厚樸酚與和厚樸酚衍生物的合成、表征及體外抗炎及抗腫瘤活性評價

郭明鑫，廖世莉，吳 霞，王娟霞，陳德琪，史可欣，譚有珍，馮毅凡

廣東藥科大學新藥研發中心，廣州 510006

為了繼承和發展中藥，研究者在中藥植物中分離和提取了許多具有良好藥理活性的天然單體，并基于有機化學和藥物化學的理論基礎對先導化合物進行結構修飾，從而保持或提高先導化合物的藥理活性。厚樸酚(magnolol)與和厚樸酚(honokiol)(圖1)是從厚樸中分離得到的含有烯丙基雙酚的天然活性單體[1]，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[2,3]。相關實驗表明，厚樸酚可增強巨噬細胞的吞噬功能，下調絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)信號通路相關蛋白的表達[4,5]。和厚樸酚可以抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶、環氧合酶、谷氨酸過氧化物酶的產生，減少炎癥介質的釋放[6-8]。在抗細胞增殖方面，厚樸酚與和厚樸酚能抑制腫瘤細胞增殖、分化和轉移，并能抑制腫瘤血管生成[9]。

圖1 厚樸酚(a)與和厚樸酚(b)結構圖Fig.1 The chemical structures of magnolol(a) and honokiol(b)

然而，除了良好的藥理活性外，相對較差的溶解性影響了它的生物利用度和臨床療效[10]。毒性應該引起更多的關注[11]，厚樸酚與和厚樸酚對斑馬魚有很大的毒性[12]。同時，本課題組前期研究發現，厚樸酚與和厚樸酚對細胞有很強的毒性[13]。因此，作為一種具有一定潛力的先導化合物，對其進行結構改性是研究重點之一。研究人員發現，苯環上羥基被單甲基化或二甲基化的厚樸酚表現出良好的抗炎和抗皮膚癌活性，且厚樸酚甲基化產物的細胞毒性較厚樸酚明顯降低[14-16]。通過分子模擬平臺設計合成了一系列厚樸酚與和厚樸酚衍生物，酚羥基的甲基化衍生物對于Aβ蛋白和Tau蛋白的聚集均具有抑制作用[17]。另有研究表明，在厚樸酚苯環的羥基位置引入六元環，可以提高抗腫瘤活性，并且產物具有良好的水溶性(水溶性>1 000 mg/mL)[18]。Kim等[19]以和厚樸酚為原料，通過在酚羥基上引入酰基或葡萄糖，提高了其水溶性，并提高了其對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用。此外，研究還發現，當厚樸酚與和厚樸酚烯丙基上的雙鍵被部分或完全改變時，其抗腫瘤活性會顯著降低甚至消失[16,19,20]。因此，厚樸酚與和厚樸酚的烯丙基是抗腫瘤活性必需基團，而對其酚羥基的修飾則可改善其理化性質和藥理活性。

作為合成1，3，4-噁二唑環化的先驅，Gibson[21]于1962年描述了1，3，4-噁二唑環化的反應機理，此后越來越多的研究者致力于1，3，4-噁二唑類化合物的合成，并不斷嘗試各種新方法合成具有特定生物效應的1，3，4-噁二唑類衍生物。Dewangan等[22]以苯甲酸和苯酰氯為原料合成了21個1，3，4-噁二唑類化合物，考察其體內抗炎和鎮痛活性，結果顯示所有化合物的抗炎活性都比陽性藥吲哚美辛要強。BiJu等[23]以酰肼和醛為原料合成了九個具有1，3，4-噁二唑環的化合物，采用角叉菜膠誘導大鼠足腫脹法檢測九個化合物的抗炎和鎮痛活性，結果顯示化合物具有較好的抗炎和鎮痛活性，并且毒性較低。Ragab等[24]合成出13個含有二氫嘧啶的1，3，4-噁二唑類化合物，并對60多種癌細胞系進行了抗腫瘤篩查，篩選出白血病細胞株HL-60和MOLT-4效果最佳，可使MOLT-4細胞和HL-60細胞的細胞周期停滯在G2/M期，進而促細胞凋亡。胡昆等[25]設計合成鬼臼毒素4β-(1，3，4-噁二唑-2-氨基)衍生物，體外抗癌活性實驗表明，目標化合物對正常細胞的毒性均遠遠小于陽性對照，部分化合物顯示出較好的抗癌活性。

