不同鐵皮石斛紅鑫品種品質的對比研究

鐘淳菲,陳燕蘭,任運紅,黎 攀,查應洪,杜 冰,*

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.紅河群鑫石斛種植有限公司,云南紅河 661200)

鐵皮石斛又名鐵吊蘭、黑節草等,是石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的一種,早在《神農本草經》和《本草綱目》等醫藥古籍均有記載。現代醫學和藥理研究表明,鐵皮石斛有多種藥理作用,如抗腫瘤[1]、抗衰老、抗疲勞[2]、降低血糖[3]、增強免疫力、改善胃腸道健康[4]、通過抗炎和抗氧化作用減輕學習和記憶障礙等作用[5],因此在民間有“救命仙草”、“中華仙草”的美稱。現代藥理學研究表明,鐵皮石斛含有石斛多糖、氨基酸、黃酮、生物堿及微量元素等多種對人體健康有益的藥理成分。

石斛藥材屬于野生資源,而鐵皮石斛對自然生態條件要求極其苛刻,自然繁殖能力低、生長緩慢,自然產量極為稀少,使野生資源瀕臨絕種,成為“瀕危珍稀植物”,被列入《中國植物紅皮書》。近年來的過度開采導致野生石斛導致市場供不應求。所以,優質的人工栽培鐵皮石斛大大解決了人們的需求。關于石斛品質研究方面,國內已有部分對不同品種、部位、長期、培養方式和干燥方式的石斛多糖、氨基酸、生物堿含量進行了研究,用來評價鐵皮石斛的質量。魯芹飛等[6]比較鐵皮石斛和細莖石斛、金釵石斛、馬鞭石斛、鼓槌石斛的總多糖、氨基酸、甘露糖含量,結果發現鐵皮石斛的總多糖和甘露糖含量遠高于其他四種,但氨基酸含量略低于細莖石斛、馬鞭石斛和鼓槌石斛。母多[7]比較鐵皮石斛、金釵石斛、球花石斛、棒槌石斛、大苞鞘石斛、兜唇石斛的糖類、氨基酸、生物堿含量等指標,結果表明從糖類成分看,鐵皮石斛質量最優。

紅鑫系列鐵皮石斛屬于優質品種,目前僅圍繞紅鑫系列高產人工栽培技術[8]有一些相關研究,然而對于紅鑫系列產品的品質研究鮮有報道。此外,鐵皮石斛產品的加工工藝很多,其中打漿處理也是鐵皮石斛產品開發的一種方式,但打漿對鐵皮石斛活性成分的影響未見相關研究報道,石斛漿品質和質構的關系也缺乏相關評價體系。因此,本研究對同產于云南紅鑫系列鐵皮石斛進行品質對比,同時探究了打漿后石斛品質與質構的關系,以期為石斛品質的快速鑒定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅鑫石斛 均由紅河群鑫石斛種植有限公司提供,具體的種類、批號及產地見表1;無水葡萄糖標準品 上海士鋒科技有限公司;甘露糖標準品、石斛堿標準品 上海江萊科技有限公司;蘆丁標準品 廣州市齊云生物技術有限公司,均為色譜純;無水乙醇、硫酸、苯酚、乙腈、甲醇、乙酸銨、三氯甲烷、酚酞、氫氧化鈉、鹽酸、亞硝酸鈉 分析純,廣州化學試劑廠;PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑咻酮) 分析純,上海酶聯檢測技術有限公司。

表1 石斛樣品的種類、批號及產地Table 1 Species,batch number andproducing area of dendrobium samples

