響應(yīng)面法優(yōu)化堿蓬根總生物堿的提取工藝及其抑菌活性

呂夢(mèng)迪,郭 斌,*,韓冠英,崔 鏨

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000)

藜科堿蓬屬植物堿蓬(Suaedasalsa)又名翅堿蓬、黃須菜,為一年生草本植物,堿蓬在我國(guó)分布廣泛,其根莖葉及種籽富含礦物質(zhì)、脂肪、蛋白質(zhì)和維生素等,是一種優(yōu)質(zhì)蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物和具有醫(yī)療保健價(jià)值的植物資源[1]。堿蓬的藥用價(jià)值早在《本草綱目拾遺》中就有記載,“鹽蓬,味咸性寒,清熱消積”[2],具有抗氧化[3]、抗炎[4]、降糖[5]、抗腫瘤[6]、抗衰老等作用而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。公衍玲等[7]研究了鹽地堿蓬中成分的抗氧化、降糖及降脂活性;郝海燕等[8]對(duì)硬枝堿蓬的成分定性并測(cè)定生物堿含量。

目前生物堿的提取方法有很多,溶劑提取法因成本低、操作簡(jiǎn)單而較為常用[9]。梁艷妮等[10]采用響應(yīng)面法優(yōu)選馬齒莧中總生物堿的溶劑提取條件,陳效威等[11]對(duì)止瀉木種子中總生物堿的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。國(guó)內(nèi)外對(duì)堿蓬已有諸多報(bào)道,付建鑫等[12]、李煦等[3]闡明了堿蓬中含有的蛋白質(zhì)、黃酮、植物鹽及多糖等成分,并研究了其具有的抑菌抗炎、調(diào)控血脂、調(diào)節(jié)糖代謝等功效,但有關(guān)堿蓬根生物堿的文獻(xiàn)還較少。

本文以乙醇為溶劑提取堿蓬根總生物堿,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)選最佳提取工藝,并對(duì)堿蓬根總生物堿的抑菌作用進(jìn)行初步研究,以便更好地開(kāi)發(fā)利用堿蓬資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿蓬 2019年5月中旬采自遼寧錦州市周邊沿海地區(qū),經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)郭斌教授鑒定為藜科堿蓬屬堿蓬,洗凈后取其根,陰涼處自然風(fēng)干,粉碎,堿蓬根粉末保存?zhèn)溆?95%乙醇、石油醚(沸點(diǎn)30～80 ℃)、二氯甲烷 天津永晟精細(xì)化工有限公司;氫氧化鈉(NaOH)等其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli) 均為本校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;BP211D型電子分析天平 德國(guó)Sartorious公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;恒溫油水浴鍋 上海騰方儀器設(shè)備有限公司;生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司;LDZM立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械;SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿蓬根總生物堿的提取 準(zhǔn)確稱取堿蓬根粉末10.0 g,按一定料液比加入一定濃度的乙醇,在一定溫度下提取一定時(shí)間,且提取2次,合并提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏,浸膏中加入5%鹽酸溶液,調(diào)節(jié)pH3～4,過(guò)濾,濾液與石油醚以料液比1∶2除脂[13],取水相并用5% NaOH調(diào)節(jié)pH11～12,轉(zhuǎn)入分液漏斗,等體積二氯甲烷萃取3次,每次30 min,合并萃取液,減壓回收二氯甲烷,得總生物堿提取物,烘干后稱量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取堿蓬根粉末10.0 g,以堿蓬根總生物堿得率為指標(biāo),考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、乙醇濃度(55%、65%、75%、85%、95%)、提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)和提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)四個(gè)因素對(duì)堿蓬根總生物堿得率的影響,其中固定因素為:料液比1∶25 g/mL、乙醇濃度95%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.0 h,每組設(shè)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),取平均值。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇對(duì)堿蓬根總生物堿得率有顯著影響的因素料液比(A),乙醇濃度(B),提取溫度(C)和提取時(shí)間(D),進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),優(yōu)化總生物堿的提取工藝。各因素水平如表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels ofthe response surface design

