白鰱魚糜漂洗水蛋白質(zhì)回收工藝研究

周俊鵬，章 蔚，劉 茹，朱旭萌，熊光權(quán)，汪 蘭，吳文錦，石 柳，*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所,湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心,湖北武漢 430064;2.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068;3.華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,湖北武漢 430070;4.長江大學生命科學學院,湖北荊州 434025)

魚糜是以魚類為原料,經(jīng)采肉、漂洗、斬拌、擂潰等工序制成,具有高蛋白、低脂肪等特點,常常作為食品加工中的重要原料[1]。在工業(yè)化魚糜生產(chǎn)過程中,為了得到具有色澤白、彈性高的優(yōu)質(zhì)魚糜,加工過程中往往需要多次漂洗,去除有色物質(zhì)、脂肪和腥味物質(zhì)等[2]。同時,漂洗處理也會導致約30%水溶性蛋白和少量鹽溶性蛋白損失,據(jù)統(tǒng)計,生產(chǎn)1噸魚糜約產(chǎn)生20噸漂洗廢水,其中約含有3000 kg水溶性蛋白[3]。漂洗水中蛋白質(zhì)含量高,化學需氧量高,廢水處理費用較高[4];若將其中蛋白質(zhì)回收,則可節(jié)約資源,降低生產(chǎn)成本和廢水處理成本。

有關學者進行了魚糜漂洗廢水處理方面的研究,包括物理法、化學法和微生物發(fā)酵等方面[5-7]。目前,從廢水中回收蛋白質(zhì)的方法主要有絮凝法、等電點法、膜分離法等。常用的絮凝劑包括無機絮凝劑(無機氯化鐵、氯化鋁等)和有機絮凝劑(海藻酸鈉、殼聚糖等)。吳正奇等[8]報道了三氯化鐵、陽離子聚丙烯酰胺、明礬等對淡水魚糜漂洗水中蛋白質(zhì)有較好的回收效果,但再利用較困難;邵明栓等[9]、武玉學等[10]和許永安等[11]分別研究了海藻酸鈉和殼聚糖對魚糜漂洗水中蛋白質(zhì)的回收。相比于無機絮凝劑,天然有機絮凝劑具有安全無害,價格低廉、來源廣和易降解等特點[12],且便于回收蛋白質(zhì)在食品加工中再次利用。等電點法主要是通過調(diào)節(jié)酸堿至漂洗水的等電點使蛋白質(zhì)發(fā)生沉降再進行回收,如徐律等[13]利用磷酸和乙酸調(diào)節(jié)魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的等電點來回收蛋白質(zhì),該法簡便有效。膜分離法是以篩分效應為基本原理,依靠壓力使溶液中的小分子溶質(zhì)透過膜,而大分子溶質(zhì)被截留進行分離的過程膜,但膜分離法成本較高,且操作繁瑣[14-16]。

目前關于單因素對蛋白質(zhì)回收效果的研究較多,但系統(tǒng)研究各因素協(xié)同回收魚糜漂洗水中的蛋白質(zhì)還鮮有報道。本研究結(jié)合不同沉降溫度、時間、種類的酸、pH、絮凝劑和添加量等多因素對魚糜漂洗水進行處理,研究其對蛋白質(zhì)回收率、上清液透光率和蛋白質(zhì)的SDS-PAGE影響,為工業(yè)魚糜漂洗水中蛋白質(zhì)的回收和廢水凈化提供理論參考,還能有效降低企業(yè)魚糜生產(chǎn)成本,減輕環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20條約2000 g(540 mm×100 mm)鮮活白鰱(Silver Carp)購于 湖北省武漢市白沙洲水產(chǎn)品批發(fā)市場;Coomassie Brilliant Blue G250、Coomassie Brilliant BlueAlbuminR-250、Bovine V BIOSHARP;95%乙醇、85%磷酸、氯化鈉、乙酸鎂、鹽酸、冰乙酸、檸檬酸、殼聚糖、海藻酸鈉、黃原膠、甲醇、十二烷基硫酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司;過硫酸銨、30%丙烯酰胺Acr-Bis、蛋白上樣液、電泳緩沖液、1.5 mol/L Tirs-HCl 武漢科瑞生物技術有限公司;Pre-stained Protein Marker(11～245 kDa) 天根生化科技有限公司(11～245 kDa);0.5 mol/L Tris-HCl 美國Dow Chemical公司;四甲基乙二胺(TEMED) 美國MYM公司。