DGG-924型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;RE-52A旋轉蒸發器 鞏義市予華儀器有限責任公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環水真空泵 上海一科儀器有限公司;HY-5回旋式振蕩器 常州澳華儀器有限公司;SC-80C全自動色差儀 北京康光儀器廠;UV5100紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 金壇市鴻科儀器廠;MAT 95XP Thermo型質譜儀 Thermo公司;Krromacil C18制備色譜柱 美國Krromacil公司;LC-20A液相色譜儀、RID-10A示差折光檢測器、EZ-Test質構儀 日本(島津)有限公司;TSKgel G5000PWxl凝膠柱、TSKgel G3000PWxl凝膠柱 東曹達(上海)貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石斛的處理 將石斛統一進行干燥處理,取新鮮鐵皮石斛,洗凈、瀝干后,于65 ℃熱風干燥48 h。并測定其水分含量,石斛干品水分含量約為9.00%±0.5%。

1.2.2 石斛的物性測定 物性的測定均參考文獻[9]的操作進行。

1.2.2.1 硬度的測定 選取石斛相同部位,采用EZ-Test質構儀測定其硬度。測試參數為圓柱形探頭,平端直徑為50 mm;測試前探頭下降速度:1.0 mm/s;測試速度:1.0 mm/s;測試后探頭回程速度:8.0 mm/s;時間:5.0 s;測試距離:30.0 mm,位移原點:載荷10 gf;試驗類型:壓縮。每個樣品重復10次。

1.2.2.2 剪切力和剪切位移的測定 選取石斛相同部位。使用ALKB切刀對樣品進行TPA測試。測試參數為:下壓速率、上行速率分別為1和5 mm/s,切割程度為75%,停留間隔為5 s,數據采集速率:400 pps;觸發力值:5 kg。最大剪切位移值和變形應力值表征石斛的脆度。每個樣品重復10次。

1.2.2.3 粘度與稠度的測定 稱取5 g的石斛樣品,100 ℃復水5 min,取出瀝干后加水打漿(料液比為1∶20)。分別將石斛漿樣品置于高度50 cm,直徑8.0 cm的待測玻璃杯中,采用EZ-Test質構儀測定其粘度和稠度。測試參數為反擠出試驗探頭,平端直徑為60 mm;測試前探頭下降速度:1.0 mm/s;測試速度:8.0 mm/s;測試后探頭回程速度:5.0 mm/s;時間:5.0 s;測試距離:30.0 mm;位移原點:載荷10.0 gf;試驗類型:壓縮。每個樣品重復6次。

1.2.2.4 感官評價 對石斛樣品清洗干凈,10個以上人員進行品嘗(準確給出感官評定人員的數量),對石斛的香氣、滋味和接受程度等指標進行綜合評價。具體評分標準如表2所示。

表2 石斛漿樣品的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for dendrobium samples

1.2.2.5 色差值測定 參考文獻[10]，稱取一定質量(5±0.5) g的石斛漿樣品,將不同石斛漿樣品分別平鋪于帶蓋的透明塑料皿中,壓實,采用色差儀測定色度值L*、a*、b*,每個樣品測量3次,取平均值。

1.2.3 活性成分含量測定

1.2.3.1 多糖含量測定 參照2010版《中國藥典》[11]測定鐵皮石斛多糖含量。

葡萄糖標準曲線的測定:配置濃度為0.01 μg/mL葡萄糖的標準液,精密量取標準液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置10 mL具塞試管中,各加水補至1.0 mL,精密加入5%苯酚溶液1 mL(臨用配制),搖勻,再精密加硫酸5 mL,搖勻,置沸水浴中加熱20 min,取出,置冰浴中冷卻5 min,以相應試劑為空白,用紫外-可見分光光度在488 nm的波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制得到葡萄糖標準曲線:y=9.1529x+0.0471,R2=0.9991。

