褪黑素增強紫杉醇對膀胱癌T24細胞增殖的抑制作用

陳歡，朱佳斌，趙曉瑾，董傳江△，董自強△

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤［1］，也是全球第十大最常見的癌癥。在2018年，全球估計有54.9萬新發病例和20萬死亡病例；膀胱癌在男性中的發病較女性更常見，其發病率和死亡率是女性的4 倍［2］。近20 年來，我國膀胱癌的發病率呈明顯上升趨勢，居男性惡性腫瘤發病率第六位［3］，尋找治療膀胱癌的新靶點是目前臨床研究的重點。根治性膀胱切除術并輔以化療是目前治療膀胱癌的主要方法［4］。但是，對于發生轉移的膀胱癌，患者的5 年生存率仍然很低［5-6］。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是國際上繼阿霉素和含鉑類抗癌藥物之后的熱點抗腫瘤藥物，其作用機制是通過抑制增殖細胞的有絲分裂、誘導細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞死亡［7］。紫杉醇對膀胱腫瘤具有顯著的療效，是目前所知單藥治療膀胱腫瘤最好的化療藥物。褪黑素（melatonin，Mel）是脊椎動物松果體的主要分泌產物，具有調節晝夜節律、睡眠、情緒、繁殖等生理作用［8］。先前的研究表明，褪黑素具有抗增殖、抗炎和抗腫瘤的作用［9］。本研究旨在觀察褪黑素能否增強紫杉醇對膀胱癌細胞增殖的抑制作用，并探討其作用機制，為褪黑素協同紫杉醇治療膀胱癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑與儀器 PTX（純度＞98%，購自美國sigma 公司）溶解于DMSO 中，儲備液濃度500 μmol/L。Mel（純度＞98%，購自百靈威）溶解于DMSO 中，儲備液濃度500 mmol/L。CCK-8 檢測試劑購自Bimake 公司；環氧化物酶-2（COX-2）抗體、p-p65/p65 抗體、p-IκBα/IκBα 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；核轉錄因子-kappa B（NF-κB）熒光素酶報告基因質粒購自碧云天生物技術公司；LipoFiterTM轉染試劑購自漢恒生物科技有限公司；Dual-Luciferase 檢 測 試 劑 盒 購 自Promega 公 司；RNAiso Plus 和PrimeScriptTMRT-PCR Kit 購自TaKaRa 公司。超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司；紫外分光光度儀購自Thermo公司；高速低溫離心機、臺式常溫離心機購自美國Eppendorf公司；多功能酶標儀購自美國Peridn Elmer公司；Western blot儀器購自北京六一生物科技有限公司；CO2培養箱購自美國Thermo公司。

1.2 細胞系和細胞培養 人膀胱癌細胞株T24 購自美國模式培養物集存庫（American typeculture collection，ATCC）。細胞培養于37 ℃含5%CO2（體積分數）的培養箱中。使用添加有10%（體積分數）胎牛血清及100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中進行細胞培養，待貼壁生長至90%時使用胰蛋白酶消化傳代。

1.3 CCK-8 實驗檢測T24 腫瘤細胞存活率 取對數生長期T24 細胞，按6×104/mL 密度接種于96 孔培養板內，同時以不含細胞的培養液作為調零孔，100 μL/孔。37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后，實驗組中分別加入含不同濃度褪黑素和（或）紫杉醇培養液，褪黑素終濃度為0.25、0.50、0.75和1 mmol/L，紫杉醇終濃度為5、10、25和50 nmol/L，對照組中加入不含任何干預劑的培養液，每組設5個復孔。培養48 h后，除去上清培養基，加入新鮮的含10%CCK-8的培養基。繼續培養2 h，于酶標儀450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值，計算細胞的存活率（%）=（實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.4 藥物劑量及細胞分組 根據CCK-8 實驗結果，紫杉醇（5 nmol/L）聯合褪黑素（0.75 mmol/L）處理T24 細胞48 h 后，其抑制率接近半數抑制濃度（IC50），其濃度將作為后面的實驗濃度。T24細胞設對照組（DMSO處理）、褪黑素組、紫杉醇組、紫杉醇聯合褪黑素組。

