紅曲米高產(chǎn)GABA工藝優(yōu)化和雙紅曲霉菌聯(lián)合發(fā)酵抑制膳食相關(guān)酶活條件優(yōu)化

趙永霞,岳倩倩,秦江輝,謝 健,周禮紅,*,趙 毅,李玉婷

(1.茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系,貴州仁懷 564500;2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025;3.遵義醫(yī)科大學(xué)遺傳教研室,貴州遵義 563000)

隨著生活水平的提高,肥胖已經(jīng)成為全球性的問題,由于肥胖會(huì)引起許多疾病,比如高脂血癥[1]、動(dòng)脈粥樣硬化[2]、心血管疾病等也會(huì)提高其發(fā)病率和死亡率,因此,治療肥胖勢(shì)在必行。而治療肥胖無非減少食物攝入、改變代謝和增加排泄[3]這三種方式,所以和膳食相關(guān)的酶類,如脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶,便成為了抑制能量攝入的關(guān)鍵控制點(diǎn),如果膳食相關(guān)酶類的作用被抑制,那么肥胖也就變的可控。

紅曲霉(Monascussp.)是中國(guó)傳統(tǒng)的食藥兩用真菌,由它制作的紅曲米(Red Yeast Rice)歷史悠久,紅曲米的代謝產(chǎn)物眾多,有色素(黃色素、橙色素和紅色素)[4]、Monacolin K 和GABA(γ-aminobutyric acid)[5]、Dimerumic Acid[6],其中黃色素能夠預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝[7],改善糖尿病胰腺損傷和高血糖、抗氧化和抗炎[8]、降低總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平[9]。紅曲色素的氨基酸衍生物使高脂肪飲食小鼠的體重、腹腔脂肪組織、膽固醇及甘油三酯的水平均顯著下降,在抗肥胖和減肥應(yīng)用上潛力無限[10]。洛伐他汀(Monacolin K)是膽固醇合成限速酶(HMG-CoA還原酶)的顯著抑制劑,用于治療高膽固醇血癥和高脂血癥[11],只要3 mg的劑量就可以降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平[12]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種獨(dú)特的四碳非蛋白氨基酸,抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)、調(diào)節(jié)心律失常、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞等生理功能[13-14],可以治療癲癇和高血壓[15]。在1979年日本的Endo第一次發(fā)現(xiàn)紅曲霉合成的一種特殊物質(zhì)GABA具有降壓活性[16]。因此研究γ-氨基丁酸生產(chǎn)紅曲的篩選和培養(yǎng)基的優(yōu)化和發(fā)酵條件的優(yōu)化具有深遠(yuǎn)意義。

課題組通過初期的篩選得出MA-25高產(chǎn)GABA菌株,MP-19高產(chǎn)色素并且具有降脂效應(yīng)的菌株,進(jìn)行PB和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),旨在提高M(jìn)A-25的GABA的產(chǎn)量,據(jù)報(bào)道氨基酸的添加和種類對(duì)色素的特性和結(jié)構(gòu)[17-18]和光穩(wěn)定性[19]有顯著的影響,并且色素-氨基酸衍生物能夠?qū)ι攀诚嚓P(guān)酶起到顯著抑制作用[20]。因此添加不同的氨基酸,并通過共發(fā)酵和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提升MA-25和MP-19菌株共發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物對(duì)膳食相關(guān)酶的抑制作用,從而反映紅曲霉的降脂效應(yīng)，對(duì)肥胖預(yù)防和治療提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株MonascusankaMA-25、菌株MonascuspurpureusMP-19 貴州大學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室分離保藏;牛肉膏、蛋白胨 生物制劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;14種氨基酸、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶 分析純,北京索萊寶科技有限公司;GABA 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PD) 馬鈴薯200 g,煮沸20～30 min,過濾取濾液,葡萄糖20 g,補(bǔ)足水1000 mL,pH自然,121 ℃滅菌30 min;改良沙氏培養(yǎng)基 麥芽糖5 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g,水1000 mL,pH自然,121 ℃滅菌30 min;基礎(chǔ)培養(yǎng)基 粳米20 g,按照米∶水=5∶4的比例添加水后分裝到100 mL小三角瓶中121 ℃滅菌30 min。