樣品溶液的制備:取石斛干粉約0.3 g(過100目篩),用水提醇沉法提取石斛多糖,得石斛多糖提取液。

樣品多糖含量的測定:用紫外-可見分光光度在488 nm的波長處測定吸光度,從標準曲線上得出供試品溶液中無水葡萄糖的量,計算,即得石斛多糖含量。

1.2.3.2 多糖分子量測定 石斛多糖分子量的測定采用高效凝膠滲透色譜法[12]測定。

分析條件:色譜柱:TSKgel G5000PWxl與G3000PWxl(7.8 mm×30 cm,Tosoh Bioscience,Stuttgart,Germany)串聯使用,最大壓力設置為3 MPa。流動相為20 mmol/L 磷酸緩沖液,pH7.0。進樣量:20 μL;流速為0.5 mL/min。洗脫時間80 min。

標準曲線的測定:取葡萄糖和8個已知分子量的右旋糖酐標準品(Dextran),重均分子量分別為198、5000、12000、50000、150000、410000、670000、1100000、2290000 Da,分別用20 mmo/L 磷酸緩沖液,pH7.0溶解,制成10 mg/mL的溶液。根據多糖標準品的分子量和色譜圖的保留時間,由GPC軟件(LCsolution GPC)處理,以保留時間為橫坐標,相對分子質量對數值為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:log(Mw)=-0.1579tR+12.799,Mw為重均分子量,tR為保留時間(min),相關系數r=0.9949。

樣品分子量的測定:石斛多糖樣品溶液,冷凍干燥后用ddH2O溶解成10 mg/mL溶液,過0.45 μm尼龍膜,取20 μL注入色譜儀,記錄色譜圖。根據樣品的保留時間,與標準曲線對照,用GPC軟件計算出多糖分子的分子量。

1.2.3.3 多糖的單糖組分分析 多糖的提取及純化[13]:石斛樣品經過烘干后粉碎,過100目篩,稱取50 g石斛粉末,按照料液比1∶20加入蒸餾水,浸泡1 h后置于100 ℃水浴鍋回流提取3 h,過濾,濾液加入5倍體積的無水乙醇,振蕩搖勻,冷藏1 h,4000 r/min下離心20 min,收集沉淀物,再用80%的乙醇洗滌2次,離心,棄去上清液,沉淀物經冷凍干燥即得石斛粗多糖樣品。

石斛粗多糖樣品再經過SephadexG-50葡聚糖凝膠色譜柱進一步純化,收集第101～275 mL淋洗液于60 ℃水浴烘干,得純化的石斛多糖[14]。

多糖的水解及乙酰化:取500 mg純化的石斛多糖,加入2 mol/L H2SO438 mL加熱回流6 h,冷卻,用飽和Ba(OH)2溶液中和至中性,過濾,濾液徹底蒸干水分后,加入70 mg鹽酸羥胺和5 mL吡啶,于90 ℃水浴加熱1 h,取出稍冷,加入5 mL醋酸酐,再于90 ℃水浴加熱1 h,冷卻,加10 mL水破壞醋酐,用氯仿萃取乙酰化產物,氯仿萃取液用水洗滌,無水硫酸鈉脫水,上清液通氮氣濃縮定容至1 mL,進行GC-MS分析。

GC-MS條件:SE-30彈性石英毛細管柱(15 m×0. 2 mm×0. 33um),柱溫初溫100 ℃,以10 ℃/min程序升溫至280 ℃,保持10 min,載氣He。柱前壓70 kPa,分流比10∶1,溶劑延遲2 min,進樣量1.0 μL。EI離子源,電子能量70 eV,四極桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃,電子倍增器電壓2300 V,GC-MS接口溫度280 ℃,質量掃描范圍29～500 m/z。

1.2.3.4 黃酮類物質含量的提取與測定 參考文獻[15]的方法。蘆丁標準曲線的測定:配置濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準液,準確吸取0.2 mg/mL蘆丁溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL,分別置于比色皿中,用蒸餾水代替蘆丁溶液為零管,各加水至2.4 mL,分別加入5% NaNO2溶液0.4 mL,搖勻,靜置6 min;加入4% NaOH溶液4 mL,搖勻,靜置15 min;在510 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,蘆丁含量為橫坐標繪制得標準曲線:y=0.98x+0.0008,R2=1。

