EBF1-shRNA對肺腺癌細胞體內(nèi)外生物學特性的影響

王琳，李丁，秦婷婷，任麗

近年來，肺癌發(fā)病率逐年上升，5年生存率僅為15%［1］；其中約85%是非小細胞肺癌（NSCLC），而肺腺癌是女性和非吸煙者NSCLC的常見類型［2］。肺腺癌的控制已成為全世界廣泛關(guān)注的問題，研究肺腺癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移對改善肺腺癌患者預(yù)后具有積極意義，但至今仍缺乏針對肺腺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移更有效的治療方法［3-4］。已有研究證實，腫瘤的形成往往是由基因突變引起，包括癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活或缺失［5］。研究顯示，肺腺癌通常缺失INK4a/ARF 位點，其編碼2 種抑制蛋白p16INK4a和p14ARF，是細胞周期蛋白依賴激酶（cyclin dependent kinase，CDK）抑制劑，能夠調(diào)節(jié)細胞周期［6］。另有研究發(fā)現(xiàn)，兒童急性淋巴細胞白血病中早期B 細胞因子1（EBF1）表達缺失或功能缺陷與腫瘤細胞增殖相關(guān)［7-8］。本研究通過抑制肺腺癌細胞中高表達EBF1基因，對可能影響肺腺癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑儀器 SPF級雌性Balb/c Nu/Nu裸鼠8 只，體質(zhì)量18～20 g，6～8 周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物使用許可證：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于獨立通風籠中，恒溫恒濕，喂飼滅菌裸鼠飼料，飲用雙蒸水。肺癌組織及癌旁組織芯片（上海芯超公司）。Laemmli Sample Buffer（美國BIO-RAD 公司）；EBF1一抗（羊抗鼠及兔抗人，美國Sigma公司）；CDK6一抗（兔抗人）、P21一抗（兔抗人）、P27 一抗（兔抗人）購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；GAPDH 一抗（鼠抗人）、β-actin 一抗（鼠抗人）購自美國BD Biosciences 公司；Western blot二抗（北京碧云天公司）；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，BrdU試劑盒（美國Roche公司）。pSUPE-Pretro-Nea-EBF1 及自由序列購自Sigma，逆轉(zhuǎn)錄及PCR 試劑盒購自Thermo。超微量分光光度計Nanodrop2000（美國Thermo 公司）；酶標儀BioTel Synergy H2（美國BioTek公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色檢測EBF1 在肺癌及癌旁組織中的表達 組織芯片室溫梯度乙醇脫蠟、水化，檸檬酸鈉熱抗原修復(fù)后滴加3%過氧化氫滅活內(nèi)源酶活性，10%山羊血清封閉30 min，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，0.5%氨水反藍后梯度乙醇脫水，涼干后滴加中性樹膠封片。以出現(xiàn)明顯棕色或黃色顆粒為陽性。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 肺腺癌細胞系：A549、H441；小細胞肺癌細胞系：H209、H1155；正常對照細胞系：正常支氣管上皮細胞系HBE及正常肺上皮細胞系Beas-2B，上述細胞均購自ATCC。用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將細胞轉(zhuǎn)染pSUPE-Rretro-Neo-EBF1 和自由序列分別作為實驗組（shRNA-EBF1組）及對照組（shRNA-control組）。

1.2.3 PCR 檢測EBF1在各細胞系中的表達 提取細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA單鏈。以cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參基因，PCR檢測EBF1的表達。引物序列：EBF1上游5'-AAAGCATCCAACGGAGTGGA -3'，下游 5' -TTCCA ATCTGCGGAAATTCCA-3'，擴增片段長度562 bp。PCR擴增條件：50 ℃2 min；95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃1 min，36個循環(huán)，擴增產(chǎn)物在含0.5%溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳中分離。

1.2.4 Western blot 檢測A549 細胞EBF1、CDK6、P21、P27 表達 將轉(zhuǎn)染48 h的A549細胞用預(yù)冷的含有5%β-巰基乙醇的蛋白提取緩沖液滴加到細胞培養(yǎng)皿中提取細胞總蛋白，超微量分光光度計測定蛋白濃度，取50 μg蛋白在SDS-PAGE進行電泳分離后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗滌，滴加一抗羊抗鼠及人EBF1（1∶200）、兔抗人CDK6（1∶200）、兔抗人P21（1∶500）、兔抗人P27（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗兔抗羊（1∶2 000）、羊抗兔（1∶1 000）孵育后，ECL化學發(fā)光和曝光顯影，Image J軟件分析灰度值，計算目的蛋白相對表達量。EBF1表達水平以GAPDH為內(nèi)參，CDK6、P21、P27表達水平以β-actin為內(nèi)參。

