基于高通量測序技術分析東北豆醬的微生物多樣性

馬巖石,姜 明,李 慧,裴芳藝

(齊齊哈爾醫學院科研處,齊齊哈爾 161000)

我國制醬工藝歷史悠久,歷經多個朝代的發展,如今已經普及到了韓國、日本、印度尼西亞等東南亞國家和地區。豆醬是以大豆為主材料,通過發酵制備而成的一種具有獨特風味的食品以及調味品。東北作為我國大豆的主要產區,其大豆年產量占全國總產量的50%左右,豆醬的制作也是非常普遍的[1]。

目前東北豆醬主要采用大豆發酵的方式進行制作,制作過程中各種微生物作用賦予了豆醬獨特的風味,因此明確東北豆醬成品中的微生物組成是十分必要的[2]。目前國內對食品中微生物的研究在發酵過程中的風味物質檢測和重要微生物的鑒定方面已經比較普遍[3-6],Yu等[7]對傳統農家醬中細菌的生物胺含量進行了研究,發現組胺和酪胺與發酵時間呈顯著正相關。齊欣[8]通過測定朝鮮族大醬中異黃酮提取物(IEOKSP)對幾種癌細胞增殖的影響等試驗得出，朝鮮族大醬中主要抗癌成分隨著貯藏時間的延長,含量逐漸增多。

高通量測序如今越來越多的應用在農業、工業、食品、醫學等微生物多樣性的檢測中[9-12],谷靜思等[13]通過高通量測序的方法以及傳統分離培養方法對臭豆腐中的細菌的微生物群進行分析,最終得到了臭豆腐中微生物群落的分布信息。Ercolini[14]介紹了高通量測序技術用于研究食品微生物群的當前情景和未來前景,并描述了選擇最佳工作條件以滿足食品研究特定需求的決策過程。本研究采用高通量測序技術[15],以東北市場常見的5種豆醬成品為研究材料,選取比較適宜序列檢測的細菌16S rDNA V4區及真菌ITS1～2區[16-18]基因序列檢測其微生物群落結構,能夠更加全面、準確的了解其菌群結構,為進一步的豆醬的生產、保藏以及優勢菌種的利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5種豆醬FJ01、FJ02、CD01、CD02、CD03 均為發酵時間45 d的市售產品,分別來自東北地區5個不同的生產地點,FJ01產于遼寧營口,工業生產,FJ02產于黑龍江綏化,工業生產,CD01產于吉林通化,手工制作,CD02產于吉林白城,工業生產,CD03產于哈爾濱,手工制作;DNA Marker5000、DNA Marker2000 上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖 西班牙 Biowest Agarose;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒DP209 天根生化科技(北京)有限公司;gold view II型核酸染色劑 Solarbiao;提取液等配制試劑 上海潤捷化學試劑有限公司。

ZS-F6-20恒溫水浴鍋 山東桑澤儀器儀表有限公司;MixPlus渦旋振蕩器 合肥艾本森科學儀器有限公司;5415D高速離心機 德國eppendorf;超微量分光光度計 Thermo Nano Drop2000;DYCP-32A瓊脂糖水平電泳儀 北京六一儀器廠;T100 PCR儀、1708195 凝膠成像系統 美國Bio-rad。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆醬總DNA提取 根據Zhu等[19]提取DNA的方法,略有修改。取待測的5個豆醬樣品各0.5 g裝于2 mL EP管中,離心去上清液,在沉淀內加入0.75 mL提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl,pH9.0,40 mmol/L EDTA),0.15 mL 10% SDS和0.45 mL芐基氯,50 ℃水浴35 min,每5 min取出上下搖動若干次,以保證提取物與試劑充分接觸。水浴結束后,加入0.45 mL 3 mol/L NaOAc在冰上處理15 min。最后,10000 r/min離心10 min后,使用異丙醇沉淀DNA,梯度酒精洗滌晾干后用ddH2O溶解。分別用1%的瓊脂糖電泳和超微量分光光度計檢測DNA片段大小及濃度,并將其稀釋至適宜的濃度[20],-20 ℃保存待用。

1.2.2 PCR擴增 以提取的豆醬總DNA為模板,細菌16S rDNA基因的V3～V4區通用擴增引物341F和806R[21],真菌ITS區通用擴增引物ITS3F和ITS4R[22-23](表1)為引物,結合高秀芝等[24]和Siddiqui等[25]的PCR反應體系和程序進行PCR反應。

表1 PCR擴增引物信息表Table 1 Information of PCR amplification primer

PCR反應體系(50 μL):10×PCR Buffer 5 μL,2 mmol/L dNTP mix 4 μL,45 pmol前后引物各5 unit/μL,Taq DNA聚合酶0.2 μL,DNA模板10 ng/μL 1 μL,ddH2O加至50 μL。反應程序:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環;72 ℃終延伸7 min。

1.2.3 電泳檢測及測序 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物,并對目的片段進行膠回收,將樣品交由北京百邁客生物科技有限公司進行測序。

