日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊肌纖維類型及肉品質的影響

白艷蘋,侯艷茹,孫雪峰,侯普馨,蘇 琳,趙麗華,靳 燁,*

(1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018;2.內蒙古烏拉特中旗家畜改良站,內蒙古烏拉特中旗 015300)

乳酸菌是目前食品工業中廣泛使用的綠色安全的飼料添加劑,其主要代謝產物,諸如酸性代謝產物、胞外多糖、乳酸菌素、γ-氨基丁酸等在畜牧生產領域具有很大的應用價值。乳酸菌能有效降低抗生素的用量,提高幼齡動物的成活率和生長性能,調節動物腸道微生態平衡,增強機體免疫力,提高飼料轉化率,提高日增重,降低養殖成本,有利于產出優質安全的奶、肉產品,提高產品的附加值和市場競爭力[1-3]。

肌纖維是骨骼肌組織的基本結構單位,肌纖維密度和不同類型肌纖維的數量比例和面積比例都與肉品質密切相關,也是動物出生后肌肉生長的重要參數。大量的研究表明,當氧化型肌纖維比例高時,肌肉的肌內脂肪含量、肉色、pH較高,肌肉的保水性較好,肉質細嫩多汁,肉品風味更好。肌纖維的數目雖在出生時就已基本確定,但肌纖維是動態結構,可以根據以下途徑從一種類型轉換為另一種類型:Ⅰ?Ⅱa?Ⅱx?Ⅱb[4]。大量研究已經表明,肌纖維發育過程中易受到品種、性別、年齡、激素、運動、營養、肌肉部位或生理階段等諸多因素的影響,因此研究如何通過改變肌纖維類型組成進而改善肉品質具有理論與現實的雙重意義。

在動物生長發育過程中,日糧中的營養物質通過消化吸收,主要以肌肉和脂肪沉積在動物機體。養分的代謝和流轉必然引起機體能量和蛋白質代謝發生改變,并最終影響肉品質[5]。Chen等[6]研究了鼠李糖乳桿菌CF對無特定病原體雞的生長性能和肉質的益生作用后發現,日糧添加鼠李糖乳桿菌CF顯著增加了大腿肌肉的脂肪含量和pH以及胸肌的脂肪含量和色澤。Liu等[7]的研究表明,日糧添加約氏乳桿菌BS15可顯著提高肉仔雞宰后24 h的pH,同時顯著降低滴水損失和剪切力。韋良開等[8]開在育肥豬飼料內添加含有乳酸菌的微生態制劑后發現,與對照組相比,宰后45 min,試驗組豬肉紅度和黃度均顯著提高;宰后24 h,試驗組豬肉黃度也顯著增加,貯存損失顯著減少。鄔理洋[9]用含有乳酸菌的微生態制劑飼喂斷奶仔公豬,結果顯示,微生態制劑對肌纖維直徑和面積產生一定影響,使豬背最長肌具有更多的氧化型肌纖維和更少的酵解型肌纖維。盡管其他人已經對此進行了一些研究,表明日糧中添加乳酸菌可能對肉品質和肌纖維特性產生不同程度的影響,但這項研究大部分是在其他物種中進行的,關于乳酸菌對羊的肌纖維特性和肉品質的影響鮮少報道,將二者聯系起來進行分析的更是少之又少。因此,本研究通過測定肌纖維特性、MyHCs基因表達量、代謝酶活性和肉品質指標,探究在日糧中添加乳酸菌對蘇尼特羊的肌纖維類型及肉品質的影響,為乳酸菌制劑在羊的生產中的合理利用提供理論依據和實用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物 在草原恒通食品有限公司進行屠宰,宰后1 h內取蘇尼特羊背最長肌為實驗材料;對照組日糧 精飼料(10 kg)、青貯飼料(8 kg)和葵花餅(5 kg),并且每月依次增加精飼料(2 kg)、青貯飼料(8 kg)和葵花餅(5 kg);乳酸菌組日糧 將乳酸菌按照對照組總日糧的0.50%(質量分數)添加至上述日糧中,混合并攪拌均勻;乳酸菌使用乳安邦復合微生態制劑,活菌數≥1.5×109CFU/g,其成分主要包括乳酸桿菌(LactobacilluscaseiHM-09、LactobacillusplantarumHM-10)及其代謝產物，乳酸菌添加量參考乳安邦復合微生態制劑使用說明書;乳安邦 內蒙古和美科盛生物技術有限公司;精飼料 恒牧飼料科技有限公司;青貯飼料、葵花餅 牧民自制;異戊烷 阿法埃莎(天津)化學有限公司;三磷酸腺苷二鈉鹽(ATP) 北京酷來搏科技有限公司;巴比妥鈉 山東西亞化學股份有限公司;氯化鈷 天津市福晨化學試劑廠;無水氯化鈣、無水乙酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司;硫化銨 上海麥克林生化科技有限公司;異丙醇 上海振興化工二廠有限公司;RNAiso Plus、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII、Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒 大連寶生物工程大連有限公司;蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶試劑盒 南京建成生物工程研究所。