1.5 平板克隆形成實驗檢測T24 細胞的克隆形成能力 取對數生長期的T24細胞，6孔細胞培養板中每孔接種1 500個細胞，在CO2恒溫孵育箱中培養24 h后，更換為新鮮的含有不同濃度藥物的10%FBS 培養基。24 h 后，更換為新鮮的10%FBS 培養基，繼續培養10 d。細胞經固定液（冰醋酸∶甲醇∶去離子水=1∶1∶8）固定后，0.1%結晶紫染液染色。

1.6 RT-PCR檢測COX-2 mRNA水平 各組加藥48 h后，收集膀胱癌細胞，Trizol 法提取各樣本細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，進行聚合酶鏈反應擴增。內參GAPDH 上游引物5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，下 游 引 物5'-CATCACGC CACAGTTTCC-3'，產物長度382 bp；COX-2 上游引物5'-TCACAGGCTTCCATTGACCAG-3'， 下游引物 5'-CCGAGGCTTTTCTACCAGA-3'，產物長度189 bp。PCR 反應條件為：94 ℃30 s；55 ℃30 s，72 ℃30 s，循環30次；72 ℃延伸5 min。以COX-2/GAPDH比值表示目的基因相對表達量。

1.7 Western blot 檢測蛋白表達 各組加藥48 h 后，收集膀胱癌細胞，用RIPA裂解液裂解細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBS 封閉2 h，加入COX-2（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）、p-p65（1∶500）、p65（1∶1 000）、p-IκBα（1∶500）、IκBα（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日洗滌后，加入二抗，室溫孵育1 h，ECL發光液顯色檢測。

1.8 Dual-Luciferase 報告基因檢測NF-κB 啟動子活性 取對數生長期的T24 細胞，以3×105個接種于6 孔板中。次日，無血清培養基饑餓4 h后，向每孔加入質粒-轉染試劑混合液（0.07 μg pRL-TK、1.5 μg pGL3-NF-κB 和3.75 μL LipoFiterTM轉染試劑），6 h 后，更換新鮮含有不同劑量藥物的培養基。24 h后，用Dual-Luciferase試劑盒檢測Luciferase熒光強度。

1.9 統計學方法 應用SPSS 17.0 統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，2 組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA）或析因設計方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 褪黑素聯合紫杉醇對T24 細胞存活率、細胞形態和克隆形成的影響 單因素方差分析顯示，與對照組相比，褪黑素、紫杉醇單獨或者協同給藥處理對T24 膀胱癌細胞均有明顯的抑制作用（P＜0.05），見圖1。紫杉醇單獨作用于T24 細胞48 h 的IC50為（19.5±2.7）nmol/L，紫杉醇聯合褪黑素（0.75 mmol/L）作用于T24細胞48 h的紫杉醇IC50為（6.8±1.2）nmol/L。褪黑素可以增強紫杉醇對T24 細胞生長的抑制作用，紫杉醇聯合褪黑素作用與紫杉醇單獨作用相比，褪黑素能夠明顯降低紫杉醇的IC50值。由此，選取0.75 mmol/L褪黑素和5 nmol/L紫杉醇作為后續實驗的給藥濃度。通過研究發現，與紫杉醇或褪黑激素單獨處理組相比，紫杉醇聯合褪黑素組中T24 細胞形態變化更加明顯，表現為細胞數目顯著減少，細胞形態變圓，變小，細胞與細胞間的接觸、絲狀偽足均顯著減少，見圖2。析因方差分析顯示，與紫杉醇組相比，聯合治療組中T24 細胞的克隆形成能力顯著降低，差異有統計學意義，見圖3。褪黑素可顯著影響紫杉醇的治療效果，聯合褪黑素處理組細胞克隆形成率（8%）顯著低于紫杉醇單獨處理組（53.7%）。

2.2 褪黑素聯合紫杉醇對T24 細胞COX-2 表達的影響 與對照組相比，紫杉醇組T24 細胞中COX-2的mRNA 和蛋白水平均明顯降低；與紫杉醇單獨治療組相比，聯合治療組T24 細胞中COX-2 的表達水平進一步降低，見圖4。

Fig.1 Effects of melatonin combined with paclitaxel on the survival rate of T24 cells圖1 褪黑素聯合紫杉醇對T24細胞存活率的影響

Fig.2 Effects of melatonin combined with paclitaxel on morphology of T24 cells(×25)圖2 褪黑素聯合紫杉醇對T24細胞形態的影響（×25）