本課題組前期在厚樸酚的酚羥基上引入鏈狀烴基或三嗪環后活性結果顯示，其保留抗炎及抗腫瘤活性，并極大的降低了細胞毒性。因此，總結前人對構效關系的研究以及實驗室前期研究基礎上，在厚樸酚與和厚樸酚羥基的位置上引入酯基結構、酰肼結構及含氮雜環1，3，4-噁二唑結構，希望得到既能保持相當的生物活性，又能降低厚樸酚與和厚樸酚毒性的衍生物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

JASCO FT-IR-4600微型光譜儀、JASCO VV550紫外/可見分光光度計(JASCO Corporation，日本東京)；X-6型顯微熔點測定儀(北京技術公司，中國北京)；AVANCEⅢ-500型超導核磁共振儀、VECTOR22FT-IR傅里葉紅外光譜儀(Bruker Corporation，德國)；UPLC-Q-TOF-MS質譜儀、2487/2996高效液相色譜儀(Waters Corporation，美國)；Rigaku X射線衍射儀(Rigaku Corporation，日本東京)使用Cu-Kα輻射。本實驗所用化學試劑均為分析純；厚樸酚與和厚樸酚原料藥(純度大于98%)，購買于Merck公司；無水試劑均按常規方法處理，使用屈臣氏純凈水；磺胺、鹽酸萘乙二胺，購買于阿拉丁有限公司；胎牛血清(FBS)、高糖培養基(DMEM)及青霉素鏈霉素雙抗等生物試劑購買于Gibco公司。小鼠巨噬細胞(RAW264.7)、人乳腺癌細胞株(MCF-7)、人肝癌細胞株(HepG2)、人非小細胞肺癌細胞株(H1299、A549)，均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 厚樸酚與和厚樸酚衍生物的合成

1.2.1.1 合成策略

在圖1中所述反應條件下，烯丙基雙酚的酚羥基通過取代反應與溴乙酸甲酯反應生成MM酯和HM酯。該反應烷基化反應完全，所得MM酯和HM酯收率高，可通過簡單純化得到良好晶型。MM酯和HM酯與水合肼反應生成具有酰肼結構的MM和HM酰肼，隨后MM酰肼和HM酰肼通過與二硫化碳環合并與碘甲烷反應生成具有1，3，4-惡二唑結構的MM-522和HM-522。用高效液相色譜(HPLC)法對結晶后衍生物進行了純度測定，各衍生物的純度均在95%以上。

圖1 厚樸酚與和厚樸酚衍生物合成路線Fig.1 The synthetic routes of magnolol and honokiol derivatives.

1.2.1.2 MM酯與HM酯的合成

稱取0.01 mol厚樸酚或和厚樸酚，0.08 mol無水Na2CO3，加入潔凈的三口燒瓶中，加入50 mL無水甲醇，攪拌升溫至60～65 ℃，滴加入0.04 mol溴乙酸甲酯，加熱回流8 h。反應結束后，趁熱抽濾，濾液常溫放置，析出白色條狀結晶，得到化合物MM酯或HM酯。

1.2.1.3 MM酰肼與HM酰肼的合成

稱取0.01 mol MM 酯或HM酯，加入潔凈的三口燒瓶中，加入50 mL無水乙醇，攪拌升溫至沸點，滴加0.04 mol水合肼，加熱回流1 h。反應結束后，抽濾，濾液旋蒸至少量，加入少量純凈的去離子水，有白色沉淀析出，放置4 ℃冰箱過夜，抽濾，濾餅加適量乙腈重結晶，抽濾得MM 酰肼或HM酰肼。