MEV冰凍切片機 德國Slee公司;Leica 4000B顯微鏡 德國徠卡公司;DSH-300A回旋式水浴恒溫振蕩器 上海雅榮生化設備儀器有限公司;Eppendorf 5417冷凍離心機 德國Eppendorf生物公司;LightCycler?96實時熒光定量PCR儀 羅氏診斷產品(上海)有限公司;凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司;BG-power 3500型穩定溫流電泳儀、水平電泳槽 北京百晶生物技術有限公司;Biometra PCR擴增儀 北京北方華奧貿易有限責任公司;pH-STAR型胴體pH直測儀 德國Matthaus;C-LM3B型數顯式肌肉嫩度儀 東北農業大學工程學院;SYNERGY H1型酶標儀 美國Bio-Tek Instruments公司;TC-P2A全自動測色色差計 上海生物生化實驗儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 飼養管理 本實驗在內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗哈拉圖蘇木牧區進行,選擇3月齡,體重(16.6±1.49) kg的蘇尼特羊24只,隨機分為兩組:對照組和乳酸菌組,每組12只,公母各半。兩組蘇尼特羊分別于相同大小的圈中集體飼喂,飼養期間自由飲水、采食,先經過為期15 d的預飼期,以確定乳酸菌添加量對蘇尼特羊無腹瀉等不良影響,再進行正式實驗,全期實驗共計105 d。

1.2.2 肌纖維組織學特性測定

1.2.2.1 樣品的采集和制片 宰后1 h內取24只蘇尼特羊的背最長肌,按照肌纖維的方向,切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm的肌肉塊,在事先預冷的異戊烷中脫水干燥30 s,再經液氮速凍,取出后裝進無酶無菌凍存管,用干冰帶回,放在-80 ℃冰箱中保存。每只羊取9～12個肌肉塊,制片時將肌肉塊放入-25 ℃的冰凍切片機內切片,厚度為10 μm左右[10]。

1.2.2.2 ATP酶染色 用pH4.6的酸性前孵育液對蘇尼特羊的背最長肌樣品進行ATP酶組織化學染色[11]。

1.2.2.3 肌纖維各項指標的測定 用顯微鏡彩圖分析軟件在100倍下觀察并分析肌纖維特性,標尺為200 μm,選擇2～3個視野,使總肌纖維數目大于1500根[12]。統計每種類型肌纖維的數量,用每種類型肌纖維數量除以總肌纖維數量記為該種肌纖維的數量比例;測量每種類型肌纖維的橫截面積,用每種類型肌纖維總面積除以總肌纖維面積記為該種肌纖維的面積比例;用總肌纖維數量除以總肌纖維面積記為肌纖維密度[13]。

1.2.3 肌球蛋白重鏈基因表達量 屠宰后,采集約100 mg蘇尼特羊背最長肌的肌肉樣品,裝入無酶無菌凍存管中,于液氮中速凍,保存在-80 ℃冰箱中用于提取總RNA。肌肉中總RNA的提取是按照RNAiso Plus的指導使用說明書進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計檢測總RNA的完整性、濃度和純度。之后再將提取的RNA稀釋到500 ng/mL,進行反轉錄操作,合成cDNA。MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx基因和管家基因GAPDH的引物參照尹麗卿[11]的實驗方法進行設計,由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4 酶活性的測定 蘇尼特羊背最長肌中蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase,MDH)、琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活性的測定按照蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶試劑盒說明書進行。

