不同發酵時間對烏蝦醬風味的影響

欒宏偉,朱文慧,*,祝倫偉,步 營,*,李學鵬,勵建榮,季廣仁

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.錦州筆架山食品有限公司,遼寧錦州 121007)

蝦醬(shrimp paste),又名蝦膏,是我國沿海地區以及東南亞各國的傳統發酵調味品[1]。蝦醬是以毛蝦、烏蝦等小型蝦類為原料經腌制、攪拌、發酵而制成的粘稠醬狀食品,其味道鮮美,風味獨特[2-3],富含蛋白質、多肽、氨基酸、卵磷脂、腦磷脂及礦物質等營養物質[4]。蝦醬含鹽量一般在20%～30%[5],是韓國、日本、泰國、馬來西亞、緬甸、新加坡、老撾、印尼、菲律賓和越南等東南亞國家常用的調味品;我國主要分布在海南、廣東、廣西、遼寧、天津、山東、江蘇、浙江、福建等沿海地區[1,5-6]。

風味是決定蝦醬等水產調味品品質的重要因子,明確蝦醬中風味物質的組成是其風味調控與保持的基礎。蝦醬的發酵是一個復雜過程,在蝦醬發酵過程中蛋白水解是風味和營養形成的主要決定因素[7]。原料在微生物和酶的共同作用下,通過分解蛋白質和脂肪等基質,產生多肽、氨基酸等營養物質以及醛、酮、醇、吡嗪、含硫類等多種小分子風味化合物,對最終蝦醬產品的風味和品質起到決定性的作用[5-6]。據報道,多肽和游離氨基酸是蝦醬典型風味形成的主要物質基礎[8],蝦醬發酵的時間不同,其風味也不同,因此,有必要研究不同發酵過程中蝦醬風味物質的變化規律。

本實驗選取不同發酵時期的蝦醬,通過可反映蝦醬品質的氨基酸態氮(Amino acid nitrogen,AAN)、可溶性肽、電子鼻、電子舌味覺值作為評價指標,并結合揮發性風味物質檢測,研究不同發酵時間下蝦醬的風味品質變化,為制備高品質蝦醬提供理論參考。

表1 化學傳感器及其對應的敏感物質類型Table 1 Chemical sensors corresponding to different types of volatile substances

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏蝦醬 錦州筆架山食品廠提供;新鮮及體長約0.5 cm的烏蝦,打撈于渤海灣;食鹽 中國鹽業總公司;酪氨酸標準品(HPLC≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氯化鉀、酒石酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸 分析純,天津市天力化學試劑有限公司。

RCD-1A高速均質乳化機 常州越新儀器制造有限公司;PEN 3便攜式電子鼻(傳感器陣列由10個金屬氧化物傳感器組成) 德國Airsense公司;SA402B電子舌 日本Insent公司;Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司;UV2550紫外可見分光光度計 日本SHIMADZU公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料制備與選取 將烏蝦進行清理除雜并分級挑選,然后與食鹽按照1∶0.3 (w/w)混合后置于發酵缸中,即總食鹽添加量為蝦重量的30%,裝缸后用食鹽(包含在總食鹽添加量中)灑在頂部封存,三層紗布覆蓋,從發酵第三個月開始每天早晚各攪拌兩次,自然發酵1～3年。分別于2016年4月,2017年4月和2018年4月從同一缸中取樣裝瓶,4 ℃保存備用。

1.2.2 氨基酸態氮含量測定 根據王文秀等[9]的方法,采用甲醛滴定法對氨基酸態氮(Amino acid nitrogen,AAN)含量進行測定。取樣品5.0 g定容至100 mL,再取20 mL與60 mL蒸餾水混合并用0.05 mol/L NaOH滴定至pH8.2,然后向混合物中加入10 mL、40%的甲醛溶液。最后,使用0.05 mol/L NaOH將混合物滴定至pH9.2,記錄消耗的NaOH體積以確定ANN含量。計算公式如下:

式中:V1為空白所消耗NaOH的量(mL);V2為樣品所消耗NaOH的量(mL);V3為參與反應樣品體積(mL);C為NaOH濃度(mol/L)。

1.2.3 多肽含量測定 樣品前處理:取3.0 g樣品,加入27 mL 5% TCA溶液,均質后于4 ℃放置1 h,5000 g/min離心10 min,取上清液用5% TCA定容至50 mL。

樣品溶液的測定:取1 mL處理好的樣液,加入5 mL堿性銅試液(取氫氧化鈉10 g,碳酸鈉50 g,加水400 mL使溶解,作為甲液;取酒石酸鉀0.5 g,加水50 mL使其溶解,另取硫酸銅0.25 g,加水30 mL使其溶解,將兩液混合作為乙液。臨用前,合并甲、乙兩液,并加水至500 mL),于20～25 ℃放置10 min,再加0.5 mL福林酚試劑(1 mol/L),立即搖勻,在20～25 ℃保溫30 min,于500 nm測定吸光值。每個樣品4組平行。

標準曲線制作:取1 mL樣品溶液加入酪氨酸標準品(200 μg/mL),配制濃度梯度為0、20、40、60、80、100、120 μg/mL的溶液作為對照品溶液。按照上述步驟,每個梯度4組平行。所得標準曲線為:y=0.004x-0.0067,R2=0.9998。

1.2.4 電子鼻分析 根據樣品頂空揮發物通過傳感器的電阻值G與基準氣體通過傳感器的電阻值G0的比值而進行數據處理和模式識別[10]。傳感器由10種金屬氧化物半導體型(Metal oxide semiconductor,MOS)化學傳感元件組成,每型傳感元件對應的主要敏感物質見表3[10-11]。

取5 g樣品于50 mL燒杯中,用保鮮膜密封,25 ℃平衡10 min,運用電子鼻傳感器對樣品進行檢測。檢測時間120 s,清洗時間120 s,數據采集時間為90～95 s,每個樣品做三次平行重復。

1.2.5 電子舌分析 將5.0 g蝦醬樣品溶于100 mL蒸餾水中均質,10000 r/min離心10 min,取上清液備用。將電子舌配套傳感器和參比電極內部加入內部液(3.3 mmol/L KCl+飽和氯化銀),并分別將傳感器置于參比溶液(30 mmol/L KCl+0.3 mmol/L酒石酸)、參比電極置于3.3 mmol/L KCl溶液中活化24 h。自檢后,在室溫下通過電子舌對每種樣品的苦味、苦味余味、澀味、澀味余味、咸味、鮮味和豐富度進行分析。每個樣品重復4次,保留3組穩定的數據,取平均值。

1.2.6 HS-SPME/GC-MS測定

1.2.6.1 檢測樣品制備 取樣品約5.0 g,置于萃取瓶中,磁力攪拌器45 ℃加熱攪拌平衡10 min,然后插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器,頂空萃取30 min后取出,快速移出萃取頭并立即插入GC儀進樣口(溫度250 ℃)中,熱解吸3 min進樣。

1.2.6.2 檢測條件 色譜柱:HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:柱溫40 ℃,保留2 min,以5 ℃/min升溫至120 ℃,保持1 min;再以12 ℃/min升溫至250 ℃,并保持10 min;載氣為He;載氣流量1.0 mL/min;不分流進樣;溶劑延遲時間1.5 min。電子電離源;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;接口溫度280 ℃;質量掃描范圍30～550 a.m.u.。定性定量分析:對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對NIST 11和Wiley 7.0標準質譜圖。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0進行數據的統計分析,P<0.05表示差異顯著;通過Origin 8.5分析數據制圖;電子鼻數據運用電子鼻配套的WinMuster軟件對測定數據進行主成分分析(Principal component analysis,PCA);電子舌數據采用SA402B配套分析軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 氨基酸態氮和多肽含量分析