樣品溶液的制備:準確稱取2.0 g石斛干粉(60目篩),置于索氏提取器中,加入乙醇回流提取1 h,過濾。光照去葉綠素,用乙醇定容。

樣品中總黃酮含量的測定:精確吸取樣品溶液1.0 mL,置于10 mL容量瓶中,按照標準曲線項下操作,每個樣品平行測定3次,測得的吸光度代入蘆丁標準曲線方程中,計算石斛中總黃酮的含量采用醇沉法提取石斛樣品,光照去葉綠素后,測定其吸光度并代入標準曲線進行計算得出黃酮含量。

1.2.3.5 生物堿含量測定 參考文獻[16]的方法。標準曲線的測定:精密稱取石斛堿1.00 mg,置100 mL容量瓶中,加氯仿至刻度。精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置分液漏斗中,用氯仿準確稀釋至10.0 mL,加入pH4.5緩沖溶液5.0 mL和0.04%溴甲酚綠溶液1.0 mL,劇烈振搖3 min,靜置30 min,氯仿層通過經氯仿浸泡處理并干燥后的藥棉濾過,取續濾液6.0 mL,加0.01 N氫氧化鈉無水乙醇液1.0 mL,搖勻,以氯仿10.0 mL,同樣操作,做空白對照。于波長620 nm處分別測得吸光度值,以石斛堿量為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制得石斛堿標準曲線:y=0.0084x+0.0013,R2=0.9983。

樣品溶液的制備:精密稱取0.5 g石斛干粉(60目篩),用適量氨水濕潤,密塞放置30 min,精密加入氯仿10.0 mL,稱重,置水浴上加熱回流2 h,冷卻后稱重,補充氯仿達原重,過濾,精密量取續濾液1.0 mL,置10 mL容量瓶內,加氯仿至刻度線,搖勻,從中吸取2.0 mL置25 mL容量瓶中,加氯仿稀釋至刻度,搖勻,作為樣品液。

樣品中生物堿含量的測定:精密量取樣品液10 mL,按“標準曲線”項下測定其吸光度,每個樣品平行測定3次,計算石斛中生物堿的含量。采用氯仿回流制備樣液,通過測定其在620 nm處的吸光度值,并代入標準曲線進行計算得出生物堿的含量。

1.3 數據處理

應用SPSS 21.0數據處理系統、Excel 2013、GPC軟件(LCsolution GPC)進行試驗數據輸入、分析和制圖。結果采用GPC軟件計算多糖分子的分子量,用單因素方差分析法進行品種間差異性比較,用相關系數、偏回歸系數進行分析。

2 結果與分析

2.1 三種石斛的物性及活性成分含量分析

2.1.1 三種石斛干品的水分含量及質構的差異 由表3可以看出,三種石斛樣品經同樣方法干燥處理后,水分含量相近,無顯著性差異。紅鑫1號紅桿鐵皮石斛的硬度最大,其次是紅鑫1號青桿,最小的是紅鑫5號,且硬度大小存在顯著性差異。三種石斛樣品剪切力從大到小為:紅鑫1號青桿>紅鑫1號紅桿>紅鑫5號,而剪切位移無顯著性差異。

表3 三種石斛干品的水分含量及質構的測定結果Table 3 Determination of water content and texture of three dendrobium stem products

2.1.2 三種石斛漿粘稠度、色澤、感官評分的差異 由表4可知，石斛漿的粘度與其所含成分有關,石斛中的粘性多糖含量越高,多糖分子內部聚合在一起的概率越大,分子間的相互作用力產生使粘度增大[17]。由表4可知,一同產自云南屏邊的不同品系的鐵皮石斛中,紅鑫1號青桿、紅鑫1號紅桿、紅鑫5號的粘度相近,都在0.45～0.49 J之間,三者粘度沒有顯著性差異。石斛漿的稠度越小,流動性越好,稠度越大,流動性越差。紅鑫1號紅桿的流動性較紅鑫1號青桿差,紅鑫5號石斛漿流動性最好。