SW-CJ-1F標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DH-360A電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司;TD6M低速離心機(jī) 江蘇金壇市億通科學(xué)儀器廠;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備 將紅曲霉菌種(MA-25,MP-19)分別接種于裝有改良沙氏培養(yǎng)基的茄子瓶中,30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,用無菌水洗下孢子,轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的無菌三角瓶中,振蕩,充分打散孢子,經(jīng)孢子計(jì)數(shù),制成終濃度為1×106CFU·mL-1的均一孢子懸液。按照10%(V/V)將孢子懸液接種于裝有30 mL PD液體培養(yǎng)基中,30 ℃ 150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h即分別得到MA-25和MP-19種子液。

1.2.2 紅曲霉的培養(yǎng) 以15%(V/V)的接種量將種子液轉(zhuǎn)接裝有20 g基礎(chǔ)培養(yǎng)基的100 mL的三角瓶,待大部分飯粒可見到菌絲時(shí),每天扣瓶一次使之吸附瓶壁上的冷凝水,30 ℃恒溫、靜止培養(yǎng)9 d,得到紅曲米。

1.2.3 GABA的提取 將發(fā)酵的紅曲米放置于50 ℃烘箱烘干、粉碎,過80目篩,準(zhǔn)確稱取2 g樣品置于帶蓋離心管,加20 mL蒸餾水,搖勻后超聲提取(功率300 W，頻率20 kHz,時(shí)間30 min),使用離心機(jī)5000 r/min下離心15 min,取上清液1.0 mL,待測(cè)。

1.2.4 GABA含量的測(cè)定—Berthelot比色法 首先配制GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液,利用Berthelot反應(yīng)對(duì)GABA進(jìn)行發(fā)色,在550～750 nm進(jìn)行掃描,結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)在640 nm處。所以在波長(zhǎng)640 nm測(cè)定其吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并建立回歸方程:y=1.804x+0.096,R2=0.997。取待測(cè)樣品0.5 mL,加0.5 mL硼酸緩沖液(0.2 mol/L、pH10),搖勻;加入1 mL 6%苯酚溶液,搖勻;加入1 mL次氯酸鈉溶液(活性氯為8%～12%),搖勻;放入沸水浴加熱10 min,顏色變成藍(lán)綠色后冰浴20 min,加入60%乙醇溶液2.0 mL,測(cè)定吸光度值,并計(jì)算GABA含量[21]。

1.2.5 不同氨基酸降脂色素抑制α-淀粉酶的作用 接種15%(V/V)紅曲霉種子液的產(chǎn)色素培養(yǎng)基于30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后將L-Tyr、L-Pro、L-Phe、L-Asp、L-Ala、L-Gly、L-His、L-Ile、L-Arg、L-Cys、L-Leu、L-Val、L-Trp、L-Ser這14種氨基酸以1%的量添加到發(fā)酵液中,30 ℃、150 r/min培養(yǎng)8 d,將發(fā)酵液和菌絲體一起研磨,75%乙醇浸提30 min、過濾,收集濾液即得色素粗提物,測(cè)定色素對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

1.2.6 酶活抑制率的測(cè)定

1.2.6.1 a-淀粉酶抑制率測(cè)定方法 取600 μL 1%α-淀粉酶(pH6.9)磷酸緩沖液,與100 μL色素粗提物混勻，于37 ℃孵育15 min;加入400 μL pH6.9,1%的淀粉磷酸溶液,37 ℃孵育15 min;加入2 mL DNS,100 ℃保持15 min;注入10 mL 0 ℃的蒸餾水,在540 nm下測(cè)定吸光值確定α-淀粉酶的活性[20]。α-淀粉酶活力單位定義:在37 ℃、pH6.9條件下,30 min內(nèi)水解淀粉釋放1 μmol還原糖所需的酶量。