MG12絞肉機 民發(fā)食品包裝機械廠;GD系列冷凍干燥機 江陰市新申寶科技有限公司;BCD-575WDBI 冰箱 青島海爾股份有限公司;JJ-1精密增力電動攪拌器 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;722N可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;FG2-B便攜式pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-ZK2恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司;DYY-12型電泳儀電源、24DN制膠器、電泳槽、WD-9406型膠片觀察燈 北京市六一儀器廠;Universal HoodⅡ凝膠拍照系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;SHA-C恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 在4 ℃環(huán)境中將白鰱敲擊致暈,去除魚鱗、內(nèi)臟、頭部與尾部,流水清洗干凈后,切塊;將大小適宜魚塊用絞肉機制成魚肉泥,然后以魚肉泥和水按1∶3 (m∶V)比例進行魚糜漂洗,攪拌10 min,靜置30 min,傾倒上層浮液,用紗布過濾器,收集漂洗水,以上操作重復2次;待白鰱魚糜漂洗水收集完成后,攪拌混勻,分裝,然后真空冷凍干燥;將干燥后的樣品分成多個小包裝真空包裝,置于恒溫干燥器中備用。

1.2.2 漂洗水復原 通過預實驗確定復原漂洗水的最佳條件是20 g凍干樣品溶于1 L水中,攪拌60 min;稱取20 g凍干樣品溶解于1 L水溶液中,進行一定溫度的控制,并用JJ-1精密增力電動攪拌器攪拌60 min,然后備用。

1.2.3 不同沉降溫度和時間的絮凝試驗 按照1.2.2方法進行漂洗水的復原,測得蛋白濃度為C0,然后分別在4和30 ℃環(huán)境中進行10、30、60、90、120 min進行溫度和時間沉降絮凝試驗,分別測定上清液蛋白濃度C1和透光率,然后計算蛋白質(zhì)的回收率,并用沉降絮凝樣品進行SDS-PAGE電泳試驗,每組試樣平行操作3次。

1.2.4 不同種類的酸和pH的絮凝試驗 按照1.2.2方法進行漂洗水的復原,測得蛋白濃度為C0,在確定溫度和沉降時間后,然后分別用鹽酸、乙酸和檸檬酸調(diào)節(jié)pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5進行不同種類酸和pH沉降絮凝試驗,分別測定上清液蛋白濃度C1和透光率,然后計算蛋白質(zhì)的回收率,并用沉降絮凝樣品進行SDS-PAGE電泳試驗,每組試樣平行操作3次。

1.2.5 不同絮凝劑及其添加量的絮凝試驗 按照1.2.2方法進行漂洗水的復原,測得蛋白濃度為C0,在確定溫度、沉降時間、酸的種類和pH后,然后分別殼聚糖、海藻酸鈉和黃原膠及0、0.2、0.4、0.6、0.6、0.8、1.0 mg/mL進行不同絮凝劑和不同添加量沉降絮凝試驗,分別測定上清液蛋白濃度C1和透光率,然后計算蛋白質(zhì)的回收率,并用沉降絮凝樣品進行SDS-PAGE電泳試驗,每組試樣平行操作3次。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 蛋白質(zhì)濃度測定 參考國標SN/T 3926-2014[17]方法,取6支25 mL具塞比色管,標準牛血清蛋白100 μg/mL,分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準蛋白,然后各加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250試劑,定容至6.0 mL,搖勻,放置5 min后于595 nm波長下比色,以蛋白質(zhì)含量為橫坐標,以吸光度值為縱坐標繪制標準曲線;另取3支25 mL具塞比色管,各加入1 mL樣品溶液,5 mL 考馬斯亮藍G-250溶液,充分混合后,放置5 min后于595 nm波長下比色,測定吸光度,通過標準曲線計算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.6.2 蛋白質(zhì)回收率 經(jīng)過絮凝試驗后,參考許永安等[11]方法,分別測定漂洗水復原液和絮凝試驗后其上清液的蛋白質(zhì)濃度,按照下列公式計算蛋白質(zhì)的回收率:

式中:C0-漂洗水復原液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;C1-上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。