氨基酸態氮是判定發酵產品發酵程度的特性指標,能夠反映產品的老化程度及風味特點,該指標越高,說明蝦醬中氨基酸含量越高,鮮味越好[12]。由圖1可知,蝦醬的氨基酸態氮含量隨發酵時間的延長而逐漸增高,從1年的1.281 g/100 g增加到3年的1.614 g/100 g。發酵1年和2年蝦醬氨基酸態氮含量差異不顯著,而發酵1、2年與3年蝦醬氨基酸態氮含量差異顯著(P<0.05)。由圖2可知,隨著發酵時間的延長,多肽即可溶性肽含量也呈增加的趨勢,由發酵1年的0.655 g/100 g增加到3年的0.814 g/100 g。發酵1年和2年蝦醬多肽含量差異不顯著,而發酵1、2年與3年蝦醬多肽含量差異顯著(P<0.05)。由此可知,發酵3年的蝦醬品質最好。在發酵過程中,蝦體中內源性蛋白酶和微生物產生的蛋白酶共同作用使蛋白質降解[13],不溶性蛋白轉化為可溶性蛋白,同時有較多的可溶性蛋白轉化為肽、氨基酸、氨基態氮等小分子物質,形成了風味前體物質[14],可溶性肽對于蝦醬的風味和營養都有重要影響。肽是由蛋白質大分子降解得到的,從營養學角度來說,肽比同一氨基酸組成的蛋白質的消化吸收率要高,且風味優于單個氨基酸,且不易導致過敏現象。蝦醬發酵3年時達到較好品質。

圖1 不同發酵時間的烏蝦醬氨基酸態氮含量Fig.1 Contents of amino acid nitrogen in shrimp paste

圖2 不同發酵時間的烏蝦醬多肽含量Fig.2 Contents of polypeptides in shrimp paste

2.2 電子鼻分析

PCA分析是將多變量線性轉換選出較少重要變量的一種多元統計分析方法,可對傳感器獲取的多指標信息進行數據轉換和降維,并對特征向量進行線性分類,最終在PCA圖上顯示主要的兩維圖,貢獻率越大,越能更好地反映樣品信息[15-16]。

由圖3可知,不同發酵時間下蝦醬的第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的貢獻率分別為99.91%和0.089%,累積貢獻率為99.99%,表明兩個主成分基本代表了樣品的主要信息特征。每個樣品的3次不重復進樣構成一個獨立的族群,說明分析的重復性良好;不同發酵時間下蝦醬的數據點有重疊,不能完全區分開,且在PC1上無明顯差異,在PC2上存在差異但差異較小,說明電子鼻不能很好地區分三種蝦醬,即不同發酵時間下蝦醬的氣味差異不明顯[17-18]。

圖3 不同發酵時間的烏蝦醬電子鼻PCA分析Fig.3 The PCA results of E-nose analysisin different fermentation time

2.3 電子舌分析

圖4是不同發酵時間烏蝦醬的滋味組成分析。由圖4可知,鮮味、鮮味回味(濃厚感)和咸味是蝦醬最為重要的味覺指標。不同發酵時間蝦醬樣品對應的鮮味強度有較為明顯的差別,隨著發酵時間的延長,蝦醬的鮮味強度依次增強。鮮味回味與鮮味的變化規律相同,回味代表了樣品滋味的持久性和豐富程度。鮮味回味不僅與鮮味物質的絕對含量有關,還與鮮味物質的種類密切相關[19-20]。由本實驗結果可知,3年蝦醬的濃厚感最為強烈。三種蝦醬的咸味響應值均較高,蝦屬于海水養殖品種,對環境物質有較強的吸附能力,且蝦醬在制作中需要鹽分,因此,蝦醬會呈現出較高的咸味。咸味主要由Na+、K+等無機陽離子產生,它們的存在可以在一定程度上對咸味以外的其他滋味起到增強作用[20]。鮮味強度與無機離子含量可能也有關系[19-20]。蝦醬都具有一定的苦味。發酵前2年蝦醬的苦味值接近,且偏高;3年份蝦醬的苦味值要明顯低于前兩種蝦醬。三種蝦醬樣品的澀味值均較小,不在感知范圍內[21],表明澀味對蝦醬的滋味貢獻小。