1.2.6.2 蛋白酶抑制率測(cè)定方法 把100 μL色素粗提物與1%、900 μL 的胰蛋白酶Tris緩沖液(pH7.5)中,37 ℃保持15 min;加入1 mL 0.2%的酪蛋白溶液,37 ℃孵育15 min;蛋白酶活力取決于蛋白酶濃度,通過Folin酚法測(cè)定[20]。胰蛋白酶活力單位定義:在37 ℃、pH7.5條件下,30 min內(nèi)水解酪蛋白釋放l μmol蛋白質(zhì)所需的酶量。

1.2.6.3 脂肪酶抑制率測(cè)定方法 對(duì)硝基苯丁酸(p-NPB)為底物,將30 μL脂肪酶液(10 mol/L M3-嗎啉丙磺酸和1 mmol/L EDTA,pH6.8)加入到850 mL的Tris緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl和5 mmol/L CaCl2,pH7.0)中;取100 μL色素粗提物注入到裝有880 μL酶緩沖液中，于37 ℃孵育15 min;再往其中加入20 μL的底物溶液(10 mmol/L溶于N,N-二甲基乙酰胺的丁酸對(duì)硝基苯溶液)然后在37 ℃下進(jìn)行15 min的酶促反應(yīng)。用分光度計(jì)在400 nm處對(duì)硝基苯酚的水解反應(yīng)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)[20]。每個(gè)脂肪酶活力單位定義:在37 ℃,pH6.8條件下,30 min內(nèi)水解丁酸對(duì)硝基苯釋放l μmol對(duì)硝基酚所需的酶量。

以上三種酶活抑制率定義:加入酶抑制劑前后的酶活的差值與原酶活之比值。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn)方法

1.2.7.1 碳源對(duì)GABA產(chǎn)量的影響 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì),MA-25種子液按照10%的接種量接種,于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,分別選擇葡萄糖、葡萄糖+麥芽糖(1∶1)、麥芽糖、碳酸氫銨、蔗糖為碳源,添加量為1%的加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中篩選促進(jìn)GABA合成的碳源。

1.2.7.2 氮源對(duì)GABA產(chǎn)量的影響 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì),MA-25種子液按照10%的接種量接種,于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,按照1%的添加量分別加入蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、硫酸銨、硝酸銨、尿素為唯一的氮源,篩選有利于GABA合成的氮源。

1.2.7.3 初始pH對(duì)GABA產(chǎn)量的影響 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì),調(diào)整滅菌前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH,以4.0為初始pH,1.0一個(gè)梯度,逐漸增加至8.0配制,種子液按照10%的接種量接種,于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,考察GABA的產(chǎn)量。

1.2.7.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GABA產(chǎn)量的影響 將MA-25種子液以10%的接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基,30 ℃,分別培養(yǎng)5、6、7、8、9、10、11 d,篩選最適合GABA積累的培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.7.5 培養(yǎng)溫度對(duì)GABA產(chǎn)量的影響 將MA-25種子液以10%的接種量接種在基礎(chǔ)培養(yǎng)中,選擇20、25、30、35 ℃四個(gè)不同的溫度下培養(yǎng)7 d,篩選出有利于GABA合成的最適溫度。

1.2.8 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的PB設(shè)計(jì),對(duì)初始pH(X1)、(葡萄糖+麥芽糖)(X2)、硫酸銨(X3)、谷氨酸(X4)、NaH2PO4(X5)、培養(yǎng)溫度(X6)、接種量(X7)、MgSO4(X8)8個(gè)因素進(jìn)行考察,每個(gè)因素分別取高、低兩個(gè)水平,高水平是低水平的1.5倍,響應(yīng)值為每毫克紅曲米中GABA的含量(Y)。

1.2.9 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,進(jìn)一步進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)來確定中心組合實(shí)驗(yàn)因素與水平,三因素的水平見表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Design Expert 軟件經(jīng)多項(xiàng)式回歸分析,并對(duì)擬合方程做顯著性檢驗(yàn),其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F檢驗(yàn)確定。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels for response surface experiment