1.2.5 肉質指標的測定

1.2.5.1 pH的測定 用pH-STAR型胴體直測式pH計測定蘇尼特羊背最長肌的pH,測得的最初pH記為pH0;靜置排酸24 h后測得的pH記為pH24。

1.2.5.2 色澤的測定 取1.5 cm2的測定面積,使用TC-P2A全自動測色色差儀對肉的亮度值(L*值)、紅度值(a*值)和黃度值(b*值)進行測定。

1.2.5.3 剪切力值的測定 將大小約為2.5 cm×3 cm×5 cm的肌肉塊放置在密封袋中,經水浴鍋(75 ℃)煮制45 min后取出,冷卻至室溫,再將其切成3 cm×1 cm×1 cm的條狀,使用肌肉嫩度儀測定其剪切力值。

1.2.5.4 蒸煮損失的測定 將大小約為2.5 cm×3 cm×5 cm的肌肉塊放置在密封袋中,經水浴鍋(75 ℃)煮制45 min后取出,冷卻至室溫,稱量煮制前后肌肉塊的質量差,再用差值除以煮制前的質量,記為蒸煮損失。

1.3 數據處理

數據是利用SPSS 19.0 數據分析軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和相關性分析(Pearson系數),文章中所有數值均以平均值±標準誤表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊肌纖維特性的影響

2.1.1 蘇尼特羊背最長肌的ATP酶染色結果 根據Brooke等[14]的研究,不同類型的肌纖維對酸堿的穩定性不同,Ⅰ型肌纖維的穩定范圍為pH3.9～10.4,ⅡA型為pH4.9～10.8,ⅡB型為pH4.5～10.8。因此,經ATP酶染色后,顏色最深的為Ⅰ型肌纖維,顏色最淺的為ⅡA型肌纖維,顏色介于兩者之間的為ⅡB型肌纖維[14]。其中Ⅰ型肌纖維為慢速氧化型、ⅡA型肌纖維為快速氧化-酵解型、ⅡB型肌纖維為快速酵解型。

圖1 蘇尼特羊背最長肌ATP酶染色結果Fig.1 Serial cross-section oflongissimus dorsi stained with ATPase注:A:對照組;B:乳酸菌組。

2.1.2 日糧添加乳酸菌對肌纖維密度的影響 由圖2可知,對照組和乳酸菌組的肌纖維密度無顯著性差異(P>0.05)。這說明日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊背最長肌的肌纖維密度無顯著影響。對照組和乳酸菌組的肌纖維密度分別為721.0443和784.8612 N/mm2,說明日糧添加乳酸菌具有增加肌纖維密度的趨勢。

圖2 蘇尼特羊背最長肌的肌纖維密度Fig.2 Muscle fiber density inlongissimus dorsi of Sunit sheep注:字母相同表示差異不顯著(P>0.05),字母不同表示差異顯著(P<0.05);圖3～圖6同。

2.1.3 日糧添加乳酸菌對肌纖維數量比例的影響 如圖3所示,與對照組相比,日糧添加乳酸菌顯著提高了蘇尼特羊背最長肌的Ⅰ型肌纖維的數量比例(P<0.05),而對ⅡA型和ⅡB型肌纖維的數量比例無顯著影響(P>0.05)。這說明乳酸菌具有提高Ⅰ型肌纖維數量比例的作用。該結果與Chen等[15]的研究結果一致,即給小鼠飼喂植物乳桿菌TWK10后發現,小鼠腓腸肌中Ⅰ型肌纖維的數量比例顯著升高,且呈劑量依賴性。乳酸菌代謝可產生乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等有機酸,且有研究表明,丁酸鈉對小鼠氧化型肌纖維的形成有促進作用[16],因此我們可以推測,代謝物丁酸可能作為一種中間物質,影響肌纖維的組成。

圖3 蘇尼特羊背最長肌各型肌纖維的數量比例Fig.3 Muscle fiber number compositionin longissimus dorsi of Sunit sheep

2.1.4 日糧添加乳酸菌對肌纖維面積比例的影響 如圖4所示,日糧添加乳酸菌提高了蘇尼特羊背最長肌的Ⅰ型肌纖維的面積比例(P=0.052),降低了ⅡA型和ⅡB型肌纖維的面積比例(P>0.05)。分析其原因可能是乳酸菌能改善微生態平衡,腸道微生物群在能量平衡和身體組成方面參與了宿主代謝表型的形成,從而影響了肌纖維組成。Yan等[17]將豬的腸道微生物轉移至無菌小鼠體內后研究發現,腸道微生物的轉移使無菌小鼠具有與豬相似的骨骼肌纖維特性,一些作者認為腸道微生物-肌肉軸可能存在,但一直沒有足夠的證據證明,而Yan等[17]的研究結果恰好證明了腸道微生物在骨骼肌的生長發育過程中發揮重要作用,與肌纖維特性密切相關。