1.2.6.3 透光率 經(jīng)過絮凝試驗后,參考許永安等[11]法,用可見分光光度計在600 nm處測定絮凝試驗后其上清液透光率,用去離子水作為對照組。

1.2.6.4 SDS-PAGE 經(jīng)絮凝試驗后,參考朱萌等[18]方法,在分別確定酸種類、pH、絮凝劑和添加量的過程中,收集不同條件下絮凝蛋白質(zhì)和漂洗水制成1 mg/mL電泳樣品,然后進行SDS-PAGE電泳試驗。先進行制膠,濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為12%,按照表1進行制膠。待膠凝固后,進行上樣,其中蛋白標準品上樣5 μL,蛋白樣品上樣7 μL;完成上樣后,在電泳槽中加入適量的電泳緩沖液且沒過凝膠;連接電源,在濃縮膠階段,設定電泳80 V,電流50 mA,待進入分離膠后,調(diào)節(jié)電壓至120 V,當藍色指示線條到凝膠底部邊沿時,表明電泳完成;然后將玻璃板上凝膠剝離,在染色液(50%甲醇+10%冰乙酸+0.1%考馬斯亮藍R-250+40%水)中振蕩浸泡2 h,然后轉(zhuǎn)移至脫色液(50%甲醇+10%冰乙酸+40%水)中脫色30 min,再用去離子水浸泡凝膠,并每2 h更換1次去離子水,直至凝膠中電泳條帶清晰;最后采用Universal Hood Ⅱ凝膠拍照系統(tǒng)進行拍照。

表1 濃縮膠及分離膠配制Table 1 Preparation of concentrated glue and separation gel

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0進行差異顯著性分析,實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標準曲線

蛋白質(zhì)標準曲線如圖1,回歸方程y=0.006x+0.0098,R2=0.9991,表明蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL范圍與吸光度A間線性關系良好,在后續(xù)試驗中蛋白質(zhì)濃度的測定中均使用此標準曲線。

圖1 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.1 Protein standard curve

2.2 不同沉降時間和溫度對蛋白質(zhì)回收效果的影響

如圖2A和圖2B所示,經(jīng)不同溫度和時間沉降絮凝后,魚糜漂洗水其蛋白質(zhì)回收率和上清液透光率都存在顯著性差異(P<0.05)。在4和30 ℃條件下,漂洗水中蛋白質(zhì)回收率隨著沉降時間延長都呈現(xiàn)先增大后減小,最后趨于平衡的趨勢;在前60 min過程中,30 ℃條件下蛋白質(zhì)的回收率大于4 ℃,60 min后則相反;在30 min時,4和30 ℃環(huán)境中漂洗水的蛋白質(zhì)回收率均達到最大值,分別為25.3%和44.7%,且30 ℃條件下蛋白質(zhì)回收率大于4 ℃。

圖2 不同沉降時間和溫度對魚糜漂洗水蛋白質(zhì)回收率(A)、透光率(B)和SDS-PAGE(C)的影響Fig.2 Effect of different time and temperature on protein recovery yield(A),light transmittance(B)and SDS-PAGE(C)of surimi rinsing water注:不同小寫字母代表不同溫度間存在顯著差異(P<0.05);不同大寫字母代表不同沉降時間間存在顯著差異(P<0.05)。

漂洗水經(jīng)過沉降后,上清液的透光率隨沉降時間延長逐漸增大,且30 ℃條件下上清液透光率大于4 ℃。隨環(huán)境溫度升高,漂洗水中蛋白質(zhì)發(fā)生變性,蛋白質(zhì)在水溶液中穩(wěn)定性降低,在重力作用下發(fā)生沉降。因此,30 ℃環(huán)境條件下魚糜漂洗水的蛋白質(zhì)回收率和上清液透光率均大于4 ℃,且變化速率較快。這一現(xiàn)象在Bourtoom等[19]和Scopes等[20]研究中得到了證實。在自然沉降條件下,漂洗水上清液的透光率分布范圍為1.0%～1.3%,此時上清液仍較為渾濁,表明蛋白質(zhì)沉降不完全。隨沉降時間延長,蛋白質(zhì)回收率和上清液透光率均逐漸增大,最終趨于穩(wěn)定。