1.2.10 MA-25和MP-19共發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為提高發(fā)酵效率,將篩選得到的MA-25和MP-19菌株進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵,將MA-25和MP-19種子液分別按照10%接種。依據(jù)對(duì)MA-25的單因素、Box-Behnken和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出谷氨酸、葡萄糖+麥芽糖和初始pH對(duì)GABA的產(chǎn)量影響最大,結(jié)合對(duì)MP-19的氨基酸單因素實(shí)驗(yàn),篩選出L-Trp為最佳氨基酸,所以選擇L-Trp、初始pH、葡萄糖+麥芽糖、谷氨酸四個(gè)因素,進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)(表2),以GABA和對(duì)α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶抑制率為指標(biāo)進(jìn)行正交優(yōu)化。

表2 MA-25與MP-19聯(lián)合發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 Design of orthogonal experiment on theco-fermentation of MA-25 and MP-19

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

使用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用軟件Design-Expert.8.0.6,數(shù)據(jù)分析處理軟件SPSS Statistics 17.0,繪圖軟件Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適碳源、氮源、pH和培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間的選擇

由圖1可知,葡萄糖+麥芽糖作為碳源時(shí)發(fā)酵液中GABA含量最高,為5.067 mg·g-1,顯著高于其它碳源(P<0.05),表明葡萄糖+麥芽糖是最適碳源。

如圖1,結(jié)果顯示硫酸銨作為氮源時(shí)發(fā)酵液中GABA含量最高,產(chǎn)量為4.341 mg·g-1,表明硫酸銨為最適氮源。

圖1 不同碳源和氮源條件下GABA的含量Fig.1 The content of GABA for differentcarbon source and nitrogen source注:圖中不同字母代表差異性顯著(P<0.05)圖2、圖4同。

如圖2所示,篩選結(jié)果顯示pH6條件下,GABA的含量為4.165 mg·g-1,且顯著高于其它酸堿度(P<0.05),則pH6為最適pH。

由圖2可知,結(jié)果顯示在培養(yǎng)9 d時(shí),GABA含量達(dá)到最大值(5.155 mg·g-1),之后趨于穩(wěn)定,培養(yǎng)9、10、11 d之間差異不顯著(P>0.05)，故選擇9 d作為發(fā)酵終點(diǎn)。

圖2中GABA含量隨著培養(yǎng)溫度的升高而增大,當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)GABA含量最高(5.157 mg·g-1),因此GABA合成的最適溫度為30 ℃。

圖2 不同pH條件、不同培養(yǎng)時(shí)間及不同培養(yǎng)溫度下GABA的含量Fig.2 The content of GABA for different pH,different culture time and different temperature

2.2 Plackett-Burman篩選影響GABA合成的重要因素

在單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)培養(yǎng)條件的8個(gè)因素進(jìn)行PB重要性篩選,3個(gè)虛擬因素,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表3所示。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experiment

利用Design Expert軟件對(duì)8個(gè)因素的主效應(yīng)進(jìn)行分析(表4),谷氨酸(X1)、葡萄糖+麥芽糖(X2)、初始pH(X4)、培養(yǎng)溫度(X6)、硫酸銨(X3)這5種因素的P值均小于0. 05,表明這 5種因素對(duì)產(chǎn)GABA的影響顯著。另外模型的P為0.0142,方差分析的可信度R2=98.29,證明該模型顯著性極高,可對(duì)本研究模擬進(jìn)行較好地解釋。在做響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,選擇影響度較大的三個(gè)因素進(jìn)一步做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及效應(yīng)Table 4 Levels and factors and effects in Plackett-Burman

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分接近真實(shí)情形,對(duì)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的前3種極顯著性實(shí)驗(yàn)因素(谷氨酸、葡萄糖+麥芽糖、初始pH)進(jìn)行爬坡實(shí)驗(yàn),使其濃度盡量靠近最佳水平值區(qū)域,最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?法線方向),由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)可知,在MA-25號(hào)菌株生產(chǎn)GABA的發(fā)酵中,根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們變化方向及步長(zhǎng)。結(jié)果顯示(表5),第四組實(shí)驗(yàn)的GABA含量達(dá)到最高,繼而產(chǎn)量下降,所以以第4組的條件作為下一步響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn),即谷氨酸1.25%,葡萄糖+麥芽糖1.0%,初始pH6.0,并根據(jù)此結(jié)果,確定響應(yīng)面試驗(yàn)中3因素和3水平。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 5 Design and results of steepest climbing test