1.3 數據處理

原始測序序列使用Trimmomatic(v 0.32)軟件對各樣品序列做質控處理,利用軟件Usearch(V 7.0)去除非靶區域序列、嵌合體及短片段序列;利用FLASH軟件將測序得到的reads進行組裝。在97%相似度條件下,按照序列間的距離對序列進行聚類,得到用于物種分類的 OTU(Operational Taxonomic Unit)序列。利用MOUTHUR軟件進行OTU分布統計分析以及聚類比對的分類學分析。計算ACE/Chao/Shannon/Simpson/Coverage。利用RDP classifer(v 2.2)軟件將OTU序列與數據庫進行比對,獲得物種注釋,Excel 2007用以數據處理及分析統計作圖。

2 結果

2.1 豆醬總DNA提取結果

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測可知,5個樣品在大于5000 bp處均獲得目的條帶,且條帶清晰,說明豆醬總DNA提取成功,經超微量分光光度計檢測可知基因組DNA的濃度及純度OD260/OD280均在1.75～2.10的范圍內,證明DNA純度較好,沒有污染,可用于后續的PCR擴增。

2.2 測序序列長度與分布

通過高通量測序結果可知,本研究五份豆醬樣本中細菌(表2)共測得序列134115條,其中樣本細菌長度分布在460～469 bp之間,通過過濾篩除低質量序列[26],得到有效序列共131462條,長度分布在427～430 bp之間;五份豆醬樣本真菌(表3)共得到序列124301條,長度在332～350 bp范圍內,得到有效序列120336條,長度309～312 bp范圍內。

表2 細菌序列信息Table 2 Bacterial sequence information

表3 真菌序列信息Table 3 Fungus sequence information

2.3 樣品的OTU統計及分析

通過對序列結果隨機抽樣,統計序列數變化與OTU變化,從一個樣本測序得到的所有序列中隨機抽取序列(reads),統計每次抽取出來的序列有多少OUT(代表了有多少物種),最后以抽取的序列數目為橫坐標,相應的OUT數目為縱坐標,繪制曲線圖1,隨著序列數增大，幾個樣品的曲線逐漸接近平行,即更大的序列不會導致OUT數目的顯著性增長,證明以目前的數據進行分析是比較可靠的。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 Dilution curve of sample注:A:樣品中細菌OTU;B:樣品中真菌OUT。

采用OUT統計工具bioinformatics.psb.ugent.be-Venn,將幾個樣本的測序結果按照操作提示錄入工具中,然后分別對測序結果篩選出來的細菌真菌有效序列進行聚類,如圖2,樣品細菌在OTU聚類后共得到1732個OTU,其中有38個OTU是個樣品共有的,樣品FJ01特有333個OUT,FJ02特有193個OTU,CD01有117個,CD02有132個,CD03有190個。樣品真菌得到1040個OTU,共有OTU為18個。樣品FIJ01特有342個OTU,FJ02特有54個OTU,CD01有13個,CD02有41個,CD03有62個。

圖2 樣品OTU分布韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the sample OTUs distribution注:A:樣品中細菌OTU;B:樣品中真菌OUT。

2.4 群落多樣性分析

由表4可知,本研究5個樣品共得到細菌OUT 1732個,其中FJ01細菌樣品最多,達到535個。CD02細菌最少,有267個。真菌OUT 1040個,其中FJ01樣品最多,有515個。CD03真菌最少,僅111個。細菌總體數量和種類高于真菌,說明在豆醬成品當中,細菌占據微生物群落的主導地位。所有試驗樣品的OUT覆蓋率(Coverage)均大于99%,即表明本次試驗建立的文庫能夠較準確地反映出待測樣品的微生物多樣性情況。Chao、ACE指數用于計算菌群豐度(community richness),二者指數越大,說明群落豐富度越高的理論[27-28]。本試驗細菌的Chao和ACE指數均大于真菌,說明試驗樣品中的細菌群落豐富度大于真菌群落;Shannon、Simpson用于計算菌群多樣性(community diversity)指數,Shannon的值越大,說明群落多樣性越高,Simpson指數值越大,則說明其群落多樣性越低[29],因此結合表4中Simpson和Shannon指數,五種豆醬細菌多樣性水平應該是CD01最高,CD02次之,CD03高于FJ01,最低的是FJ02;真菌多樣性水平上,CD01遠高于其他幾個品種,這應該源于其生產方式,CD01屬于手工自制醬,對滅菌做得不如工業生產。

表4 豆醬微生物群落多樣性Table 4 Microbial community diversity in soy sause

2.5 群落組成

2.5.1 樣品微生物在門上的分布 通過對五個樣品的測序結果分析可知,樣品中共有17個細菌門被檢出,其種類豐富度較高,所占總序列數差異大,厚壁菌門(Firmicutes)和變形桿菌門(Proteobacteria)是主要的菌門。由圖3A可得,厚壁菌門(Firmicutes)在樣品FJ01、CD02、CD03中屬于優勢菌門,分別占總數的85%、79%、92%。變形桿菌門(Proteobacteria)是樣品FJ02和CD01中的優勢菌門,各占總數的79%和78%。除優勢菌門以外還發現有以放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主的其他菌門,但各自在樣品中的總占比均較低。

