IRX5促進肝癌細胞的侵襲遷移及其與miR-136-5p靶向關系的驗證

代龍光，朱麗英，2，沈婕，錢雯，張競之，朱金鳳，許永劼，劉歆蕾，許雯，朱科靜，張令，潘衛，3，李興，4△

肝癌是常見的消化系統腫瘤之一，是全球第六大常見的腫瘤，也是全球癌癥死亡的第四大原因［1］。肝細胞癌是原發性肝癌的主要病理類型，約占原發性肝癌的80%［2］。研究顯示肝癌的5 年生存率不足20%，侵襲與轉移是肝癌重要的生物學特征，轉移和復發是引起肝癌患者死亡的主要危險因素［3］。因此探索肝癌轉移和侵襲的發生機制是改善肝癌患者生存狀況的關鍵。miR-136-5p屬于非編碼RNA，其可在轉錄水平調控下游靶基因RAP2C［4］、MTDH［5］等的表達。有研究表明，miR-136-5p與胃癌［6］、肺鱗癌［7］等腫瘤的發生發展密切相關，但是其在肝癌中的研究報道尚少見。易洛魁族同源盒基因5（Iroquois homeobox gene 5，IRX5）編碼蛋白屬于核轉錄因子，過表達IRX5可促進舌鱗狀細胞癌的增殖、侵襲和遷移［8］，敲低IRX5 表達可抑制前列腺癌細胞活力、增加細胞凋亡［9］。本課題組前期研究發現，IRX5 在肝癌中高表達，運用生物信息學分析發現，IRX5 可能為miR-136-5p 的靶基因［10］。本研究旨在進一步探究IRX5 對肝癌細胞侵襲與遷移的影響，并且驗證miR-136-5p 與IRX5 是否存在靶向關系，為肝癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 293T 細胞和肝癌SMMC7721 細胞購自中國科學院細胞庫。空載質粒（pcDNA3.1）、過表達IRX5 質粒（pcDNA3.1-IRX5）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；敲低IRX5 質粒（sh-IRX5）、陰性對照質粒（sh-NC）由重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室提供；pGL3-Control載體由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 質粒試劑盒購自廣州美基公司；高保真酶PrimeSTAR?HS、限制性內切酶XbaⅠ、T4 DNA 連接酶購自大連TaKaRa公司；脂質體2000購自美國Invitrogen公司；DualGlo?Luciferase Assay System 購自美國Promega公司；DMEM、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自以色列BI公司；Transwell小室購自美國Corning公司；結晶紫購自碧云天技術有限公司。兔源IRX5 抗體（Abcam公司，英國），鼠源GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，中國），山羊抗鼠二抗（Affinity公司，美國），山羊抗兔二抗（Bioworld公司，中國）。倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本），DNA 電泳儀（北京六一生物科技有限公司，中國），PCR 儀（ABI公司，美國），多功能酶標儀（Bio-Tek公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 293T 細胞和肝癌SMMC7721 細胞采用10%胎牛血清的完全培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期肝癌SMMC7721 細胞，按1×106個細胞/孔接種于6孔板中，細胞融合度達60%時進行轉染。過表達IRX5 實驗設2 組：空載質粒（pcDNA3.1）組和過表達IRX5（pcDNA3.1-IRX5）組；敲低IRX5實驗設陰性對照（sh-NC）組和敲低IRX5（sh-IRX5）組；48 h 后觀察轉染細胞中綠色熒光蛋白的表達情況，并拍照。

1.2.2 Western blot 檢測IRX5 的轉染效率 肝癌SMMC7721細胞轉染72 h 后提取細胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE 分離目的蛋白并轉印至PVDF 膜上，脫脂牛奶封閉2 h。將PVDF 膜置于一抗GAPDH（1∶2 000）、IRX5（1∶500）中4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后，將膜置于羊抗鼠二抗（1∶4 000）、羊抗兔二抗（1∶10 000）中室溫孵育2 h，ECL顯影并用化學發光系統采集數據，Image J軟件分析灰度值，計算各組目的蛋白的相對表達量。

