的方法測定提取液中蛋白的吸光度,并根據回歸方程計算提取液中蛋白質的質量濃度。辣木蛋白葉的得率按照下式計算:

式(1)

式(1)中,V為消泡后測得的蛋白質提取液的體積,mL;c為提取液中辣木蛋白的質量濃度,g/mL;M為使用的辣木葉干粉的質量,g。

1.2.6 辣木葉蛋白粉蛋白質含量的測定 將最佳工藝得到的辣木葉蛋白提取液冷凍干燥后得到辣木葉蛋白粉,為了更好的測定蛋白粉中蛋白質的含量,按照國家標準GB 5009.5-2016[24]中的凱氏定氮法對蛋白粉進行測定。

1.3 數據處理

所有實驗重復3次,實驗結果用平均值±標準差表示,用Origin 9.0、SPSS 25.0和Design-Expert 8.06對實驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 氯化鈉濃度對辣木葉蛋白得率的影響 由圖1可知,當氯化鈉濃度為0.9%時,辣木葉蛋白的得率最大。隨著氯化鈉濃度的增加,辣木葉蛋白的得率先升高后下降。這是由于當氯化鈉濃度的增加,蛋白質表面電荷增多,增加了蛋白質在水中的溶解度,因此得率增加,當氯化鈉濃度繼續增加時,蛋白質表面的雙電層和水化層遭到破壞導致蛋白質在水中的溶解性變差,導致蛋白質的得率下降[25]。因此選擇氯化鈉濃度為0.7%、0.9%、1.1%進行下一步實驗。

圖1 氯化鈉濃度對辣木葉蛋白得率的影響Fig.1 Effect of NaCl concentration on yield ofMoringa oleifera leaf protein注:不同字母表示差異顯著P<0.05,圖2、圖3同。

2.1.2 料液比對辣木葉蛋白得率的影響 料液比對辣木葉蛋白質得率的影響如圖2所示。當料液比為1∶60 g/mL時,辣木葉蛋白的得率最大。隨著提取液體積的增加,辣木葉蛋白的得率呈現先增大后減小的趨勢。這可能是因為當提取液較少時,辣木葉中的蛋白不能完全溶解在提取液中,導致辣木葉蛋白的得率降低;當料液比過大時,提取液中的蛋白質濃度太低,在起泡過程中產生的泡沫穩定性差,不利于泡沫收集,因此蛋白質得率也會降低[26]。因此選擇料液比為1∶40、1∶60、1∶80 g/mL進行下一步實驗。

圖2 料液比對辣木葉蛋白得率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratioon yield of Moringa oleifera leaf protein

2.1.3 提取溫度對辣木葉蛋白得率的影響 由圖3可知,辣木葉蛋白的得率隨著提取溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢,當溫度達到35 ℃時,蛋白質的得率最大。隨著溫度繼續升高,蛋白質的得率快速下降。出現這種現象是由于在溫度較低時,溫度升高有利于蛋白質的溶解,當溫度過高時,蛋白質的結構被破壞,因此得率降低[27]。因此選擇提取溫度為25、35、45 ℃進行下一步實驗。

圖3 提取溫度對辣木葉蛋白得率的影響Fig.3 Effect of temperature on yield ofMoringa oleifera leaf protein

2.2 泡沫法提取辣木葉蛋白響應面優化結果

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性分析 以單因素試驗為基礎,設計響應面試驗優化泡沫法提取辣木葉蛋白工藝,結果見表2。

表2 響應面設計方案和結果Table 2 Response surface designarrangement and experimental results

運用Design-Expert軟件進行擬合,得到的回歸模型的方程為Y=13.13+0.66A-0.22B-0.97C-0.31AB-0.083AC-0.39BC-3.05A2-0.46B2-1.95C2。

