超聲輔助酶法提取香菇柄滋味物質工藝優化

張愛愛,黃 文,王 益,劉 瑩

(華中農業大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

香菇為擔子菌綱、傘菌目、口蘑科、香菇屬的一種傳統的藥食兩用真菌,享有“蘑菇之王”的美譽,是繼雙孢蘑菇之后世界第二大栽培食用菌[1]。香菇中富含多種活性物質,其中香菇多糖具有降血壓、抗癌、免疫調節等活性,基于此香菇已逐漸發展成為一種功能性食品[2-3]。但由于其纖維化程度高,咀嚼性和加工利用性較差,使其在采收及加工過程中被大量丟棄,造成資源的浪費[4]。

香菇獨特的風味主要來源于非揮發性滋味物,研究表明香菇柄中含有豐富的可溶性糖、游離氨基酸、核苷酸等滋味物質[5-6]。香菇柄中滋味物質的提取方法主要有:熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶解輔助提取法、固態發酵法等[7-9]。由于香菇柄中的大部分滋味成分被纖維素包裹而難以釋放出來,目前香菇柄滋味物質提取率較低,限制了香菇柄滋味物質的利用。超聲波輔助提取技術可以加速胞內物質溶出,縮短提取時間[10]。酶具備的高效性和專一性,有助于靶向破壞原料的細胞壁和細胞間質結構,加速胞內活性成分的溶出,提高提取率[11-12]。目前未見關于超聲波輔助酶法提取香菇柄中滋味物質提取工藝方面的報道。

針對香菇柄中滋味物質提取率低的問題,本研究擬采用超聲輔助酶法對香菇柄中可溶性糖、滋味肽、游離氨基酸等滋味物質進行提取,在單因素實驗的基礎上,通過響應面法優化提取工藝，以期提高香菇柄中滋味物質的提取率,為后續香菇柄資源的開發利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干制香菇柄 產自湖北襄陽;纖維素酶(50 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;一水合檸檬酸、二水合檸檬酸三鈉、濃硫酸、茚三酮 均為國產分析純。

DF-101S智能集熱式恒溫磁力攪拌器 武漢亨泰達儀器設備有限公司;US3120DH數控超聲波清洗器 北京優晟聯合科技有限公司;UV-1700紫外-可見分光光度計 日本島津公司;ZNHW-II智能恒溫電熱套(1000 mL) 河南愛博特科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香菇柄的預處理 香菇柄粉碎后過60目篩,得篩下物為香菇柄粉,置于干燥器內密封保存。

1.2.2 香菇柄滋味物質的提取工藝 稱取20 g香菇柄粉樣品于1 L燒杯內,按一定料液比加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.8),攪拌均勻,以一定的超聲功率和超聲時間對上述液體進行處理后,加入適量的纖維素酶,于50 ℃恒溫水浴鍋中攪拌酶解一定時間,沸水浴中滅酶10 min,蒸餾至餾出液為50 mL時停止蒸餾,剩余液體抽濾后定容至1000 mL,得香菇柄滋味物質提取液。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 超聲功率的確定 按照“1.2.2”的方法,設定提取條件為:料液比1∶20 g/mL,超聲時間10 min,纖維素酶添加量0.6%,酶解時間1.0 h,考察超聲功率(60、120、240、360、480 W)對滋味肽、可溶性糖、游離氨基酸含量和滋味綜合評分的影響。

1.2.3.2 超聲時間的確定 在上述最優超聲功率的基礎上,設定提取條件為:料液比為1∶20 g/mL,加酶量為0.6%,酶解時間為1.0 h,考察超聲時間(5、10、15、20、25 min)對滋味肽、可溶性糖、游離氨基酸含量和滋味綜合評分的影響。

1.2.3.3 加酶量的確定 在上述最優超聲功率和超聲時間的基礎上,設定提取條件為:料液比為1∶20 g/mL,酶解時間為1.0 h,考察加酶量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)對滋味肽、可溶性糖、游離氨基酸含量和滋味綜合評分的影響。

1.2.3.4 酶解時間的確定 在上述最優超聲功率、超聲時間和加酶量的基礎上,設定提取料液比為1∶20 g/mL,考察酶解時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)對滋味肽、可溶性糖及游離氨基酸含量和滋味綜合評分的影響。

1.2.3.5 料液比的確定 在上述最優超聲功率、超聲時間、加酶量和酶解時間的基礎上,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對滋味肽、可溶性糖及游離氨基酸含量和滋味綜合評分的影響。

1.2.4 響應面優化實驗 在單因素實驗的基礎上,選擇對滋味物質綜合評分影響較大的三個因素,即超聲時間、加酶量和料液比三個因素為自變量,以滋味物質綜合評分為響應值,通過Design Expert 8.0.6軟件,采用Box-Behnken設計方法,進行三因素三水平的響應面分析實驗,獲得最佳提取工藝。實驗因素水平設計見表1。