圖4 蘇尼特羊各型肌纖維的面積比例Fig.4 Muscle fiber area compositionin longissimus dorsi of Sunit sheep

對比了兩組蘇尼特羊背最長肌的肌纖維特性后發現,兩組的肌纖維密度無顯著性差異,但乳酸菌組具有較高的Ⅰ型肌纖維的數量比例和面積比例,這表明日糧添加乳酸菌有增加Ⅰ型肌纖維的數量比例和面積比例的趨勢。

2.2 日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊肌球蛋白重鏈表達量的影響

蘇尼特羊背最長肌MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx的基因表達量結果如圖5所示。

圖5 蘇尼特羊MyHCs基因的表達量Fig.5 Expression of MyHCs gene of Sunit sheep

根據肌球蛋白重鏈(MyHCs)的多態性,肌纖維可以分為Ⅰ型(慢速氧化型)、Ⅱa型(快速氧化型)、Ⅱb型(快速酵解型)和Ⅱx型(中間型)[18]。由圖5可知,乳酸菌組MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡx的基因表達量均高于對照組,且差異顯著(P<0.05)。而MyHCⅡb的基因表達量在兩組間沒有顯著性差異。可見,蘇尼特羊MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡx基因表達量受乳酸菌的影響較大。李敏華[19]通過研究微生態制劑對肥育豬肌纖維類型的影響后發現,乳酸菌具有提高肥育豬股二頭肌中MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡx的基因表達量的趨勢,與本實驗結果一致。

2.3 日糧添加乳酸菌對代謝酶活性的影響

由圖6可知,與對照組相比,日糧中添加乳酸菌顯著降低了蘇尼特羊背最長肌中LDH的活性(P<0.05),提高了MDH和SDH的活性(P>0.05)。這說明乳酸菌可以顯著降低蘇尼特羊宰后的糖酵解程度,提高肌肉的有氧代謝程度。方程[20]研究表明,MDH、SDH酶活性主要與氧化型肌纖維中的Ⅰ型肌纖維的數量比例成正相關。研究結果表明,LDH酶活性與ⅡB型肌纖維數量比例成正相關[21-22]。MDH和SDH均為有氧代謝途徑關鍵酶,其活性的升高說明乳酸菌使肌肉細胞有氧代謝程度增強,也間接證明了氧化型肌纖維含量升高。而LDH是糖酵解途徑關鍵酶,其活性的降低說明肌肉細胞無氧酵解程度降低,也說明了酵解型肌纖維含量的降低。

圖6 蘇尼特羊代謝酶活性Fig.6 Metabolic enzyme activity of Sunit sheep

2.4 日糧添加乳酸菌對肉品質的影響

由表2可知,與對照組相比,乳酸菌組的pH0、pH24、L*值、剪切力顯著降低(P<0.05),a*值顯著升高(P<0.05),而b*值和蒸煮損失在兩組間無顯著性差異。日糧添加乳酸菌顯著降低了pH0和pH24,該結果與胡新旭等[23]的研究結果相反,具體原因還有待進一步的研究。宰后肌肉中pH的降低主要是因為肌肉中的糖原經糖酵解過程轉化成乳酸積累在肌肉中,因此肌肉中的糖原含量會在很大程度上影響pH的下降程度。日糧添加乳酸菌具有降低ΔpH的趨勢(P>0.05),這可能是由于乳酸菌組的Ⅰ型肌纖維的數量比例顯著升高,而Ⅰ型肌纖維的糖原含量低于其他類型的肌纖維,因此當Ⅰ型肌纖維所占比例升高時,在一定程度上能減少肌肉中糖原含量,使糖原經糖酵解途徑生成乳酸的速率降低,從而延緩宰后pH的下降速率。韋良開等[24]的研究表明,日糧添加0.2%德氏乳桿菌可以顯著降低豬宰后45 min的b*值和宰后24 h的L*值。李菊等[25]研究發現,在肉雞日糧中添加0.5%的乳酸菌發酵液可降低肌肉剪切力,該結果說明乳酸菌能有效改善肌肉嫩度,對于增加肉的感官品質具有重要作用。此外,前文提到日糧添加乳酸菌增加了肌纖維密度,而普遍的研究認為,肌纖維密度越大,肉質越嫩[26]。可見,日糧添加乳酸菌可以明顯改善肉品質,相比每只羊每天額外增加的不足一元的成本,乳酸菌的使用將為牧民和企業帶來巨大的經濟效益。

