雞胚肽鋅螯合物的制備工藝及免疫調節功能研究

吳明澤,王 壘,王 笑,李 婷,胡祥昊,董丹華,李亞男,馬青琳,代 龍,高 鵬,*

(1.山東中醫藥大學藥學院,山東濟南 250355;2.凱萊英生命科學技術(天津)有限公司,天津 300457;3.山東省文登整骨醫院藥學部,山東威海 264400;4.濱州醫學院藥學院,山東煙臺 264003)

雞胚蛋又稱“活珠子”,是南京著名的特產,屬金陵小吃。李時珍《本草綱目》中有記載:“雞胚蛋,性溫無毒,主添精,助氣益血,扶虛,治男女虛勞,矢志恍惚。”可見雞胚可能具有一定的增強免疫的功能。研究表明,雞胚經過酶解可降低蛋白的過敏原性,獲取一些具有重要生物活性的小肽[1]。鋅對增強人體內的體液及細胞的免疫功能意義重大,能夠增強吞噬細胞吞噬病原體的功能,調整病變組織周圍的血流量及物質代謝,從而達到增強局部和整體機能狀態的目的[2]。而傳統的補鋅劑如硫酸鋅等,存在吸收率差、副作用大、易刺激腸胃、在體內蓄積中毒等[3]問題,肽與微量元素的螯合產物可以避免這些問題,它不僅能促進肽的吸收,同時也能補充人體所需要的微量元素。

近年來,對于肽螯合微量元素免疫活性的研究逐漸增加。左愛玲[4]發現鈣螯合膠原肽能夠在防治骨質疏松的同時,增強正常大鼠的免疫力。張智等[5]發現玉米肽鋅螯合物能夠能提高非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫功能。梁營芳等[6]發現適量的帶魚酶解蛋白亞鐵螯合肽可以提高對蝦的免疫相關指標。針對雞胚肽的活性研究相對較少,Xue等[7]對雞胚抗氧化活性肽進行了分離純化及結構鑒定,而螯合微量元素的雞胚肽活性研究尚未見報道。

因此,本實驗以雞胚蛋為原材料,通過分步酶解法制備雞胚肽,將雞胚肽與鋅元素螯合,以螯合率為指標進行單因素實驗考察,響應面法優化螯合工藝,篩選出最佳螯合工藝,結合免疫調節藥效學研究驗證其藥效。通過本實驗可探索雞胚肽鋅螯合物的免疫活性研究,為以后雞胚肽在功能性食品及保健食品等開發提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胚蛋浙江省 南京六合丹田農場;昆明種封閉群無菌型小白鼠(體重20±2 g),健康狀況良好,共60只,雌雄各半,動物合格證號:SCXK(魯)2017-0011 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司;胰蛋白酶(100000 U/g)、堿性蛋白酶(100000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;茚三酮、鉻黑T(均為分析純) 濟南躍陽化工有限公司;鋅單元素 中國計量科學研究院;3,3′-二氨基聯苯胺、乙二胺四乙酸二鈉鹽、乙二胺四乙酸(均為分析純) 天津金匯太亞化學試劑有限公司;注射用環磷酰胺 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

R-301型旋轉蒸發器 上海申順生物科技有限公司;GZX-9030MBE型電熱鼓風干燥箱 吳江宏昌有限公司;DS-1型高速組織搗碎機 無錫沃信儀器有限公司;JM-L50型膠體磨 上海諾尼輕工機械有限公司;PK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;SW-CJ-2FD型磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;JM-L50型冷凍干燥機 上海諾尼輕工機械有限公司;FE-20型pH計 梅特勒儀器有限公司;UV1100型紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;AB135-S型十萬分之一天平、AL-204型萬分之一天平 上海精科實業有限公司;JB-500型精密扭力天平 上海維菱科學儀器有限公司;DT5-2型離心機 北京時代北利離心機有限公司;iCE 3300 AAS型原子吸收光譜儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;TANK PRO型微波消解儀 上海新儀微波化學科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞胚肽凍干粉的制備 將雞胚蛋洗凈,去殼,用組織搗碎機高速搗碎,加入8倍量去離子水,膠體磨對其進行勻漿處理,煮沸20 min,進行高溫殺菌,待溫度降至55 ℃,調節pH至8.0,加入3%的堿性蛋白酶,酶解3 h;待降溫至37 ℃,加入2%的胰蛋白酶,繼續酶解2 h;煮沸,高溫殺酶15 min,迅速冷卻至室溫,放置冰箱低溫(4 ℃左右)冷藏過夜,離心(4500 r/min)10 min,取上清液,濃縮,-24 ℃預冷凍5 h(或-80 ℃預冷凍1 h),冷凍干燥24 h(-45 ℃,23 Pa),得雞胚肽凍干粉。