表1 響應面實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 滋味物質含量的計算

1.2.5.1 滋味肽含量的測定 以牛血清蛋白為標準品,參照文獻[13],進行測定,得滋味肽標準曲線線性回歸方程為y=0.4128x+0.0046,R2=0.9999。取10 mL提取液,用活性炭脫色后定容至100 mL,取1.5 mL進行測定。

式中:C為根據吸光值計算出的溶液中對應物質的含量,mg;V為樣液體積,mL;N為樣液稀釋倍數;W表示香菇柄干重的取樣質量,g。

1.2.5.2 可溶性糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[14]測定,以蔗糖為標準品,得可溶性糖標準曲線線性回歸方程為y=0.0047x+0.0593,R2=0.9971。樣品制備同1.2.5.1,取2 mL進行測定。

式中:C為根據吸光值計算出的溶液中對應物質的含量,mg;V為樣液體積,mL;N為樣液稀釋倍數;W表示香菇柄干重的取樣質量,g。

1.2.5.3 游離氨基酸含量的測定 采用茚三酮試劑顯色法[14]測定,以亮氨酸為標準品,得游離氨基酸標準曲線線性回歸方程為y=0.0036x-0.0766,R2=0.9983。樣品制備同1.2.5.1,取2 mL進行測定,樣液中游離氨基酸含量計算公式同1.2.5.2。

1.2.6 滋味綜合評分計算 采用熵權法對滋味肽、可溶性糖及游離氨基酸含量進行滋味綜合評價[15-17]。

滋味綜合評分=(滋味肽含量/滋味肽含量max)×W1+(可溶性糖含量/可溶性糖含量max)×W2+(游離氨基酸含量/游離氨基酸含量max)×W3

式中:Wi為某一指標的權重值;Hi為第i個指標的信息熵;η為指標個數;(Xij)mn和(Pij)mn分別為m個評價對象和n個評價指標構成的原始指標數據矩陣和概率矩陣。

1.3 數據處理

為了保證實驗的精確度,每個處理均重復三次,結果取平均值。采用Excel軟件處理數據,Origin 9.0作圖,響應面工藝優化實驗通過Design Expert 8.0.6進行設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.2.1 超聲功率對滋味物質的影響 由圖1可知,隨著超聲功率的加強,可溶性糖、游離氨基酸及滋味肽含量和滋味綜合評分整體呈現先升高后降低的趨勢。可溶性糖、滋味肽含量及滋味綜合評分均在120 W時達到最大值。游離氨基酸含量在60～240 W時持續增長,之后隨著超聲功率的升高而逐步降低,120～240 W時增長緩慢，這說明在超聲功率小于120 W時,超聲功率的增強,使可溶性糖、游離氨基酸、滋味肽等滋味物質迅速從細胞內游離出并溶解于提取液中,隨著空化作用、均勻化作用的加強,提取液中滋味物質的含量達到最大值[18-20]。但當超聲功率過大時,會引起局部的高溫、高壓,造成滋味物質的破壞,降低提取液中滋味物質的含量[21]。因此,選擇120 W為最佳超聲波處理功率。

圖1 超聲功率對香菇柄滋味物質的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.2.2 超聲時間對滋味物質的影響 由圖2可知,隨著超聲時間的延長,可溶性糖、游離氨基酸及滋味肽含量和滋味綜合評分均呈現先升高后降低的趨勢,且均在20 min時達到最大值。可能是超聲時間達到一定值時,原料與溶質已充分接觸,內容物不會再溶出,繼續延長超聲時間會伴隨大量的熱量產生,使可溶性糖發生焦糖化反應[22]、小分子肽發生變性,而游離氨基酸被空化作用產生的自由基氧化,造成含量下降[23]。因此,選擇20 min為超聲波處理最佳時間。

圖2 超聲時間對香菇柄滋味物質的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.2.3 加酶量對滋味物質的影響 由圖3可知,加酶量對可溶性糖、游離氨基酸、滋味肽的含量和滋味綜合評分的影響不同,可溶性糖含量和滋味物質綜合評分在加酶量0.8%時達到最大值,滋味肽含量在加酶量0.4%時達到最大值,而游離氨基酸含量在加酶量為0.6%時達到最大值。總體來說,在加酶量達到0.4%時,滋味物質溶出量和滋味綜合評分均達到較高水平。這是因為纖維素酶添加量低于0.4%時,酶與香菇柄中目標物質充分反應;當加酶量高于0.4%后,酶濃度過高,產物濃度增大,當反應達到平衡后,抑制了酶的作用,降低了滋味物質的含量[24]。隨著纖維素酶添加量的增加,生產成本增大,選擇纖維素酶的最適添加量為0.4%。