表2 蘇尼特羊背最長肌肌肉品質Table 2 Meat quality traits in longissimus dorsi of Sunit sheep

2.5 相關性分析

由表3可知,pH0與MyHCⅡx基因表達量成極顯著負相關(P<0.01),pH24與Ⅰ型肌纖維的數量比例和面積比例成顯著負相關(P<0.05)。與對照組相比,乳酸菌組的pH24顯著降低,這可能是因為乳酸菌組的Ⅰ型肌纖維的數量比例和面積比例較高,且兩者之間的負相關關系恰好驗證了這一點。色澤也是評價肉品質的另一項重要指標。L*值與MyHCⅠ基因表達量成顯著負相關(P<0.05),a*值與Ⅰ型肌纖維的數量比例、MyHCⅡx基因表達量成顯著正相關(P<0.05)。Ryu等[27]研究同樣發現,Ⅰ型和ⅡA型肌纖維與肉的色澤成正相關,而ⅡB型肌纖維則與其成負相關。這正是因為氧化型肌纖維所含肌紅蛋白和血紅蛋白的含量高,因此,當肌肉中氧化型肌纖維所占比例較高時,肌肉顏色鮮紅,肉色評分較高。肌纖維特性亦與肌肉嫩度密切相關。Hwang等[10]對韓國本土牛的肌纖維特性與肉質性狀間的關系進行研究后發現,牛肉的剪切力與ⅡB型肌纖維的面積比例成正比,與Ⅰ型肌纖維的面積比例成反比。本研究結果顯示,剪切力與Ⅰ型、ⅡA型肌纖維的數量比例、面積比例,與MyHCⅠ、MyHCⅡa基因表達量成負相關(P>0.05)。這可能是因為Ⅰ型肌纖維含有較多的中性脂肪,使得肌肉的肌內脂肪增加,從而導致剪切力降低,嫩度升高[28]。此外,Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的直徑較小,而大量研究已經表明,肌纖維直徑與剪切力成正相關,這也再次證明乳酸菌通過提高Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的數量,使肌肉的整體肌纖維直徑變小,從而改善肌肉嫩度。肌肉系水力也與肌纖維類型有直接關系,高含量的酵解型肌纖維會導致肌肉系水力的下降[29]。同理,氧化型肌纖維所占比例較高有利于提高肌肉的系水力,這與本實驗結果一致,即蒸煮損失與Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的數量比例成負相關(P>0.05)。綜上所述,氧化型肌纖維中肌紅蛋白含量高,糖原含量和ATP酶活性較低,肌纖維直徑較小,厭氧酶含量低,有氧代謝能力強,因此,氧化型肌纖維所占比例較高時,肌肉的色澤、pH較好,肌肉細嫩,肉質好[30]。

表3 肌纖維特性、MyHCs基因表達量與肉品質的相關性Table 3 Correlation between muscle fiber characteristics,MyHCs gene expression and meat quality

3 結論

通過在日糧中添加乳酸菌可以提高蘇尼特羊背最長肌中氧化型肌纖維(Ⅰ型、ⅡA/Ⅱa型)的數量比例,降低LDH酶活性,使L*值、剪切力降低,a*值升高,這說明日糧添加乳酸菌可以減緩宰后肌肉pH下降,改善肌肉色澤、嫩度。通過相關性分析發現,pH0與MyHCⅡx基因表達量成極顯著負相關,pH24與Ⅰ型肌纖維的數量比例和面積比例成顯著負相關。L*值與MyHCⅠ基因表達量成顯著負相關,a*值與Ⅰ型肌纖維的數量比例、MyHCⅡx基因表達量成顯著正相關。這說明氧化型肌纖維比例高對提高肉品質有促進作用,而本實驗得出乳酸菌可以提高氧化型肌纖維的數量比例,由此可知,日糧添加乳酸菌會影響肌纖維類型,進而影響肉質。因此,在未來畜牧業,可以將乳酸菌作為飼料添加劑應用于日糧中,從而提高羊肉品質。