1.2.4 堿蓬根總生物堿得率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]。

總生物堿得率(%)=提取的堿蓬根總生物堿質(zhì)量/堿蓬根粉末質(zhì)量×100

1.2.5 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 培養(yǎng)基的配制 LB固體培養(yǎng)基:酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0 g,瓊脂粉20.0 g,NaCl 5.0 g,加水至1000 mL,121 ℃滅菌20 min;LB液體培養(yǎng)基:酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 10.0 g,加水至1000 mL,121 ℃滅菌20 min。

1.2.5.2 菌懸液的制備 將各供試菌種接種于無(wú)菌平板上,37 ℃、24 h培養(yǎng)后,獲得活化的新菌種。接種環(huán)挑取少許典型菌落接種于液體培養(yǎng)基中,經(jīng)37 ℃、24 h培養(yǎng)后,無(wú)菌生理鹽水稀釋成含菌1×106～1×107CFU/mL的菌懸液備用[15]。

1.2.5.3 抑菌效果的檢測(cè) 采用管碟法[16],無(wú)菌條件下向已滅菌的培養(yǎng)皿中加入20 mL培養(yǎng)基,凝固后,移液槍移取各供試菌懸液100 μL滴加到培養(yǎng)基上,均勻涂布。將預(yù)先滅菌的牛津杯放于含菌培養(yǎng)皿中,分別加入240 μL的藥液(濃度為0.2、0.4、0.8 mg/mL),以無(wú)菌水為對(duì)照,37 ℃下培養(yǎng)24 h。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)并記錄抑菌圈直徑。

1.2.5.4 最低抑菌濃度(MIC) 采用兩倍稀釋法[17],將堿蓬根生物堿分別稀釋為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL,移取生物堿稀釋液約1 mL于已滅菌試管并加入1 mL液體培養(yǎng)基和100 μL菌懸液,對(duì)照組只加入1 mL液體培養(yǎng)基1 mL無(wú)菌水和100 μL菌懸液,37 ℃下培養(yǎng)24 h。觀察試管的混濁程度,以試管澄清完全沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最低生物堿稀釋濃度為菌的最低抑菌濃度(MIC)[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以O(shè)rigin 8.5軟件作圖,采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)總生物堿得率的影響 由圖1知,堿蓬根總生物堿得率隨著料液比的不斷增大呈先大幅度增加后逐漸減少的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶25 g/mL時(shí),總生物堿得率達(dá)到最大值;料液比繼續(xù)增大,總生物堿得率降低。可能是因?yàn)橐欢ǚ秶鷥?nèi)料液比的增大利于提取溶劑與浸提物的接觸,能提高得率,用量過(guò)多反不利于總生物堿的溶出,降低得率[19]。料液比1∶25 g/mL較為合適。

圖1 料液比對(duì)總生物堿得率的影響Fig.1 Effect of material liquid ratioon extraction yield of total alkaloids

2.1.2 乙醇濃度對(duì)總生物堿得率的影響 由圖2可得出,隨乙醇濃度的提高,總生物堿得率也在不斷增加,乙醇濃度為85%時(shí),總生物堿得率最高;乙醇濃度大于85%后總生物堿得率下降。是由于乙醇濃度的提高,脂溶性成分溶出,這些成分可能同乙醇-水分子結(jié)合,從而與堿蓬根生物堿形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,導(dǎo)致總生物堿的得率降低[20]。因此選擇乙醇濃度為85%。

圖2 乙醇濃度對(duì)總生物堿得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentrationon extraction yield of total alkaloids

2.1.3 提取溫度對(duì)總生物堿得率的影響 由圖3可看出,在一定溫度范圍內(nèi),總生物堿得率會(huì)隨溫度的上升而增高,溫度的提升有利于加快活性成分的溶解及溶劑的滲透,所以提取效果較好;當(dāng)溫度超過(guò)80 ℃時(shí)得率反而下降,可能是溫度過(guò)高使生物堿結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[21]。故提取溫度為80 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)總生物堿得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperatureon extraction yield of total alkaloids

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)總生物堿得率的影響 由圖4可知,在0.5～2.0 h范圍內(nèi),堿蓬根總生物堿得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷提升,可能是由于提取時(shí)間的延長(zhǎng)使原料藥與溶劑完全混合[22];2.0 h后隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),提取率沒(méi)有太大的變化。從資源節(jié)約上考慮,提取時(shí)間選擇2.0 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總生物堿得率的影響Fig.4 Effect of extraction timeon extraction yield of total alkaloids