1.2.2 雞胚肽螯合鋅元素的工藝 取雞胚肽凍干粉,加適量的水溶解,在一定的螯合pH條件下,按照需要的比例加入一定的鋅溶液混合均勻,在一定溫度下螯合一定時間,用95%乙醇醇沉,將醇沉液置于低溫高速離心機中在4500 r/min條件下離心20 min,取沉淀物,將沉淀物加入95%乙醇進行二次洗滌后,離心,將制得的雞胚肽鋅螯合物,置于-24 ℃下預冷凍5 h(或-80 ℃下預冷凍1 h),放置于凍干機中凍干24 h(-45 ℃,23 Pa),粉碎,即得雞胚肽鋅螯合物凍干粉。

1.2.3 單因素實驗 以螯合率及螯合物得率為考察指標,進行單因素實驗[8],分別考察螯合pH(A)、螯合溫度(B)、雞胚肽與鋅濃度比(C)、螯合時間(D)對雞胚肽鋅螯合反應的影響,每個因素5個水平。在螯合溫度70 ℃、雞胚肽與鋅濃度比為2.0∶1、螯合時間2.0 h條件下考察螯合pH的影響,水平設置為6、7、8、9、10;在螯合pH為8、雞胚與鋅濃度比為2.0∶1、螯合時間為2.0 h條件下考察螯合溫度的影響,水平設置為50、60、70、80、90 ℃;在螯合pH8、螯合溫度70 ℃、螯合時間2.0 h條件下考察雞胚肽與鋅濃度比的影響,水平設置為1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1;在螯合pH為8、螯合溫度70 ℃、雞胚肽與鋅濃度比為2.0∶1條件下考察螯合時間的影響,水平設置為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.2.4 響應面法優化實驗 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken實驗設計原理[9],以螯合率為指標,選取螯合pH(A)、螯合溫度(B)、雞胚肽與鋅濃度比(C)以及螯合時間(D)四個因素為自變量,采用軟件Design-Expert V8.0.6.1設計四因素三水平的響應面分析實驗,因素與水平設計如表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 螯合率、螯合物得率的測定 螯合率的測定首先根據GB 5009.14-2017《食品中鋅的測定》的測定方法進行測定雞胚肽鋅螯合物中鋅的質量。其中原子吸收光譜儀設定參數為:測定波長為213.9 nm,通帶0.2 nm,燈電流為75%,燃氣流量為1.2 L/min,燃燒器高度為7.0 mm,計算螯合率和螯合物得率。

式(1)

式中:M0:反應體系鋅的總質量,mg;M1:雞胚肽中鋅的質量,mg;M2:雞胚肽鋅螯合物中鋅的總質量,mg。

式(2)

式中:W0:反應物的總重量,mg;W1:反應生成的螯合物重量,mg。

1.2.6 雞胚肽鋅螯合物的免疫調節實驗 免疫調節實驗采用免疫器官-胸腺和脾臟質量指數法[10]測定。將小鼠隨機分為5組,每個劑量組12只,共60只。小鼠適應性培養5 d,飼養環境為屏障環境,環境溫度為22～26 ℃、相對濕度為50%～70%,飼養室提供12/12 h的晝夜交替時間,非工作時間使用動物照度[11]。小鼠正常飲食采水,每天灌胃1次,灌胃劑量1 mL/100 g,共灌胃30 d[12]。正常對照組、模型組生理鹽水給藥;實驗組:富鋅雞胚肽低、中、高劑量組給藥濃度分別為5、10、20 mg/mL。在灌胃的最后4 d開始在模型組和實驗組腹腔注射0.25 mL的環磷酰胺注射液,注射時間為灌胃后4 h,注射藥物期間小鼠飲食采水量相對減少,活動和精神狀態減弱[13],體重增加值、飼料效率等指標與正常對照組無顯著差異(P>0.05),在最后1次注射環磷酰胺2 h后處死所有小鼠,稱重,迅速剖取胸腺和脾臟組織,用濾紙吸去表面血液,在精密扭力天平上稱重,計算胸腺和脾臟質量指數。