表4 石斛復水打漿后的物性測定結果Table 4 Determination of physical properties of dendrobium after rehydration and pulping

這三個石斛漿樣品中,紅鑫5號的亮度最大。三個樣品石斛漿顏色偏黃綠色,其中紅鑫1號青桿顏色最深,紅鑫1號紅桿顏色最淺。紅鑫1號紅桿的感官評價總分最高,其次是紅鑫5號,紅鑫1號青桿的總分最低,三個品種的石斛漿的稠度、亮度和感官評分均存在顯著差異。姜波等[18]對浙江、云南、江蘇等地的鐵皮石斛進行感官評價,結果顯示3種鐵皮石斛粘度與稠度差異較明顯。

2.1.3 三種石斛干品的活性成分含量 由表5可知，這3個石斛樣品中黃酮、生物堿、多糖含量均無顯著性差異。其中多糖含量最高為產自紅鑫1號紅桿,達27.64%,其次為紅鑫1號青桿,達25.96%,而紅鑫5號的多糖含量最低,為25.70%。根據藥典規定鐵皮石斛中多糖含量不得少于25.0%,本試驗中均符合此標準的樣品。謝魯靈楓等[19]對不同產地鐵皮石斛主要成分及甲醇提取物HPLC指紋圖譜研究,其中來自云南昆明的鐵皮石斛多糖含量為39.08%,總黃酮含量為0.071%,多糖含量較本試驗紅鑫鐵皮石斛含量高,總黃酮含量較本試驗結果低。Wang等[20]對不同來源鐵皮石斛及其混淆品多糖含量進行了比較,其中4種產于云南的鐵皮石斛多糖含量在32.23%～47.17%之間,均比本試驗的紅鑫鐵皮石斛含量高。鐵皮石斛總生物堿含量較低,一般在0.0083%～0.0241%之間[21]。本試驗結果除中紅鑫1號紅桿生物堿含量未檢出,紅鑫1號青桿與紅鑫5號生物堿含量處于正常范圍。

表5 石斛干品的活性成分含量的測定結果Table 5 Determination of active components of dry dendrobium

2.2 三種石斛的多糖成分評價

2.2.1 三種石斛多糖的分子量及單糖組成

2.2.1.1 多糖分子量及其分布 由表6可知,3種石斛多糖色譜峰的保留時間在44.927～46.101 min之間。3種石斛樣品多糖分子量及其分布有明顯的差異。而三種鐵皮石斛中,分子量從大到小為紅鑫1號青桿>紅鑫1號紅桿>紅鑫5號,華允芬等[12]利用高效凝膠色譜法測定鐵皮石斛中多糖的重均分子量,為128 kDa,在本試驗結果的范圍內。

表6 3種石斛樣品多糖平均分子量及分布情況Table 6 Average molecular weight and distribution of polysaccharides from three dendrobium species

多糖的均一性與其分子量的分布相關,多糖的均一性在一定程度上與其多分散性系數(D)有關。鐵皮石斛多糖分子量的分布系數D較大,均大于2,S15的分布系數達4.45。說明鐵皮石斛的多糖非均一組分,是雜多糖。

2.2.1.2 多糖的總離子流圖與單糖組成和含量 有研究表明,通過多糖凝膠電泳法建立鐵皮石斛主要成分多糖的指紋圖譜,不僅可以區分不同地區的鐵皮石斛,也可鑒定不同種類的石斛[22]。

圖1 3種石斛多糖的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS Tic of three dendrobium species