1.2.5 MTT法檢測A549細胞及H441細胞增殖能力 收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至1×103個/孔，接種于96孔板中，培養(yǎng)基總量為200 μL，每組細胞設(shè)15個復(fù)孔。待細胞貼壁每組取3孔細胞，加入10 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h后終止實驗，利用酶標儀檢測各孔490 nm處的光密度（OD）值。每24 h檢測1次，連續(xù)測5 d，繪制生長曲線，以對照組生長曲線作為參考，比較實驗組細胞生長情況。

1.2.6 BrdU 實驗檢測A549 及H441 細胞增殖能力 收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至1×103個/孔，接種于96孔板中，每孔含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基100 μL，5%CO2，37 ℃孵育過夜，每組設(shè)3個復(fù)孔，加入10 μmol BrdU（10 μL/孔），37 ℃孵育過夜，輕拍96孔板棄去上清，使用Cell Proliferation ELISA，BrdU 試劑盒加入FixDenat（bottle2）200 μL/孔，室溫孵育30 min，輕拍96孔板棄去上清，加入100 μL/孔BrdU 抗體室溫孵育90 min，輕拍96 孔板棄去上清，加入200 μL/孔洗液，輕拍96 孔板棄去上清，加入100 μL/孔顯色底物，30 min 內(nèi)酶標儀在450 nm及690 nm處測量各孔的OD值，去除本底，計算ΔOD=OD450-OD690，以此代表細胞增殖過程中BrdU摻入量，即表明細胞增殖能力。

1.2.7 細胞劃痕實驗檢測A549 細胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染shRNA-EBF1 及shRNA-control 的A549 細胞分別接種于6 孔板，待細胞約70%融合時，用200 μL加樣槍槍頭在培養(yǎng)皿上劃痕，PBS沖洗3遍，分別于劃痕時及培養(yǎng)24 h時對劃痕線拍照，計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h 邊緣距離-24 h 時邊緣距離）/0 h邊緣距離×100%。

1.2.8 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 將Matrigel 膠用RPMI 1640 培養(yǎng)基以1∶20 稀釋，在Transwell 小室中加入100 μL，37 ℃孵育4 h。用不含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)整A549細胞濃度為5×104/mL，取200 μL細胞鋪于上室，下室中加入500 μL含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h后，取出小室，PBS沖洗3遍，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，加入0.5%結(jié)晶紫染色10 min，PBS 沖洗，棉簽輕輕擦去表面細胞。隨機拍照5個視野，并計算穿膜細胞數(shù)。

1.2.9 體內(nèi)成瘤實驗 8 只裸鼠按照隨機數(shù)字表法分為2組，每組各4 只，分別皮下注射A549-shRNA-EBF1 及A549-shRNA-control。將2組細胞分別胰酶消化制成單細胞懸液，用PBS調(diào)整細胞濃度為5×107/mL。按無菌操作要求，每只裸鼠單側(cè)腋窩皮下注射細胞懸液200 μL（1×107個細胞），4周后取出皮下腫瘤，拍照并稱質(zhì)量，同時采用Western blot 和免疫組化染色檢測瘤體內(nèi)EBF1的表達。

1.2.10 細胞周期測定 取對數(shù)生長期的細胞1×106個，用預(yù)冷75%乙醇于4 ℃固定過夜，1 500 r/min離心5 min，棄上清，以3 mL的PBS洗滌3次，加入400 μL溴化乙錠（PI，50 mg/L），100 μL RNase A（100 mg/L），4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀上機檢測，計算各種細胞中G0/G1期、S期及G2期細胞所占比例。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較用2獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EBF1在肺癌組織中的表達情況 EBF1在癌旁正常肺組織及肺癌組織的基質(zhì)細胞中不表達，但在非小細胞肺癌及小細胞肺癌細胞中表達，并且EBF1主要表達于肺癌細胞的細胞核中，見圖1。