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化(表6)。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 6 Experiment design and result of Box-Behnken

2.4.1 模型方程的建立與方差分析 運(yùn)用構(gòu)建好的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠磉M(jìn)行分析。對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行二階回歸擬合,得到回歸方程為

式中:Y為GABA含量(mg·g-1);X1、X2、X3分別代表谷氨酸、葡萄糖+麥芽糖和pH。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析Table 7 Result and variance analysis of Box-Behnken design

2.4.2 響應(yīng)面分析 為了考察因素交互項(xiàng)對(duì)GABA產(chǎn)量的影響,在其他因素條件不變的情況下,考察交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響,對(duì)模型進(jìn)行降維分析,經(jīng)Design-Expert V 8.0.6軟件分析所得的響應(yīng)面(圖3)。

圖3 響應(yīng)面法立體分析及等高線圖Fig.3 Three dimensional analysis and contour line of response surface method

2.5 最佳工藝確定

通過Design-Expert 8.0.6 Optimization計(jì)算出最佳GABA合成的培養(yǎng)條件,培養(yǎng)條件是谷氨酸1.18%,葡萄糖+麥芽糖是1.16%,pH為6.08,最終預(yù)測(cè)GABA產(chǎn)量為5.62 mg·g-1。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)值(5.608±0.11) mg·g-1,接近理論GABA產(chǎn)量,說明響應(yīng)面法建立的紅曲霉產(chǎn)GABA數(shù)學(xué)模型具有穩(wěn)定可靠性,試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好。

相比于化學(xué)合成的GABA,生物生成的GABA具有更安全健康的優(yōu)勢(shì),而在生物合成GABA過程中,發(fā)酵因子pH、溫度、時(shí)間以及培養(yǎng)基添加物都是優(yōu)化GABA產(chǎn)量的重要因素。通過單因素實(shí)驗(yàn),PB復(fù)合實(shí)驗(yàn)以及BB響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選出對(duì)GABA產(chǎn)量影響較大的因素和水平,提升了紅曲米產(chǎn)GABA的得率為5.608 mg·g-1,提升了20.58%,劉棟等[22]添加青稞發(fā)酵紅曲霉GABA的產(chǎn)量24.62 mg/100 g。一種從變質(zhì)的石榴中分離出來的血色紅曲霉(Monascussanguineus)通過PB實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化GABA得率為15.31 mg/g,并且是以椰子油蛋糕為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵[23],可見菌株不同和基質(zhì)不同對(duì)GABA的產(chǎn)量影響之大。Jiang等[24]分離篩選出一株高產(chǎn)GABA的菌株(3.657 g/L),經(jīng)過誘變,優(yōu)化,大批量發(fā)酵,GABA的產(chǎn)量可以達(dá)到13.470 g/L。提高GABA的產(chǎn)量在醫(yī)學(xué)方面非常有意義,Wang等[11]發(fā)現(xiàn),富含GABA的紅曲米在雙盲臨床試驗(yàn)中具有穩(wěn)定促使TG水平下降趨勢(shì),數(shù)據(jù)差異不顯著或許是因?yàn)闃颖緮?shù)量的局限,GABA結(jié)合紅曲霉其它有利代謝產(chǎn)物,為人體保健提供科學(xué)支撐。

注:**表示差異極顯著,P<0.01;* 表示差異顯著,P<0.05;-表示差異不顯著,P>0.05。

2.6 GM-19產(chǎn)降脂色素的最適氨基酸選擇

氨基酸-色素衍生物對(duì)消化相關(guān)酶類有抑制作用,有良好的抗肥胖作用[10]。以產(chǎn)色素培養(yǎng)基為基質(zhì),添加1%的L-Tyr、L-Phe、L-Gly、L-Ile、L-Arg、L-Leu、L-Trp 7種蛋白質(zhì)氨基酸經(jīng)培養(yǎng)、初步提取,測(cè)定抑制α-淀粉酶率,表8中添加L-Trp后提取物對(duì)α-淀粉酶抑制率達(dá)到59.3%,顯著高于其它氨基酸,L-Trp為GM-19產(chǎn)色素促進(jìn)降血脂的最佳補(bǔ)充氨基酸。課題組添加L-Pro、L-Asp、L-Ala、L-His、L-Cys、L-Ser L-Val 7種氨基酸后其代謝產(chǎn)物沒有體現(xiàn)出抑制α-淀粉酶活性,證實(shí)采用蛋白質(zhì)氨基酸替換非天然氨基酸[20]也可以促進(jìn)紅曲色素對(duì)消化酶類的抑制。