由圖2可知,不同品種的紅鑫鐵皮石斛單糖組成種類相近,但含量存在差異。它們的甘露糖絕對峰面積范圍在9.30×105～4.87×107之間,其中紅鑫1號紅桿、甘露糖絕對峰面積最大,在4.0×107以上,甘露糖含量達46.71%。最小的是紅鑫1號青桿,甘露糖含量為35.92%。3種石斛樣品的單糖組成相近,都是一種酸性雜多糖,主要由4種六碳糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖)和3種五碳糖(核糖、阿拉伯糖、木糖)組成,其中甘露糖和葡萄糖含量最高,其次是阿拉伯糖。

圖2 3種石斛的單糖組成及其相對含量Fig.2 Monosaccharide composition and relativecontent of three dendrobium species

李龍囡等[23]用高效液相色譜法測定了云南瑞麗品種鐵皮石斛中甘露糖的含量,為26.32%,甘露糖含量較高,相對品質較好,低于本試驗中紅鑫系列鐵皮石斛。賓宇波等[24]對鐵皮石斛多糖進行高效液相色譜分析得出,鐵皮石斛多糖由D-甘露糖、L(+)-鼠李糖和D-葡萄糖三種單糖組成。Luo等[25]對鐵皮石斛多糖組分結構進行了分析,單糖組成為甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖及微量的半乳糖醛酸,其物質的量之比為6.2∶2.3∶2.1∶0.1。本試驗分析紅鑫鐵皮石斛多糖的單糖組成,發現其由7種單糖組成。

2.3 三種石斛的質構與多糖含量的相關性分析

2.3.1 干石斛的質構-多糖含量的相關性分析 由表7的相關性表明,石斛多糖含量與其硬度呈顯著正相關。說明干品石斛多糖的含量與其質構有關,多糖含量越高,石斛的硬度越大。

表7 石斛多糖含量與質構的相關性分析Table 7 Correlation analysis of polysaccharidecontent and texture of dendrobium

2.3.2 石斛漿的質構-多糖的相關性分析 對石斛漿的質構、感官評分與其多糖含量做相關性分析,由表8的相關性表明,石斛漿多糖含量與其稠度呈正相關。石斛多糖含量越高,質越重,嚼之越有粘性,質量更優[26]。石斛漿多糖含量與其粘度滋味、感官評分的相關性也不顯著,但感官評分與其滋味呈極顯著正相關。由此說明石斛漿的多糖含量與其質構、感官品質沒有明顯的相關性。

表8 石斛漿質構-多糖-感官評價的相關性分析Table 8 Correlation analysis of the texture-polysaccharide-sensory evaluation of Caulis dendrobii pulp

以多糖為Y值,滋味、稠度、粘度、感官總分為自變量,對其做多元回歸方程發現,滋味、稠度、粘度、感官總分這4個自變量對石斛漿多糖含量的影響都不顯著(P>0.05),而且以此建立的多元回歸方程擬合程度不高,模型不顯著(P>0.05)。因此對粘度、稠度等質構指標與多糖含量進行逐步回歸分析,得最優回歸方程為:

Y=21.485+5.672X1+1.896X2

式中:X1為石斛的粘度,X2為石斛的稠度。它們與多糖含量的多元相關在α=0.05水平顯著(P<0.05)。由偏回歸系數分析可知,對石斛多糖含量影響最大的因素是粘度,稠度次之。

3 結論

本研究對高產的鐵皮石斛紅鑫系列品種進行了品質對比研究,結果表明:同產地、同系列、不同紅鑫品種的鐵皮石斛品質存在顯著性差異,紅鑫1號紅桿在感官綜合評分、多糖含量、單糖組成上優于紅鑫1號青桿、紅鑫5號,為紅鑫系列鐵皮石斛的進一步利用提供了理論依據。然而,本文僅補充了云南屏邊三個紅鑫系列鐵皮石斛的研究數據,而未對其他品種的石斛植物進行研究對比。我國石斛品種眾多,大多數成分還未有質量控制方法,后續研究可以通過對比多品種的品質差異,建立石斛中主要成分的質量評價技術。