2.2EBF1在肺癌細胞系中的表達情況 非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549 和H441 及小細胞肺癌細胞系H209 和H1155 中均檢測到EBF1基因表達，正常支氣管上皮細胞系HBE及正常肺上皮細胞系Beas-2B內(nèi)未見EBF1表達，見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染EBF1特異性shRNA抑制肺腺癌細胞在體內(nèi)外的增殖 Western blot 結(jié)果顯示，shRNA-EBF1組較shRNA-control 組EBF1 蛋白表達量降低，見圖3、表1。BrdU 實驗顯示shRNA-EBF1 處理后A549及H441細胞的增殖水平較shRNA-control明顯降低（P＜0.05），見表1。MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第3天開始，轉(zhuǎn)染shRNA-EBF1 的A549 和H441 細胞增殖能力明顯減弱，見圖4。小鼠體內(nèi)成瘤實驗發(fā)現(xiàn)，與shRNA-control 組相比，shRNA-EBF1組細胞形成的腫瘤平均質(zhì)量明顯降低，見表1、圖5；且shRNAEBF1組腫瘤內(nèi)EBF1表達明顯下降，見圖6。

2.4 轉(zhuǎn)染EBF1特異性shRNA抑制肺腺癌細胞的侵襲及遷移 劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，shRNA-EBF1 組細胞鋪片24 h 后遷移能力較shRNA-control 組細胞緩慢（P＜0.01），見圖7、表2。侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，shRNAEBF1組細胞侵襲能力較shRNA-control 組明顯下降（P＜0.01），見圖8、表2。

Fig.1 The expression of EBF1 in lung cancer and peripheral lung tissues（Immunohistochemical staining，×400）圖1 EBF1在癌旁組織及肺癌組織中的表達情況（免疫組化染色，×400）

Fig.2 The expression of EBF1 in lung cancer cell lines圖2 EBF1在肺癌細胞系中表達情況

Fig.3 EBF1 specific shRNA down-regulated its expression in A549 cells圖3 EBF1特異性shRNA下調(diào)其在A549表達情況

Tab.1 Comparison of EBF1 protein,cell proliferation level and ability of tumorigenicity between A549-shRNA-EBF1 group and shRNA-control group表1 shRNA-EBF1組和shRNA-control組細胞EBF1蛋白、細胞增殖水平及小鼠成瘤能力比較

Fig.4 Effects of EBF1 knockdown on cell growth curves圖4 下調(diào)EBF1后對細胞生長曲線的影響

2.5 EBF1-shRNA阻滯A549細胞周期于G1期 與shRNA-control 組相比，shRNA-EBF1 組G0/G1 期細胞比例明顯增加，而S 期細胞比例降低（P＜0.01），見表3。

2.6 EBF1-shRNA 下調(diào)A549 細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白CDK6的表達 與shRNA-control組相比，shRNAEBF1 組周期蛋白依賴激酶CDK6 表達下調(diào)，同時伴有P21、P27表達增高（P＜0.01），見圖9、表4。

Fig.5 Effects of EBF1 knockdown on the tumorigenicity of in mice圖5 下調(diào)EBF1對小鼠體內(nèi)成瘤能力的影響

3 討論

3.1EBF1基因研究現(xiàn)狀EBF1基因位于人染色體5q34，是B細胞發(fā)育所必需的轉(zhuǎn)錄因子，在B細胞分化和成熟中起著重要作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，在兒童急性淋巴細胞白血病中，EBF1表達缺失，在兒童高危B 前體淋巴細胞白血病（ALL）中，EBF1缺失的頻率更高［10-11］。尤其是EBF1-PDGFRB融合基因使癌細胞分化停滯在前B 細胞階段（由于EBF1 功能缺陷）和持續(xù)增殖階段（由于PDGFRB 激酶活性紊亂）［8］。Stone等［12］發(fā)現(xiàn)，EBF1和雌激素受體1（ESR1）與乳腺癌易感性增加有關(guān)。可以推測，EBF1在實體瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用，但其作用的分子機制，特別是對肺癌的影響，目前尚不清楚。