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件建立四因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn),形成以料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取溫度(C)及提取時(shí)間(D)為自變量,以堿蓬根總生物堿得率為響應(yīng)值的29個(gè)實(shí)驗(yàn)方案,進(jìn)行響應(yīng)面分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。回歸分析見(jiàn)表3。

表3 回歸方程模型及方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 RSM design scheme and results

可得回歸方程:Y=0.52-0.00625A+0.004417B-0.016C+0.010D+0.015AB-0.004AC+0.0045AD-0.012BC-0.00253BD-0.013CD-0.027A2-0.052B2-0.050C2-0.034D2

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 為了考察各因素對(duì)總生物堿得率的交互影響,利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析得到圖5和圖6。圖5中,料液比和乙醇濃度的等高線呈橢圓形表明兩者對(duì)總生物堿的交互作用顯著,料液比和乙醇濃度的響應(yīng)曲面坡度陡峭說(shuō)明兩者對(duì)總生物堿得率有明顯的影響。由圖6可知,總生物堿得率隨提取溫度和提取時(shí)間的增加先上升后下降,提取溫度的陡峭程度大于提取時(shí)間,說(shuō)明提取溫度的影響大于提取時(shí)間;提取溫度與提取時(shí)間交互作用的曲面陡峭,等高線橢圓形,表明它們的交互作用顯著,對(duì)總生物堿得率的影響具有顯著性。

圖5 料液比和乙醇濃度的交互影響Fig.5 Interaction between the material liquid ratio and the ethanol concentration

圖6 提取溫度和提取時(shí)間的交互影響Fig.6 Interaction between the extraction temperature and the extraction time

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件分析,得出最佳提取條件:料液比1∶24.626 g/mL,乙醇濃度85.478%,提取溫度78.195 ℃,提取時(shí)間2.088 h,此條件下總生物堿得率為0.520%。結(jié)合實(shí)際情況,調(diào)整提取條件為:料液比1∶25 g/mL,乙醇濃度86%,提取溫度78 ℃,提取時(shí)間2.1 h。為進(jìn)一步確定響應(yīng)面法得到的工藝條件是否可行,現(xiàn)稱取堿蓬根粉末3份,每份10.0 g,按上述最佳提取工藝條件進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn),總生物堿得率平均值為0.521%±0.04%,該優(yōu)化工藝具有可行性。

2.3 抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 堿蓬根總生物堿抑菌效果 由表4可以看出,堿蓬根總生物堿對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有抑菌效果,且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性強(qiáng)于大腸桿菌,對(duì)枯草芽孢桿菌無(wú)抑菌效果。堿蓬根總生物堿濃度的不同對(duì)致病菌的抑菌性也不同,濃度升高,抑菌性增強(qiáng)。由此表明,堿蓬根總生物堿具有抑菌活性。

表4 堿蓬根總生物堿不同濃度的抑菌性Table 4 Antibacterial activity of total alkaloids from different concentrations of the roots of Suaeda salsa

2.3.2 堿蓬根總生物堿最低抑菌濃度(MIC) 由表5知,堿蓬根總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)均為0.4 mg/mL;堿蓬根總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果更強(qiáng)一些,對(duì)大腸桿菌的效果弱些。

表5 堿蓬根總生物堿的最低抑菌濃度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of total alkaloids from the roots of Suaeda salsa

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)有機(jī)溶劑提取法提取堿蓬根總生物堿,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,確定最優(yōu)工藝條件為料液比1∶25 g/mL,乙醇濃度86%,提取溫度78 ℃,提取時(shí)間2.1 h,此條件下堿蓬根總生物堿得率為0.521%±0.04%;實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)堿蓬根總生物堿對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性,其抑菌性由大到小為:金黃色葡萄球菌>大腸桿菌,對(duì)枯草芽孢桿菌無(wú)抑菌活性。從資源利用方面看,本實(shí)驗(yàn)為開(kāi)發(fā)和利用堿蓬及堿蓬根的潛在價(jià)值提供一定的參考依據(jù)。