漂洗水回收蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖2C所示。漂洗水中主要含有分子量約為35、42、48、63和100 kDa附近蛋白質(zhì),還含有少量分子量為190 kDa的蛋白質(zhì)。在一定環(huán)境條件下沉降后,已有的蛋白條帶濃度加深,且在25～28 kDa附近出現(xiàn)了多條新的電泳條帶。漂洗水中不同分子量的蛋白質(zhì)在溫度和時間作用下發(fā)生富集,這是25～100 kDa分子量蛋白質(zhì)濃度升高的主要原因。同時190 kDa的電泳條帶消失,可能是漂洗水中蛋白質(zhì)在蛋白水解酶的作用下發(fā)生降解[21]。結(jié)合環(huán)境溫度對蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響和實際生產(chǎn)情況考慮,采用4 ℃條件下沉降60 min來回收魚糜漂洗水中的蛋白質(zhì)。

2.3 不同酸和pH對蛋白質(zhì)回收效果的影響

如圖3A和圖3B所示,在確定溫度和沉降時間后,采用不同種類酸和pH處理后,魚糜漂洗水蛋白質(zhì)回收率和透光率存在顯著性差異(P<0.05)。采用鹽酸、乙酸和檸檬酸調(diào)節(jié)魚糜漂洗水至酸性,其蛋白質(zhì)回收率分別在pH5.5、5.0和5.5處達到最大值,分別是65.8%、25.5%和38.4%。由此可知,本試驗中漂洗水的等電點范圍為5.0～5.5,與王路[7]的研究較為一致。采用鹽酸調(diào)節(jié)漂洗水pH,其蛋白質(zhì)回收率始終高于乙酸和檸檬酸,這可能因為不同酸在水溶液中可電離出的氫離子濃度不同,對蛋白質(zhì)分子所帶的負電荷產(chǎn)生不同程度中和,最終使蛋白質(zhì)產(chǎn)生差異性沉降效果[3,13]。

圖3 不同種類酸和pH對魚糜漂洗水蛋白質(zhì)回收率(A)、透光率(B)和SDS-PAGE(C)的影響Fig.3 Effect of different acid and pH on protein recovery yield(A),light transmittance(B)and SDS-PAGE(C)of surimi rinsing water注:不同小寫字母代表不同種類酸間存在顯著差異(P<0.05);不同大寫字母代表不同pH間存在顯著差異(P<0.05)。

當漂洗水pH低于5.0(鹽酸)或4.5(乙酸和檸檬酸)時,上清液透光率約為1%～2%,與圖2B相似。當pH繼續(xù)升高時,鹽酸處理組的上清液透光率呈持續(xù)上升趨勢,乙酸和檸檬酸處理組上清液透光率均在pH5.5處達到最大值,結(jié)合蛋白質(zhì)回收率和透光率可以得出白鰱魚糜漂洗水等電點在pH5.5附近。

確定溫度和時間后,不同酸和pH處理的回收蛋白SDS-PAGE結(jié)果如圖3C所示,其處理組蛋白質(zhì)電泳條帶較漂洗水條帶濃度進一步加深,且pH至5.0～7.0左右時30.0 kDa附近的蛋白質(zhì)電泳條帶缺失,這可能是因為pH到一定時會使30.0 kDa附近蛋白質(zhì)發(fā)生降解[22]。結(jié)合酸堿對蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響,采用鹽酸調(diào)節(jié)pH5.5來回收魚糜漂洗水中的蛋白質(zhì)。