圖4 不同發酵時間的烏蝦醬電子舌分析Fig.4 E-tongue analysis of shrimp pastein different fermentation time

2.4 揮發性化合物分析

三種不同發酵時間的烏蝦醬中鑒定出的揮發性風味物質組成及其相對百分含量如表2所示。由表2可知,三種蝦醬樣品均含有豐富的揮發性化合物,發酵1～3年烏蝦醬中風味成分種類和相對含量均有一定的差異,主要揮發性風味物質分別有42種,46種和44種,包括醛類化合物、酮類化合物、酯類化合物、烴類化合物、呋喃類化合物、含硫含氮化合物以及苯環化合物。

圖5 不同發酵時間烏蝦醬揮發性物質種類分析Fig.5 Volatile substance types ofshrimp paste in different fermentation time

表2 不同發酵時間烏蝦醬的揮發性物質分析Table 2 Volatile substances of shrimp paste in different fermentation time

續表

醛類化合物的氣味閾值一般較低,是存在于蝦肉中的一種重要風味揮發物,其來源可能是由氨基酸的降解反應或不飽和脂肪酸氧化生成的,對發酵水產品的風味特征起重要作用[22-23]。5～9個碳原子的直鏈飽和/不飽和醛具有青香、油香、脂香氣息,10～12個碳原子時具有檸檬味和橘皮味[24]。發酵1～3年烏蝦醬中總共檢測到13種醛類物質,分別含有10種、9種、9種,其主要的共性成分有異戊醛、庚醛、3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛、癸醛。隨著發酵時間的延長,其總相對百分含量逐漸增加,發酵3年蝦醬中醛類的相對百分含量最高為8.76%。庚醛具有強烈的、令人不愉快的、粗糙刺鼻的油脂氣味[25],其相對百分含量隨著發酵時間的延長而逐漸減少,發酵3年蝦醬中的相對百分含量最低。正己醛在發酵1年的蝦醬中被檢測到,其具有油脂和青草氣,高濃度時有酸敗、令人作嘔的氣味,有研究認為這可能是由n-6多不飽和脂肪酸氧化產生[26]。2-甲基丁醛、苯甲醛和苯乙醛具有令人愉快的杏仁味、堅果香和水果香[27],2-甲基丁醛在發酵3年的蝦醬中被檢測到,而苯甲醛和苯乙醛在三種蝦醬中均有檢出,且相對百分含量較高,推測可能是蝦醬中的特征風味化合物。

酮類化合物由多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解、氨基酸降解或微生物氧化產生。酮類物質閾值遠高于其同分異構體的醛,但由于具有獨特的清香和果香味,可能對蝦醬風味有一定的增強作用[28]。發酵1～3年烏蝦醬中共檢出12種酮類物質,分別含有10種、9種、9種,其主要的共性成分有3-己酮、2-庚酮、6-甲基-2庚酮、3-辛酮、2-壬酮、甲基辛基甲酮、甲基壬基甲酮。隨著發酵時間的延長,其總相對百分含量逐漸增加,發酵3年的蝦醬中酮類的想對百分含量最高為18.14%。3-辛酮具有水果微帶薰衣草的氣味,2-庚酮具有梨香味,2-壬酮具有焦糖香和脂肪味[27-29],上述物質在三種蝦醬中均有檢出,且相對百分含量較高,說明其對蝦醬香氣的貢獻較大。