1.2.3 劃痕實驗 將轉染后的肝癌SMMC7721細胞接種到6孔板中，當細胞融合度達90%時，用200 μL的吸頭劃線，PBS清洗后加入無血清培養基，劃痕0 h、48 h時拍照。Image J軟件測定劃痕面積，計算細胞遷移率=（0 h劃痕面積-48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.4 Transwell實驗 （1）遷移實驗參照文獻［11］進行。在Transwell 上室加入100 μL 無血清培養基，將600 μL 的完全培養基加入Transwell 下室中，將肝癌SMMC7721 細胞按4×104個/孔加入到上室中，置于培養箱中培養24 h，4%多聚甲醛室溫固定15 min，清洗小室并風干，1%結晶紫染色15 min，再次清洗、風干后顯微鏡下拍照，并計數細胞數量。（2）侵襲實驗。將100 μL Matrigel 基質膠加入Transwell 上室中，置于培養箱中孵育2 h。在下室中加入100 μL 完全培養基，37 ℃孵育30 min，后續鋪板、固定、染色操作與遷移實驗相同。

1.2.5 生物信息學軟件預測miRNA 和結合位點 采用miRNA 靶基因預測軟件miRanda（http：//www.microrna.org）和Targetscan（http：//www.targetscan.org）預測可能與IRX5 結合的miRNA及位點。

1.2.6 野生型和突變型IRX5 3'UTR雙熒光素酶報告基因質粒的構建 野生型質粒pGL3-IRX5-3'UTR構建方法參照文獻［11］，采用SMMC7721細胞基因組DNA為模板，IRX5-3'UTR引物上游5'-GCTCTAGATAGATGGCCTTGGCAGTTATTTTTCC-3'，下游5'-GCTCTAGAAGAGACCAAGGCAATGGACAGTTTAT-3'進行PCR擴增；50 μL反應體系：2×PrimeSTAR HS（Premix）25 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、基因組DNA模板2 μL、ddH2O 21 μL；反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃延伸3 min。然后進行DNA凝膠電泳，按DNA Marker的指示切取目的片段，并進行膠回收、純化。采用XbaⅠ酶切IRX5-3'UTR、pGL3-Control載體，用T4 DNA連接酶連接，產物轉化到50 μL的DH5α感受態細胞中，并進行涂平板。挑取陽性克隆至液體LB培養基中繼續培養14 h，提取質粒，酶切后瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定；質粒DNA堿基測序委托上海生工公司完成。突變型質粒（pGL3-IRX5-3'UTRMut）委托武漢金開瑞公司合成。

1.2.7 雙熒光素酶實驗分組及結果測定 取對數生長期293T 細胞以5 000 個/孔接種于96 孔板，進行雙熒光素酶實驗。根據雙熒光素酶報告基因質粒的不同進行分組，設野生型質粒+陰性對照（IRX5-3'UTR-Wt+NC）組和野生型質粒+miR-136-5p（IRX5-3'UTR-Wt+miR-136-5p）組；突變型質粒+陰性對照（IRX5-3'UTR-Mut+NC）組和突變型質粒+miR-136-5p（IRX5-3'UTR-Mut+miR-136-5p）組。按野生型質粒或突變型質粒200 ng/孔，NC 或miR-136-5p 200 nmol/L 進行轉染。48 h后檢測熒光素酶活性，步驟如下：每孔中加入100 μL 1×PLB 置于搖床上裂解15 min，取澄清的細胞裂解產物10 μL 加入EP 管中，緩慢吹打2～3 次，立即讀取熒光素酶活性值；然后加入50 μL 終止液，緩慢吹打4～5 次，立即讀取海腎熒光素酶活性結果。計算各組熒光素與海腎熒光素的相對活性值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2 組比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IRX5轉染效率的驗證 轉染48 h后，觀察表達綠色熒光蛋白的細胞達85%以上，見圖1。過表達IRX5 組IRX5 蛋白表達水平明顯高于空載質粒組（n=3，t=4.041，P＜0.05）；敲低IRX5 組IRX5 蛋白表達水平明顯低于陰性對照組（n=3，t=5.716，P＜0.01），見圖2。