樣品在真菌中檢測出豐富的菌門有子囊菌門(Ascomycota),比較豐富的有擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota),以及其他菌門。從圖3B中可以看出,子囊菌門(Ascomycota)幾乎是所有樣品的優勢菌門,分別占總數的99%、98%、70%、98%、90%。樣品CD01中擔子菌門所占比例也達到了近20%。

圖3 樣品在門上的分布情況Fig.3 Distribution of samples at the phylum level注:A:樣品中細菌群落分布;B:樣品中真菌群落分布。

2.5.2 樣品微生物在屬上的分布 在屬的水平上,樣品共檢出39個細菌屬。如圖4A所示,樣品FJ01和樣品CD03中的優勢菌屬是葡萄球菌屬(Staphylococcus),占各自總數的69%和64%。腸桿菌屬(Enterobacter)在FJ01和CD03中也分別占到總數的19%和11%;在樣品CD01中,腸桿菌屬(Enterobacter)占到了總數的53%,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)占總數的20%,明串珠菌也達到了16%;FJ02中的優勢菌群為芽孢桿菌屬(Bacillus),其豐度達到了45%,色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)32%,葡萄球菌屬為7%;CD02中乳酸桿菌與腸桿菌屬分別占到了總數的22%和20%,腸球菌占到了30%;魏斯氏菌屬(Weissella)在除CD03以外中均有占到3%以上。腸桿菌、乳酸桿菌、色鹽桿菌為5個樣品共有細菌,各個樣品間微生物群落豐度差距很大,這可能與幾種材料產自不同地區有關。此外各樣品中相對豐度大于1%的還有雙歧桿菌(Bifidobacterium)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)。

樣品中共檢測出43個真菌屬,如圖4B所示各樣品間的優勢菌的種類和數量同樣差異顯著,曲霉屬、接合霉屬、赤霉屬、毛霉屬為5個樣品共有的真菌屬,但豐度上差異明顯。FJ01中的優勢真菌是接合酵母屬,序列豐度為70%,FJ02、CD01、CD02、CD03 中該菌屬的序列豐度分別為10%、18%、30%、11%,可見接合酵母屬在幾個材料的真菌中數量都相對比較豐富。在 FJ02中相對豐度最高的真菌屬為曲霉屬。FJ02、CD02、CD03中均含有德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)。CD02中菌屬種類多,分布比較均勻都在10%～30%左右,因此其優勢并不能判定其優勢均屬。CD03中優勢菌屬十分明顯,屬于赤霉菌屬,占到了60%。

圖4 樣品在屬上的分布情況Fig.4 Distribution of samples on genus level注:E:樣品中細菌群落分布;F:樣品中真菌群落分布。

3 討論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對東北不同產地的5份豆醬進行高通量測序,檢測到豆醬食品中含有數量龐大的真菌和細菌微生物群體,包括葡萄球菌、乳酸桿菌、德巴利氏酵母屬、芽孢桿菌等大量的發酵食品優勢菌屬。焦玉[30]通過對火腿腸的風味物質以及微生物檢測中就發現,葡萄球菌是一類可以通過水解脂肪從而提高發酵香腸中游離脂肪酸的含量,促進脂肪分解的優勢菌屬;樣品FJ01和CD03的葡萄球菌占比均超過60%。袁鈺等[31]通過高通量測序對北京豆汁兒的微生物多樣性和功能研究，也發現了乳酸桿菌在對豆汁兒中的氨基酸代謝具有重要作用,益于腸道菌群健康發酵;在糟魚發酵過程中,芽孢桿菌、乳酸桿菌具有產蛋白酶和脂肪酶的特性,酵母菌具有產脂肪酶的特性,能夠更好的促進發酵品質以及風味被李改燕[32]證實。

研究中對豆醬微生物群落結構分析后，發現幾種樣品的細菌真菌多樣性在門和屬的水平上均呈現出較大的差異,說明在豆醬生產中其微生物多樣性可能受到地域的影響,同時也很好的解釋了造成不同地區生產的豆醬風味差異的一部分原因是豆醬內部微生物的差異;不同加工方式對于豆醬中微生物多樣性的影響也存在較大影響,例如實驗中手工制作的豆醬CD01，或許因為在滅菌過程中處理得并不徹底而導致真菌多樣性相對幾種工業醬有顯著的差距,其中不乏有對人體有害的菌類;此外實驗結果對了解豆醬中微生物群落組成和微生物多樣性能夠提供一定的數據基礎。在今后地方特色的豆醬生產、保藏以及優勢菌種選育中,可以參考本研究中的各個樣品的試驗結果,來針對不同產地以及發酵天數的豆醬中優勢菌屬進行生產處理,以達到最佳的效果。