Fig.3 Effects of melatonin combined with paclitaxel on the cloning of T24 cells圖3 褪黑素聯合紫杉醇對T24細胞克隆形成的影響

Fig.4 Effects of melatonin combined with paclitaxel on COX-2 expression in T24 cells圖4 褪黑素聯合紫杉醇對T24細胞COX-2表達的影響

2.3 褪黑素聯合紫杉醇對NF-κB 信號通路的影響 與對照組和紫杉醇組比較，聯合治療組中pp65/p65 和p-IκBα/IκBα 的水平顯著降低；此外，與紫杉醇組比較，聯合治療組NF-κB啟動子轉錄活性也顯著減低（P＜0.05），見圖5、6。

Fig.5 Effects of melatonin combined with paclitaxel on NF-κB signaling pathway圖5 褪黑素聯合紫杉醇對NF-κB信號通路的影響

Fig.6 Effects of melatonin combined with paclitaxel on transcriptional activity of NF-κB promoter圖6 褪黑素聯合紫杉醇對NF-κB啟動子轉錄活性的影響

3 討論

在膀胱癌的治療中，紫杉醇作為一種單藥治療膀胱腫瘤最好的化療藥物，在臨床上取得了一定的療效，但是其不良反應較多。為了增強紫杉醇的治療效果，減輕藥物帶來的不良反應，改善患者的預后，臨床中常采用紫杉醇聯合其他藥物治療膀胱癌，如吉西他濱、順鉑等。褪黑素是一種衍生自L-色氨酸的吲哚胺，在生物體中普遍存在，包括人類。褪黑素具有廣泛的生理作用，包括促進睡眠、晝夜節律、體溫調節、季節性繁殖、抗氧化和免疫調節等［10-11］。褪黑素能夠通過抑制NF-κB 信號通路抑制多種腫瘤的生長，包括膀胱癌、肝癌、結腸癌和白血病等［12-15］。許多研究證明，褪黑素是一種有效的抗癌藥物，并且成功用于不同類型癌癥的化療以及增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［13-14，16］。本研究發現褪黑素聯合不同濃度紫杉醇對T24膀胱癌細胞的抑制作用顯著高于單獨使用紫杉醇，在褪黑素（0.75 mmol/L）的作用下，可以明顯降低紫杉醇的IC50值。

COX-2 是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，與許多人類癌癥的發生有密切聯系，包括肺癌、乳腺癌、結腸癌等，其過度表達與患者預后不良高度相關［17-18］。COX-2 的表達受經典NF-κB 信號通路的嚴格調控［19-20］。COX-2 高表達于膀胱癌細胞中，可通過不同途徑促進膀胱腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡，增強癌細胞侵襲和轉移能力，參與膀胱癌的發生發展［21-23］。因此，抑制COX-2 表達可能是抑制膀胱癌進展的有效方法。本研究表明，褪黑素顯著增強紫杉醇抑制NF-κB信號通路的活性，表現為降低pp65/p65 和p-IκBα/IκBα 的蛋白表達水平。此外，褪黑素可增強紫杉醇抑制NF-κB啟動子的轉錄活性，從而抑制COX-2 的表達，提示褪黑素增強T24 細胞對紫杉醇的敏感性的原因之一可能是褪黑素增強紫杉醇抑制NF-κB 信號通路的活性及其啟動子的轉錄活性。

在體內實驗，研究者給予裸鼠褪黑素25 mg/kg劑量時，可明顯增加5-氟尿嘧啶的敏感性［13，24］。按照藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算［25］，成人（60 kg）褪黑素服用量為2 mg，符合美國食品藥品管理局（FDA）對于成人推薦劑量（1～3 mg）。紫杉醇用量為135～175 mg/m2，按照成人換算即45～66 μmol/L（體表面積為1.6 m2，血液量5.6 L）。因此，本研究中采用的劑量對人體的毒性在合理的范圍內。

總之，本研究表明褪黑素增強了紫杉醇抑制膀胱癌生長的能力，其機制為通過抑制NF-κB/COX-2信號傳導來實現褪黑素增強紫杉醇對膀胱癌細胞抑制作用。同時，本研究中采用的劑量對人體的毒性在合理的范圍。這為今后褪黑素協同紫杉醇治療膀胱癌提供了理論依據。