Fig.1 Expression of green fluorescent protein 48 h after transfection(×40)圖1 轉染48 h后綠色熒光蛋白的表達情況（×40）

Fig.2 The expressions of IRX5 proteins detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測IRX5蛋白的表達變化

2.2 IRX5 對肝癌細胞侵襲與遷移能力的影響 劃痕實驗結果顯示，劃痕48 h 后，過表達IRX5 組肝癌細胞遷移率高于空載質粒組（P＜0.01）；敲低IRX5組肝癌細胞遷移率低于陰性對照組（P＜0.01）。Transwell實驗結果顯示，過表達IRX5組肝癌細胞遷移及侵襲數量均明顯高于空載質粒組（均P＜0.01）；敲低IRX5 組肝癌細胞遷移及侵襲數量均明顯低于陰性對照組（P＜0.05或P＜0.01），見表1、2，圖3。

2.3 IRX5 結合miRNA 和結合位點的預測 通過miRanda、Targetscan 軟件預測，miR-136-5p 與IRX5匹配累計權重得分為-0.15，匹配度較高；并進一步預測，IRX5 與miR-136-5p 存在1 個潛在的結合位點，見圖4。

Tab.1 Effects of overexpression IRX5 on migration and invasion of SMMC7721 cells表1 過表達IRX5對SMMC7721細胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

Tab.1 Effects of overexpression IRX5 on migration and invasion of SMMC7721 cells表1 過表達IRX5對SMMC7721細胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

＊＊P＜0.01

組別空載質粒組過表達IRX5組t n 3 3細胞遷移率（%）58.58±1.66 82.00±1.99 15.662＊＊Transwell細胞遷移數（個）103.00±12.29 146.70±9.01 4.962＊＊Transwell細胞侵襲數（個）94.33±3.21 140.33±7.57 9.690＊＊

Tab.2 Effects of knockdown IRX5 on migration and invasion of SMMC7721 cells表2 敲低IRX5對SMMC7721細胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

Tab.2 Effects of knockdown IRX5 on migration and invasion of SMMC7721 cells表2 敲低IRX5對SMMC7721細胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別陰性對照組敲低IRX5組t n 3 3細胞遷移率（%）58.89±0.47 40.66±1.71 17.776＊＊Transwell細胞遷移數（個）100.00±17.32 48.00±9.85 4.520＊Transwell細胞侵襲數（個）96.33±4.04 45.00±6.08 12.175＊＊

Fig.3 The results of Transwell assay(crystal violet,×200)圖3 Transwell實驗結果（結晶紫染色，×200）

Fig.4 Target sites and mutation sites for IRX5 bind to miR-136-5p圖4 miR-136-5p與IRX5結合的靶位點及突變位點

2.4 雙熒光素酶報告基因質粒的構建與鑒定 以SMMC7721 細胞基因組DNA 為模板，運用設計的IRX5-3'UTR 引物擴增目的片段，電泳結果顯示，1、6、7、8、9 號樣本在564 bp 處有明顯的擴增條帶，與目標片段大小一致，見圖5。將重組的野生型pGL3-IRX5-3'UTR雙熒光素酶質粒用XbaⅠ進行酶切，電泳結果顯示1、2、3、5 號為酶切陽性結果，酶切后存在2 個片段，分別位于564 bp 和6 000 bp 左右，與預期一致，進一步驗證IRX5-3'UTR 片段與pGL3-Control 載體連接成功，見圖6。IRX5-3'UTR 野生型質粒測序結果表明，測序序列與構建片段序列結果一致，結合位點位于126～132 bp，見圖7。IRX5-3'UTR 突變質粒反向測序結果顯示，測序序列與構建突變片段序列結果一致，其中突變堿基位于508～514 bp，見圖8。