1.2.1.4 1，3，4-惡二唑衍生物的合成

稱取0.01 mol MM 酰肼或HM酰肼，0.02 mol氫氧化鉀，加入潔凈的三頸燒瓶中。加入100 mL無水乙醇，攪拌加熱至沸點，滴加入0.02 mol二硫化碳溶液，加熱回流12 h，溫度降至室溫，抽濾，濾液旋干，加入100 mL去離子水加濃鹽酸調節pH=1～2，析出固體。取以上干燥的全部化合物，0.02 mol無水碳酸鉀，0.02 mol碘甲烷溶液加入三頸燒瓶，加入50mL無水乙醇，室溫攪拌12 h，抽濾，濾液加鹽酸調節pH至中性，抽濾，濾液旋干，加入適量pH=12的堿水，超聲30 min，抽濾，濾餅用無水乙醇反復重結晶得淡黃色膏狀固體為化合物MM-522或HM-522。

1.2.2 細胞實驗

1.2.2.1 MTT法測定衍生物的細胞毒性及抗腫瘤活性

將對數生長期生長良好的細胞，通過傳代處理，調整細胞密度為5×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。細胞均勻貼壁后，吸去培養液，設調零組(僅含培養基)、空白組(含細胞、培養基)、給藥組(含細胞、培養基、藥物)，給藥組加入濃度梯度的含藥完全培養基100 μL，分別為6.13、12.25、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μM，每個濃度平行6個復孔，調零組和空白組加入同等體積的完全培養基。于培養箱培養24 h后，吸棄上清液，每孔加入100 μL含MTT的培養基，37 ℃培養4 h。小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震搖10 min混勻，酶標儀490 nm測定吸光度，計算細胞存活率。同樣，通過MTT法[26]評價衍生物對MCF-7、HepG2、A549及H1299的增殖抑制作用。

1.2.2.2 炎性因子NO、IL-1β及TNF-α的測定

將對數生長期生長良好的細胞，通過傳代處理，調整細胞密度5×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中穩定培養24 h，小心吸棄上清，分組給藥，給藥1 h后，炎癥模型組與給藥組加入適量LPS，使其終濃度為5 μg/mL，空白組給予等量的PBS，繼續培養24 h，收集上清液，-20 ℃儲存備用。分別取各給藥組細胞上清液以及各濃度標準品稀釋液50 μL于96孔板中，向其中加入50 μL A液(磺胺10 mg/mL+0.06%濃磷酸)，再加入50 μL B液(N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，1 mg/mL)，振蕩10 min，酶標儀測定546 nm處吸光度值，用ELISACalc軟件進行計算。同法使用LPS誘導細胞炎癥模型，收集上清液，按照各炎癥因子ELISA試劑盒說明書操作，測定IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.3 統計學方法

本實驗數據采用SPSS(17.0版本)統計軟件進行分析。實驗結果以“均數±標準差”表示(Mean ± SD)。兩組數據之間的均數比較采用t檢驗法，不滿足方差齊性者采用兩個獨立樣本非參數檢驗，當P<0.05時認同統計差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 衍生物結構表征

MM酯：二甲基-2，2′-((5，5′-聯丙烯-[1，1′-聯苯]-2，2′-取代)二乙酸酯，白色晶狀固體，產率85.3%；mp.89～93 ℃；紫外光譜顯示其在208和282 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：3 071、2 965、2 908、1 762、1 631、1 596、1 211、1 079 cm-1；HR-ESI-MS：m/z411.182 5 [M+H]+(calcd for C24H27O6，411.180 8)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.01～5.11(4H，m)，5.92～6.00(2H，m，H-2)，3.32(4H，d，J= 7.0 Hz，H-3)，7.10，7.09(2H，dd，J= 2.5，2.0 Hz，H-5)，6.88(2H，d，J= 8.5 Hz，H-6，H-6′)，7.04(2H，d，J= 2.5 Hz，H-9，H-9′)，4.67(4H，s，H-10，H-10′)，3.65(6H，s，H-12，H-12′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.5(C-1，C-1′)，137.8(C-2，C-2′)，39.2(C-3，C-3′)，132.1(C-4，C-4′)，128.2(C-5，C-5′)，112.6(C-6，C-6′)，153.6(C-7，C-7′)，127.3(C-8，C-8′)，131.3(C-9，C-9′)，65.4(C-10，C-10′)，169.4(C-11，C-11′)，51.6(C-12，C-12′)。MM酯為三斜晶系P-1空間群，a軸7.8593?，b軸10.9479?，c軸13.3607?，α=107.548°，β=101.872°，γ=101.872°，體積1 066.65[13]。