圖3 加酶量對香菇柄滋味物質的影響Fig.3 Effect of the amount of enzyme on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.2.4 酶解時間對滋味物質的影響 由圖4可知,可溶性糖含量及游離氨基酸含量和滋味綜合評分隨酶解時間的延長呈先升高后降低的趨勢,且均在1.0 h時達到最大值。滋味肽在酶解2.0 h后,隨著時間的持續延長,含量的增長趨于平緩。這是由于纖維素酶與底物充分反應一段時間后,體系中無多余底物繼續與其發生反應,故即使時間繼續延長,滋味肽含量也基本保持不變。而對于可溶性糖及游離氨基酸而言,酶解時間達到1.0 h后,隨酶解時間的延長目標物質可能發生降解或者游離氨基酸與碳水化合物發生結合,進而導致含量下降[25]。因此,選擇1.0 h為最佳纖維素酶處理時間。

圖4 酶解時間對香菇柄滋味物質的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.2.5 料液比對滋味物質的影響 由圖5可知,可溶性糖及滋味肽含量和滋味綜合評分呈現不斷上升趨勢,在料液比達到1∶25 g/mL后,繼續增大料液比,各物質含量增長均變遲緩。這是因為隨著料液比的增大,香菇柄粉末中可溶性糖及滋味肽逐漸完全溶出,繼續增大料液比,不能提高滋味物質的溶出量。游離氨基酸含量隨料液比的增大呈現先升高后降低的趨勢,在料液比為1∶15 g/mL時達到最大值。隨著料液比的增大,游離氨基酸溶出量趨于飽和,繼續增大料液比可能使其他水溶性物質溶出,導致游離氨基酸提取受阻。因此,選擇1∶25 g/mL為料液比最佳水平。

圖5 料液比對香菇柄滋味物質的影響Fig.5 Effect of material/liquid ratio on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.3 響應面實驗結果

由上述單因素實驗結果可知,超聲時間、加酶量和料液比三個因素引起滋味綜合評分的波動值較大,即這三個因素對滋味物質綜合評分的影響較大,故以滋味物質綜合評分為響應值,選取超聲時間(A)、加酶量(B)和料液比(C)為考查因素,進行響應面試驗設計,實驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.1 模型建立和顯著性分析 利用Design Expert 8.0對表2數據進行多元回歸擬合分析,得方程為Y=0.92+0.019A+2.615E-004B+0.025C+0.011AB-0.038AC+0.046BC-6.863E-003A2-0.064B2+0.021C2,回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

P

P

R

2

R

2

[26]

2.3.2 響應面結果分析 由圖6可直觀看出各因素交互作用對滋味綜合評分的影響,響應面坡度越陡峭表明香菇柄滋味綜合評分受該因素的交互作用的影響越大,反之則受該因素的交互作用的影響越小[27]。由圖6可知,加酶量和料液比及料液比和超聲時間的響應面坡度均比較陡峭,而加酶量和超聲時間的響應面坡度比較平緩,該結果與表3結果相符合。

圖6 交互項對滋味綜合評分影響的響應面Fig.6 Response surface showing the effect ofinteraction terms on taste comprehensive score

2.3.3 最佳工藝驗證 通過Design Expert 8.0.6軟件分析,得可溶性糖、游離氨基酸及滋味肽的最優提取工藝為:超聲時間15 min、加酶量0.46%、料液比為1∶30 g/mL,此時模型預測的滋味綜合評分為0.9795,在最佳工藝條件下進行三次重復試驗,得滋味綜合評分為0.9916±0.0022,與模型預測值之間的誤差為1.24%,表明該模型預測性良好,實驗結果可靠。其中在此條件下可溶性糖、滋味肽和游離氨基酸的含量分別達到73.38、595.42和26.23 mg/g。

3 結論

本研究采用超聲輔助酶法提取香菇柄中的可溶性糖、滋味肽、游離氨基酸等滋味物質,在單因素實驗的基礎上,對滋味物質的提取工藝進行Box-Behnken響應面優化,得最佳提取工藝參數為:超聲功率120 W,超聲時間15 min,酶解時間1.0 h,纖維素酶添加量0.46%,料液比1∶30 g/mL。此條件下可溶性糖、滋味肽和游離氨基酸的含量分別為73.38、595.42和26.23 mg/g,三者的綜合評分為0.9916,與模型預測值之間的誤差為1.24%,表明該模型可用于預測香菇柄中滋味物質的提取工藝。該方法有利于可溶性糖、滋味肽、游離氨基酸等滋味物質從高度纖維化的香菇柄細胞中充分溶出,從而提高了香菇滋味物質的提取率,縮短了提取時間。該方法可以快速、高效地提取出香菇中滋味物質。研究結果為香菇柄中滋味物質的高值化制備提供了數據支撐,為后續香菇柄滋味物質的開發利用奠定基礎。