表8 不同氨基酸條件下色素對(duì)α-淀粉酶的抑制率Table 8 Inhibition rate of pigment on α-amylase for different amino acids

2.7 MA-25與MP-19共發(fā)酵工藝優(yōu)化

通過菌株共發(fā)酵促進(jìn)有利代謝產(chǎn)物積累是有效又經(jīng)濟(jì)的方法[25]。將篩選得到的MA-25與MP-19菌株進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所確定的氮源、碳源,對(duì)培養(yǎng)基的整體組成進(jìn)行優(yōu)化。四因素三水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(表9),直觀分析K值可以看出,對(duì)于GABA產(chǎn)量而言,四個(gè)因素的二水平A2B2C2D2,即初始pH6.0,葡萄糖+麥芽糖1.0%,谷氨酸1.25%,色氨酸1.25%為最佳;對(duì)α-淀粉酶的抑制率而言,A因素和B因素的二水平和C因素D因素的三水平A2B2C3D3,即初始pH6.0,葡萄糖+麥芽糖1.0%,谷氨酸1.50%,色氨酸1.50%為最佳;對(duì)蛋白酶抑制率而言,A因素D因素的二水平和B因素C因素的三水平A2B3C3D2,初始pH6.0,葡萄糖+麥芽糖1.50%,谷氨酸1.50%,色氨酸1.25%即為最佳;對(duì)脂肪酶抑制率而言,A因素C因素的三水平和B因素D因素一水平A3B1C3D1,即初始pH6.5,葡萄糖+麥芽糖0.5%,谷氨酸1.5%,色氨酸1.0%為最佳。通過方差分析主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)合極差R可以看出,對(duì)GABA產(chǎn)量的影響顯著性D>B>A>C,對(duì)α-淀粉酶抑制率影響顯著性C>A>B>D,對(duì)蛋白酶抑制率影響顯著性A>C>B>D,對(duì)脂肪霉抑制率影響顯著性B>C>A>D。因此,對(duì)GABA產(chǎn)量而言,最佳組合是A2B2C2D2;對(duì)α-淀粉酶抑制率而言,最佳組合為A2B2C3D3;對(duì)蛋白酶抑制率而言,最佳組合是A2B3C3D2;對(duì)脂肪酶而言,最佳組合是A3B1C3D1。

表9 MA-25與MP-19聯(lián)合發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 9 The results of orthogonal experiment on the co-fermentation of MA-25 and MP-19

2.8 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳組合,30 ℃培養(yǎng)8 d,結(jié)果顯示(表10),A2B2C2D2組合下GABA產(chǎn)量為(5.616±0.004) mg·g-1;A2B2C3D3組合下α-淀粉酶抑制率為61.33%±0.104%;A2B3C3D2組合下,蛋白酶抑制率為29.93%±0.025%;A3B1C3D1組合下,脂肪酶抑制率為29.67%±0.038%。

表10 MA-25與MP-19聯(lián)合發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 10 The verified results of orthogonal experiment on the co-fermentation of MA-25 and MP-19

考慮到降脂能力的最大化,結(jié)合單因素等實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:最佳組合應(yīng)為粳米20%,硫酸銨1.0%,初始pH為6.5,葡萄糖+麥芽糖為0.50%,谷氨酸為1.50%,色氨酸為1.00%,NaH2PO41.00%,水57.0%,GABA產(chǎn)量為(5.400±0.02) mg·g-1,α-淀粉酶抑制率為57.15%±0.047%,蛋白酶抑制率為28.14%±0.062%,脂肪酶抑制率為29.67%±0.038%。