由表3可知一次項A(氯化鈉濃度)、C(提取溫度)對辣木葉蛋白質得率有極顯著的影響(P<0.01),B(料液比)的影響效果顯著(P<0.05);二次項A2、C2的影響極顯著(P<0.01),B2模型的影響顯著(P<0.05);交互項AB、BC影響顯著(P<0.05)。模型P<0.0001,說明該模型是極顯著的,模型的失擬項P>0.05,表明正常誤差在回歸方程與實際擬合所占比例小,方程擬合性強。相關系數R2=0.9954,模型推算值與實際值接近,模型擬合度高,試驗誤差小,可以對試驗結果進行準確預測,該模型在統計學上具備現實指導價值。依據F值的大小判斷A、B、C三個因素對辣木葉蛋白質得率的影響,由大到小的順序依次為:C(提取溫度)>A(氯化鈉濃度)>B(料液比)。

表3 回歸模型顯著性結果Table 3 Significance test for regression model

2.2.2 響應面圖分析 根據響應面分析結果,做出各因素之間的響應面圖和等高線圖如圖4所示。由圖4可知,響應值存在最大值,氯化鈉濃度與料液比、料液比與提取溫度的響應面較陡且等高線呈橢圓形,所以交互作用顯著,氯化鈉濃度與提取溫度的響應面相對平緩,等高線呈圓形,交互效果不顯著。

圖4 各因素之間交互作用的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and counter plots for the effects of experimental factors

2.2.3 驗證試驗 對回歸模型設數據結果進行分析,得到泡沫法提取辣木葉蛋白的最佳提取工藝條件為:氯化鈉濃度0.92%、料液比1∶56.35 g/mL、提取溫度32.69 ℃,預測辣木葉蛋白得率為13.52%。為了驗證該方法的可靠性,同時考慮實際操作情況,將泡沫法提取辣木葉蛋白的工藝修正為:氯化鈉濃度0.92%、料液比1∶56 g/mL、提取溫度33 ℃,測得辣木葉蛋白得率為13.41%±0.35%,與理論預測值相差0.83%。同其他方法提取辣木葉蛋白相比,熊瑤[28]采用堿提法和微波提取法提取辣木葉蛋白,蛋白質的得率分別為10.7%、10.35%,雖然堿提法和微波提取法的提取時間較短,但由于堿和微波對蛋白質結構產生不同程度的破壞導致兩種方法的得率低于泡沫法;黃秋偉等[29]采用超聲輔助鹽提法提取辣木葉蛋白,其得率為10.28%,該法中氯化鈉溶液的最佳濃度為0.7%,提取時間僅為30 min,但所選的最佳提取溫度達60 ℃,同時使用具有較高能量的超聲波輔助提取,在高溫和超聲波雙重作用下蛋白質極易分解變性,這可能是該法得率低于泡沫法的主要原因。將在此條件下所得辣木葉蛋白提取液冷凍干燥后得到辣木葉蛋白粉,經凱氏定氮法測定可知其中蛋白質的含量為53.94%±0.56%。

3 結論

以氯化鈉濃度、料液比、提取溫度為變量,辣木葉蛋白為得率為指標,通過單因素和響應面法對泡沫法提取辣木葉蛋白工藝進行優化。結果表明,氯化鈉濃度和提取溫度對辣木葉蛋白得率的影響極顯著(P<0.01),料液比的影響顯著(P<0.05),各因素對辣木葉蛋白得率影響的主次順序為提取溫度>氯化鈉濃度>料液比。氯化鈉濃度與料液比、料液比與提取溫度交互作用顯著(P<0.05)。經過優化后得到的泡沫法提取辣木葉蛋白的最佳提取工藝條件為鹽濃度0.92%、料液比1∶56 g/mL、提取溫度33 ℃,此條件下最大得率可達到13.41%±0.35%,所得辣木葉蛋白粉的蛋白含量為53.94%±0.56%。本研究所采用的泡沫法能耗低、污染少且得率較高,能夠有效實現辣木葉蛋白的初步分離,為辣木資源的進一步開發提供理論依據。