式(3)

式(4)

式中:m0:小鼠質量,g;m1:胸腺組織質量,g;m2:脾臟組織質量,g。

1.3 數據處理

實驗數據均以“平均值±標準偏差”表示(n=3)。采用SPSS 22.0統計分析軟件進行單因素方差分析(ANOVA)[14]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

不同螯合pH對雞胚肽螯合率及螯合物得率的影響如圖1所示,在螯合pH為6～8時,雞胚肽螯合率隨著pH的升高而迅速升高,在pH為8時最高;pH為8～10時,螯合率隨著pH的升高而降低,這可能由于堿性環境下Zn(OH)2的生成爭奪了Zn2+或堿性條件抑制了肽的活性。螯合物得率在pH為10時最高,這也可能由于Zn(OH)2沉淀析出,導致螯合物得率虛高[15]。因此選擇pH7、8、9為響應面優化實驗螯合pH的三個水平。

圖1 螯合pH對螯合率及螯合物得率的影響Fig.1 Effect of chelating pHon chelation rate and chelate yield

不同螯合溫度對雞胚肽螯合率及螯合物得率的影響如圖2所示,在50～70 ℃時,雞胚肽螯合率及螯合物得率隨著螯合溫度的升高而迅速升高;在70 ℃時螯合率最高,可能隨著溫度的升高,反應體系的分子運動加快,易于鋅離子螯合的氨基酸殘基和位點暴露出來[16],從而導致螯合率及螯合物得率的升高。螯合溫度為70～90 ℃,隨著螯合溫度增加,螯合率及螯合物得率逐步降低,可能高溫導致雞胚肽活性降低,或者生成的肽鋅螯合物結構不穩定[17],從而導致螯合率及螯合物得率的降低。因此選擇60、70、80 ℃為響應面優化實驗螯合溫度的三個水平。

圖2 螯合溫度對螯合率及螯合物得率的影響Fig.2 Effect of chelating temperatureon chelation rate and chelate yield

不同雞胚肽與鋅濃度比實驗結果如圖3所示,在1.0∶1～2.0∶1濃度比下,隨著雞胚肽與鋅濃度比的增加,螯合率及螯合物得率呈逐漸增加的態勢;當濃度比大于2.0∶1時,螯合率及螯合物得率增長趨勢不明顯,可能隨著濃度比的增長,鋅與雞胚肽的螯合作用逐漸飽和,過量的雞胚肽與鋅離子的螯合能力不斷減弱,故而螯合率及螯合物得率不再大幅增長。因此,選擇1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1為響應面優化實驗雞胚肽與鋅濃度比的三個水平。

圖3 雞胚肽與鋅濃度比對螯合率及螯合物得率的影響Fig.3 Effect of concentration ratio of chicken embryopeptide to zinc on chelation rate and chelate yield

不同螯合時間實驗結果如圖4所示,當螯合時間不斷增長時,螯合率及螯合物得率也在不斷逐漸增加,在2.5 h之前,螯合率及螯合物得率增加較快,此后再隨著時間的推移螯合率及螯合物得率變化不大,可能2.5 h時,雞胚肽中易與鋅螯合的氨基酸殘基及位點基本飽和,所以螯合率及螯合物得率增長極少,考慮到經濟及效率等因素,縮短螯合時長,故選擇1.5、2.0、2.5 h為響應面優化實驗螯合時間的三個水平。

圖4 螯合時間對螯合率及螯合物得率的影響Fig.4 Effect of chelating time onchelation rate and chelate yield