α-淀粉酶是一種用于分解淀粉和多糖的酶,抑制淀粉酶的酶活能控制膳食中碳水化合物的吸收,進(jìn)而降低膳食后血糖濃度,蛋白酶和脂肪酶也是同理,紅曲霉能夠產(chǎn)生許多有利于人體健康的代謝產(chǎn)物,紅曲色素及色素衍生物具有良好的脂肪酶抑制活性[26],Fang 等[27]也報(bào)道從紅曲霉發(fā)酵液中分離出三種胰脂肪酶抑制劑,分別是紅曲素(Monascin)、Monasfluore B和紅曲黃素(Ankaflavin),能夠降低脂肪酶的活性,抑制脂肪的吸收與貯存,自然可以對(duì)抗肥胖等疾病,所以除了Monacolin K,紅曲霉的代謝產(chǎn)物中還有許多小分子起著降血脂降血壓的作用,Yeap等[28]就證實(shí)了在沒有Monacolin K、低GABA、高氨基酸情況下,紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物依舊有降膽固醇的功效。更證實(shí)了紅曲霉代謝產(chǎn)物復(fù)雜,許多的小分子等待研究者們探尋,基于對(duì)膳食酶類的抑制作用以及GABA 的產(chǎn)量的提升,可作為潛在的抗肥胖功能食品添加劑,也可用于多種抗肥胖功能食品的研發(fā)。

3 結(jié)論

本文以提升GABA的產(chǎn)量和α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪霉的抑制效應(yīng)為目的,設(shè)計(jì)了單因素實(shí)驗(yàn)、PB實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn),BB響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),提高M(jìn)A-25的GABA產(chǎn)量,以培養(yǎng)條件為pH為6.08,培養(yǎng)基配比為:谷氨酸1.18%,麥芽糖是1.16%,最高產(chǎn)量達(dá)(5.608±0.11) mg·g-1,比優(yōu)化前的(4.651±0.03) mg·g-1提高了20.58%,與最終預(yù)測(cè)GABA產(chǎn)量為5.62 mg·g-1非常接近,說明響應(yīng)面法建立的紅曲霉產(chǎn)GABA數(shù)學(xué)模型具有穩(wěn)定可靠性。基于色素氨基酸衍生物是消化酶類的抑制劑原理,篩選出L-Trp-色素衍生物具有高效α-淀粉酶抑制作用,通過MA-25和MP-19聯(lián)合發(fā)酵的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選出了最佳產(chǎn)GABA和最高效抑制三種酶活的發(fā)酵條件,考慮到降脂能力的最大化,結(jié)合單因素等實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:最佳組合應(yīng)為粳米20%,硫酸銨1.0%,初始pH為6.5,葡萄糖+麥芽糖為0.50%,谷氨酸為1.50%,色氨酸為1.00%,NaH2PO41.00%,水57.0%,GABA產(chǎn)量為(5.400±0.02) mg·g-1,α-淀粉酶抑制率為57.15%±0.047%,蛋白酶抑制率為28.14%±0.062%,脂肪酶抑制率為29.67%±0.038%。

多年來對(duì)紅曲霉的研究大多數(shù)都集中在洛伐他汀的研究,而忽略了其它的有益代謝產(chǎn)物,GABA作為一種非蛋白質(zhì)氨基酸,具有很多生理功能,抑制神經(jīng)遞質(zhì)、抗癲癇、降壓等。GABA結(jié)合其代謝產(chǎn)物色素,具有減肥降脂,控制“三高”的功效。結(jié)果顯示色素氨基酸衍生物,具有良好α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的抑制作用,與Kim等[10]的研究成果一致,通過對(duì)膳食相關(guān)酶活的抑制降低其能量的吸收,從而有了實(shí)現(xiàn)控制肥胖的可能，為健康保健食品藥品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。紅曲霉有益人體代謝產(chǎn)物眾多,目前探究的還僅是冰山一角,本課題組將致力于紅曲霉小分子代謝產(chǎn)物的研究,為科學(xué)發(fā)展助力。