3.2EBF1對肺腺癌A549 細胞增殖的影響及作用機制 細胞周期可分為4 個階段：G1、S、G2 和M，它們與細胞增殖密切相關(guān)。細胞周期的異常調(diào)節(jié)對腫瘤發(fā)生機制具有重要意義。細胞周期進展受許多因素調(diào)節(jié)，如細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、CDK、CDK 抑制劑［13］。癌基因或抑癌基因與90%以上人類腫瘤中的細胞周期變化有關(guān)。其中，與G1期相關(guān)的基因變化頻率較高［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在A549 細胞中下調(diào)EBF1基因的表達能夠抑制其體內(nèi)外增殖，并且抑制A549細胞遷移及侵襲能力。一般而言，細胞生長抑制可能是由于細胞壞死、凋亡或者細胞周期阻滯導致。本研究發(fā)現(xiàn)，EBF1-shRNA 抑制A549細胞的增殖能力是通過將細胞阻滯在G1期引起的，而細胞周期與細胞增殖密切相關(guān)，表明EBF1-shRNA 通過下調(diào)EBF1在A549細胞中的表達，將A549細胞阻滯在G1期，從而抑制其在體內(nèi)外的增殖能力。

Fig.6 Expressions of EBF1 in tumorigenesis of mice after EBF1 knockdown(Immunohistochemical staining，×200)圖6 下調(diào)EBF1后小鼠體內(nèi)成瘤中EBF1表達情況（免疫組化染色，×200）

Fig.7 Effects of EBF1 knockdown on the migration of A549 cells圖7 下調(diào)EBF1對A549細胞遷移能力的影響

Fig.8 Effects of EBF1 knockdown on the invasion of A549 cells(crystal violet staining，×200)圖8 下調(diào)EBF1對A549細胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

Tab.2 Effects of down-regulating EBF1 on the migration and invasion ability of A549 cells表2 下調(diào)EBF1對A549細胞遷移及侵襲能力的影響（n=3，±s）

Tab.2 Effects of down-regulating EBF1 on the migration and invasion ability of A549 cells表2 下調(diào)EBF1對A549細胞遷移及侵襲能力的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別shRNA-control組shRNA-EBF1組t細胞遷移率（%）68.40±7.48 23.60±0.92 5.941＊＊穿膜細胞數(shù)（個/視野）92.33±13.30 34.67±4.33 7.140＊＊

Tab.3 Effects of down-regulating EBF1 on the cell cycle of A549 cells表3 下調(diào)EBF1對A549細胞周期的影響（n=3，±s）

Tab.3 Effects of down-regulating EBF1 on the cell cycle of A549 cells表3 下調(diào)EBF1對A549細胞周期的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別shRNA-control組shRNA-EBF1組t G0/G1期（%）33.58±1.41 42.06±0.99 4.914＊＊S期（%）49.49±0.83 39.23±0.79 9.005＊＊G2期（%）14.74±0.89 15.49±0.50 0.736

Fig.9 Effects of EBF1 knockdown on cell cycle regulation related proteins圖9 下調(diào)EBF1對細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的影響

Tab.4 The expression levels of CDK6,P21 and P27 after EBF1 knockdown in A549 cells表4 A549 細胞中下調(diào)EBF1后CDK6、P21及P27表達水平的影響

細胞周期蛋白表達豐度的改變可導致不受控制的細胞增殖甚至腫瘤［15］，其中在G1 期起作用的P21、P27蛋白最具代表性［16-17］。相關(guān)研究表明，P21及P27 蛋白表達的減少將導致細胞的異常增殖［18-19］。因此，為了進一步探討沉默EBF1基因的表達抑制A549 細胞增殖的機制，筆者首先檢測了P21、P27 蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)shRNA- EBF1 組P21、P27蛋白表達上調(diào)。Kollmann 等［20］在研究淋巴瘤時發(fā)現(xiàn)，在p16INK4a缺失下，CDK6通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，促進增殖和刺激血管生成并起到促進腫瘤生長的功能。因此，筆者應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測了細胞中CDK6 蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)shRNA- EBF1 組CDK6蛋白表達下調(diào)。當然，EBF1調(diào)控A549細胞增殖過程中是否也通過調(diào)控VEGF影響血管生成還需要以后進一步的實驗加以證實。

綜上所述，沉默EBF1基因的表達可將A549 細胞阻滯在G1 期而影響其增殖能力，同時伴有P21/P27表達水平的增高和CDK6蛋白表達下降，但這還需要進一步研究來證實。