Fig.5 The amplification products of 5 IRX5-3'UTR圖5 IRX5-3'UTR擴增產物

Fig.6 The enzyme cutting identification result of PGL3-IRX5-3'UTR plasmid圖6 PGL3-IRX5-3'UTR質粒酶切鑒定結果

Fig.7 PGL3-IRX5-3'UTR wild-type plasmid sequencing results圖7 PGL3-IRX5-3'UTR野生型質粒測序結果

Fig.8 PGL3-IRX5-3'UTR mutant plasmid sequencing results圖8 PGL3-IRX5-3'UTR突變型質粒測序結果

2.5 雙熒光素酶實驗結果 雙熒光素酶實驗結果顯示，IRX5-3'UTR-Wt+miR-136-5p 組雙熒光素酶活 性 明 顯 低 于IRX5-3'UTR-Wt+NC 組（n=3，t=40.880，P＜0.01）；IRX5-3'UTR-Mut+miR-136-5p組雙熒光素酶活性與IRX5-3'UTR-Mut+NC 組差異無統計學意義（n=3，t=0.020，P＞0.05），見圖9。

Fig.9 Results of luciferase activity in four groups圖9 各組雙熒光素酶活性結果

3 討論

轉錄因子與腫瘤的轉移密切相關，其通過上皮間質轉化、降解細胞外基質進而增強腫瘤細胞的侵襲與遷移能力，最終導致腫瘤的轉移，因此轉錄因子被認為是參與腫瘤轉移過程的關鍵因素［12］。IRX5在前列腺癌［9］、舌鱗狀細胞癌［8］、結直腸癌［13］等惡性腫瘤中表達上調，提示IRX5與腫瘤的發生發展密切相關。Zhu 等［13］研究發現，IRX5 的表達水平與結腸癌患者總生存率呈負相關。Myrthue 等［9］研究發現，IRX5可通過下調p53的表達而抑制前列腺癌細胞的凋亡。Huang 等［8］研究發現，舌鱗狀細胞癌中IRX5表達上調可促進腫瘤細胞的侵襲與遷移。然而王亞玲［14］研究發現，IRX5在高轉移性乳腺癌中的表達水平降低，且過表達IRX5 可以抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲與遷移。目前IRX5 在肝癌中的研究報道尚少見。本研究結果顯示，過表達IRX5可促進肝癌細胞的侵襲與遷移，敲低IRX5表達則抑制肝癌細胞的侵襲與遷移，提示IRX5在肝癌中發揮促癌作用。

有研究表明，miRNA在腫瘤中以miRNA-mRNA模式參與腫瘤的細胞周期、細胞凋亡、細胞自噬、新生血管的形成、細胞轉移等過程［15］。Han 等［5］研究發現，在三陰型乳腺癌中，miR-136-5p 通過與MTDH靶向結合抑制腫瘤細胞增殖、侵襲與遷移，進而抑制腫瘤的進展。Li等［16］研究發現，在膠質瘤中，miR-136-5p通過靶向結合Bcl-2和Wnt2，抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，提示miR-136-5p 可以抑制腫瘤的進展。Dong 等［17］研究發現在肝癌中miR-136-5p表達下調，且通過生物信息學分析發現IRX5是miR-136-5p 的下游靶基因之一，提示miR-136-5p 可能通過IRX5 發揮抑癌作用。本研究構建了野生型和突變型IRX5 3'UTR 雙熒光素酶報告基因質粒，并采用雙熒光素酶實驗發現miR-136-5p能夠降低野生型IRX5-3'UTR 的熒光素酶活性，對突變型IRX5-3'UTR 的熒光素酶活性無明顯影響，證實IRX5 是miR-136-5p 的 靶 基 因，miR-136-5p 通 過IRX5發揮抑癌作用。

綜上所述，IRX5能夠促進肝癌細胞的侵襲與遷移，生物信息學預測和雙熒光素酶實驗證實了IRX5與miR-136-5p之間的靶向關系，這為明確肝癌轉移和侵襲的發生機制提供了新的實驗基礎，也為肝癌的臨床治療提供了新的方向。