酯類化合物一般具有水果香氣[30]。總共在蝦醬樣品中檢測到3種酯類化合物,1～3年的蝦醬中分別含有0種、1種和2種。其中3年蝦醬的相對百分含量最高,但也僅含有0.33%,而其在其他蝦醬中也很少有檢測到,故而可以認為酯類化合物對于蝦醬的香氣貢獻較小。

含氮含硫類化合物也是蝦醬中主要的揮發性風味物質之一,總共檢測到19種,1～3年的樣品分別含有12種、16種和14種,且其相對百分含量隨發酵時間的延長先增高后降低,發酵2年時的相對百分含量最高,達到38.12%,其次是發酵1年(37.59%)、3年(31.85%)的蝦醬。其主要的共性成分有三甲胺、二甲基硫、2-乙基呋喃、二甲基二硫、N,N-二甲基乙酰胺、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、二甲基三硫、二甲基四硫醚。二甲基二硫和二甲基三硫主要呈蔬菜香、洋蔥香等,三種蝦醬中均有檢測到,且相對百分含量較高,徐丹萍等[31]在發酵泡菜中檢測出這類物質,推測其可能是發酵類食品的特征風味物質。吡嗪類物質是脂肪氧化后又參與美拉德反應的產物,呈現的主要是肉香味和烤香味。吡嗪類既是醬的特征性風味物質,也是蝦肉的主要風味物質[32-34]。蝦醬中共檢測到7種吡嗪類化合物,其相對百分含量歲發酵時間延長而增高,其中3年蝦醬中含量最高(10.27%),其次是2年蝦醬(9.98%)。3-乙基-2,5-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪在三種蝦醬中均有檢出,具有堅果香、可可和烘烤香等,是一類具有低風味閾值的重要揮發性成分[35]。

醇類化合物的閾值通常較高,一般具有芳香、植物香、酸敗和土霉味,可能是由于脂肪酸二級氫過氧化物的分解、脂肪的氧化分解或由羰基化合物還原生成[34-36]。三種蝦醬中的共性成分有環戊醇、1-己烯-3-醇,一般具有肉味、蘑菇味和溫和油脂味[36],對蝦的風味有一定貢獻。

烴類物質可能源于脂肪酸中烷氧自由基的均裂[37],由于閾值較高,對整體風味貢獻較小。在三種蝦醬樣品中只檢出兩種烴類物質,含量也很低。烴類化合物可以在某種特定條件下形成醛和酮,是產生蝦醬腥味的一種潛在因素[38]。有報道,碳原子數在8～19之間的烷烴存在于甲殼類和魚類的揮發物中,但由于閾值較高對整體風味貢獻不大[39]。

3 結論

利用SPME-GC-MS、電子鼻、電子舌技術以及氨基酸態氮和多肽含量的測定,對烏蝦醬發酵期間的揮發性成分相對含量變化進行研究得出,發酵1～3年期間,烏蝦醬的氨基酸態氮含量由1.281 g/100 g增長到 1.614 g/100 g,多肽含量由0.655 g/100 g增加到0.814 g/100 g;隨發酵時間延長,蝦醬中的氨基酸態氮和多肽含量均呈增長趨勢;發酵1～3年烏蝦醬中的主要揮發性風味物質分別有42種,46種和44種,隨發酵時間延長,醛類化合物、酮類化合物、酯類化合物、吡嗪類化合物、烴類化合物、呋喃類化合物的相對含量增加,而除吡嗪類和呋喃類以外的含硫含氮化合物以及苯環化合物的相對含量減少。通過對蝦醬在發酵期間揮發性成分進行分析,可以發現對樣品整體風味貢獻最大的為醛類、酮類和含硫含氮化合物中的吡嗪類;電子鼻PCA分析不能有效區分不同發酵時間樣品的品質變化,電子舌結果顯示發酵3年時的蝦醬口感優良,鮮味突出,明顯優于發酵前期的產品。綜合研究發現烏蝦醬發酵3年時口感更為協調,品質較好。