2.2 響應面優化實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計及結果 綜合單因素實驗結果,選取螯合pH(A)、螯合溫度(B)、雞胚肽與鋅濃度比(C)、螯合時間(D)為自變量,以螯合率(Y)為響應值,根據Box-Behnken設計原理進行響應面實驗[18],實驗設計方案和結果如表2所示。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface test

表3 螯合率回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of chelation rate regression equation

圖5 雙因素交互作用影響螯合率的等高線及三維曲面圖Fig.5 Contour line and three-dimensional surface map of two-factor interaction affecting chelation rate

2.2.2 最佳螯合條件的確定及驗證 通過Design Expert V8.0.6.1分析得到以螯合率為指標的最佳螯合條件為螯合pH8.04,螯合溫度70.98 ℃,肽鋅濃度比為2.31∶1,螯合時間2.19 h,此時的螯合率預測值為49.79%,結合實際操作及經濟可行性,將螯合條件調整為pH8.0,螯合溫度70 ℃,肽鋅濃度比為2.3∶1,螯合時間2.2 h,在此條件進行三次實驗,測得螯合率為48.98%±0.35%,與預測值接近,其相對誤差為0.41%,說明在此螯合條件下的回歸方程模型可靠。此時螯合物得率為38.04%±0.26%,得率較高且穩定。

2.3 雞胚肽鋅螯合物免疫調節作用

當機體含鋅總量下降時,機體的免疫功能降低,免疫器官的重量會減少五分之一甚至五分之二[21]。免疫器官是抵抗外來有害物質的基礎,免疫器官受損會造成免疫功能細胞的減少及降低機體的免疫力,從而造成機體易感疾病[22]。因此,增加免疫器官的重量勢必對人體的免疫力有很大的提升,免疫器官-胸腺和脾臟質量指數的變化能夠反映免疫調節方面的變化[23]。

由表4可以看出,模型組與正常對照組有顯著差異,說明對模型對照組的小鼠注射環磷酰胺后,小鼠的胸腺質量指數與脾臟質量指數顯著(P<0.05)下降,這可以表明小鼠的胸腺和脾臟器官的發育受到了環磷酰胺的抑制作用,小鼠胸腺和脾臟的受損模型建模成功[24]。富鋅雞胚肽高劑量組與模型組有顯著(P<0.05)差異,說明富鋅雞胚肽對于環磷酰胺注射液所造成的免疫器官的萎縮具有明顯的促生長以及增重的作用,富鋅雞胚肽能夠使胸腺和脾臟的質量指數增大,且隨著服用劑量的加大,質量指數逐漸增加。在一定范圍內,富鋅雞胚肽具有一定的免疫調節功能。

表4 雞胚肽鋅螯合物對小鼠免疫器官-胸腺、脾臟質量指數的影響Table 4 Effect of chicken embryonic peptide zinc chelateon the immune index of thymus and spleen in mice

3 結論

本實驗以雞胚蛋為原料,先用堿性蛋白酶后用胰蛋白酶進行酶解后制備雞胚肽。以螯合率及螯合物得率為指標,進行單因素實驗,再以螯合率為指標,利用響應面法優化制備雞胚肽鋅螯合物,得到的最優螯合工藝為:螯合pH8,螯合溫度 70 ℃,雞胚肽與鋅的濃度比為2.3∶1,螯合時間2.2 h,此時的螯合率為48.98%±0.35%,螯合物得率為38.04%±0.26%,通過免疫器官-胸腺和脾臟影響研究發現,適宜劑量的富鋅雞胚肽能使小鼠的胸腺和脾臟的質量指數明顯增大,說明通過雙酶酶解制備的雞胚小肽與鋅元素的螯合物具有一定的免疫調節功能,并呈現一定的量效關系。但本實驗只針對機體免疫器官的重量進行了考察,不能完全代替機體的免疫功能,淋巴細胞的生長過程、發揮作用的階段及基因信號轉導等方面均是免疫的物質基礎[25],因此全方位的藥效學實驗才能證實雞胚肽-鋅螯合物對機體免疫調節的影響。由于實驗水平及條件的限制,這些方面需進一步的考察。