2.4 不同絮凝劑和添加量對蛋白質(zhì)回收效果的影響

如圖4A和圖4B所示,在確定溫度、時間、鹽酸調(diào)節(jié)pH5.5后,魚糜漂洗水蛋白質(zhì)回收率和透光率受絮凝劑種類和添加量影響(P<0.05)。隨絮凝劑添加量逐漸增大,魚糜漂洗水的蛋白質(zhì)回收率呈現(xiàn)不同的變化趨勢,其中殼聚糖和黃原膠處理后蛋白質(zhì)回收率逐漸增大,而海藻酸鈉處理后蛋白質(zhì)回收率先增加,當添加量大于0.6 mg/mL時蛋白質(zhì)回收率呈減小趨勢。經(jīng)鹽酸調(diào)節(jié)pH5.5處理后,蛋白質(zhì)回收率進一步升高,這是因為魚糜漂洗水中殘留的蛋白質(zhì)與絮凝劑之間產(chǎn)生橋連作用、靜電相互作用和基團反應而沉降聚集[23-26]。Wenbei等[27]研究表明在酸性溶液中經(jīng)質(zhì)子化后殼聚糖會形成帶正電荷的分子,其與魚糜漂洗水中殘留蛋白質(zhì)經(jīng)靜電相互作用發(fā)生沉降,同時殼聚糖分子通過離子鍵、氫鍵形成中間“橋梁”或某些活性基團反應也會使殘留蛋白質(zhì)發(fā)生沉降[28]。而海藻酸鈉隨著添加量增大后期會出現(xiàn)蛋白質(zhì)回收率下降,可能因為海藻酸鈉添加過量會使已經(jīng)形成的絮凝狀態(tài)變成穩(wěn)定膠體且不能進行有效地絡合作用降低絮凝效果,這種現(xiàn)象在劉婷婷等[29]和施亞芳[26]研究中得到了證實。黃原膠具有絮凝效果,這可能是因為在溶液中黃原膠與等電點處蛋白質(zhì)發(fā)生絡合,使漂洗水中蛋白質(zhì)發(fā)生沉降[30]。

圖4 不同絮凝劑和添加量對蛋白質(zhì)回收率(A)、透光率(B)和SDS-PAGE(C)的影響Fig.4 Effect of different flocculants and additions on protein recovery yield(A),light transmittance(B)and SDS-PAGE(C)of surimi rinsing water注:不同小寫字母代表不同種類絮凝劑間存在顯著差異(P<0.05);不同大寫字母代表不同添加量間存在顯著差異(P<0.05)。

漂洗水添加絮凝劑后,上清液透光率差異顯著(P<0.05)。隨絮凝劑添加量增大,殼聚糖和黃原膠處理組的上清液透光率呈先增大后略有減小趨勢,海藻酸鈉處理組呈持續(xù)減小趨勢,與蛋白質(zhì)回收率變化趨勢相似。當絮凝劑添加量低于0.6 mg/mL時,殼聚糖和黃原膠處理組的上清液透光率無顯著性差異(P>0.05),當添加量繼續(xù)增大時,黃原膠處理組的上清液透光率高于殼聚糖組;海藻酸鈉處理組的上清液透光率始終最低,這可能是因為海藻酸鈉處于酸性環(huán)境(pH5.5)時其—COO-轉(zhuǎn)變成—COOH,電離度降低,親水性降低,使漂洗水上清液透光率降低[31]。通過添加絮凝劑,漂洗水上清液透光率從1.2%繼續(xù)上升至87.8%。

結(jié)合以上溫度、時間、pH結(jié)果,采用絮凝劑進一步處理回收的蛋白SDS-PAGE結(jié)果如圖4C所示。經(jīng)絮凝劑處理后,不同分子量蛋白質(zhì)的條帶濃度繼續(xù)加深,且殼聚糖處理組蛋白條濃度帶明顯高于海藻酸鈉和黃原膠處理組,表明添加絮凝劑使蛋白回收效果進一步加強,殼聚糖的回收蛋白效果優(yōu)于其他兩種物質(zhì),且在20 kDa附近出現(xiàn)新的電泳條帶,說明小分子量蛋白質(zhì)隨著回收效果的加強也得到了一定的回收。因此,結(jié)合蛋白質(zhì)回收率、上清液透光率和電泳結(jié)果考慮,0.6 mg/mL殼聚糖添加量使蛋白質(zhì)回收效果最優(yōu)。

3 結(jié)論

本試驗通過確定4 ℃沉降60 min、鹽酸調(diào)節(jié)pH5.5、添加0.6 mg/mL殼聚糖等各條件,魚糜漂洗水的蛋白質(zhì)回收效果不斷提高,蛋白質(zhì)回收率依次為22.5%、65.8%和85.7%,上清液透光率依次為1.2%、50.1%和87.8%;SDS-PAGE電泳實驗也表明,經(jīng)系列條件處理后不同分子量蛋白質(zhì)含量也顯著提高。在本試驗確定的條件下,魚糜漂洗水中絕大部分的蛋白質(zhì)都能得到回收,且廢水澄清度也得到較好提升,這為工業(yè)魚糜漂洗水中蛋白質(zhì)的回收和廢水凈化提供了一定的指導,同時也具有較好的經(jīng)濟效益。