HM酯：二甲基-2，2′-((3，5′-聯丙烯-[1，1′-聯苯]-2，4′-取代)二乙酸酯，白色晶狀固體，產率82.6%；mp.76～79 ℃；紫外光譜顯示其在211、255、287 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：2 908、2 856、1 766、1 492、1 443 cm-1；HR-ESI-MS：m/z411.184 6 [M+H]+(calcd for C24H27O6，411.180 8)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.06～5.12(2H，m，H-1)，5.00～5.04(2H，m，H-1′)，5.99～6.06(1H，m，H-2)，5.91～5.98(1H，m，H-2′)，3.40(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3)，3.32(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3′)，6.92(1H，s，H-5)，7.07，7.08(1H，dd，J= 2.0 Hz，H-6)，7.35(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6′)，7.00(1H，s，H-7′)，7.05(1H，d，J= 2.0 Hz，H-9)；7.33(1H，d，J= 2.0 Hz，H-9′)，4.76(2H，s，H-10)，4.85(2H，s，H-10′)，3.68(3H，s，H-12)，3.71(3H，s，H-12′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.5(C-1)，115.6(C-1′)，137.9(C-2)，136.8(C-2′)，38.6(C-3)，34.0(C-3′)，132.7(C-4)，129.5(C-4′)，112.5(C-5)，154.3(C-5′)，127.9(C-6)，128.1(C-6′)，152.7(C-7)，111.3(C-7′)，130.8(C-8)，127.6(C-8′)，130.7(C-9)，130.4(C-9′)，64.9(C-10)，64.8(C-10′)，169.3(C-11)，169.3(C-11′)，51.8(C-12)，51.7(C-12′)。如圖2單晶衍射顯示：HM酯為三斜晶系P-1空間群，a軸9.1932?，b軸9.5749?，c軸13.2782?，α=99.755°，β=90.539°，γ=112.464°，體積1 061.0。

MM酰肼：2，2′-((5，5′-聯丙烯-[1，1′-聯苯]-2，2′-取代基)二(氧))二(乙酰肼)，白色粉末狀固體，產率48.9%；mp.135～138 ℃；紫外光譜顯示其在214和285 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：3 316、3 184、3 042、2 913、1 667、1 428、1 408 cm-1；HR-ESI-MS：m/z411.200 9 [M+H]+(calcd for C22H27N4O4，411.203 2)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.02～5.11(4H，m，H-1，H-1′)，5.92～5.99(2H，m，H-2，H-2′)，3.33(4H，d，J= 7.0 Hz，H-3，H-3′)，7.12，7.10(2H，dd，J= 2.5，2.0 Hz，H-5，H-5′)，6.91(2H，d，J= 8.5 Hz，H-6，H-6′)，7.03(2H，d，J= 2.5 Hz，H-9，H-9′)，4.43(4H，s，H-10，H-10′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.6(C-1，C-1′)，137.9(C-2，C-2′)，38.6(C-3，C-3′)，132.3(C-4，C-4′)，128.4(C-5，C-5′)，112.5(C-6，C-6′)，153.6(C-7，C-7′)，127.4(C-8，C-8′)，131.2(C-9，C-9′)，66.9(C-10，C-10′)，166.9(C-11，C-11′)。

圖2 化合物HM酯的晶型(CCDC編號：19589)Fig.2 The crystal pattern of compound HM ester(CCDC Number：19589)

HM酰肼：2，2′-((3，5′-聯丙烯-[1，1′-聯苯]-2，4′-取代基)二(氧))二(乙酰肼)，白色粉末狀固體，產率56.3%；mp.129～134 ℃；紫外光譜顯示其在210、254、286 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：3 419、1 675、1 501 cm-1；HR-ESI-MS：m/z411.204 9 [M+H]+(calcd for C24H27N4O4，411.203 2)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.01～5.04(2H，m，H-1)，5.06～5.12(2H，m，H-1′)，5.91～5.99(1H，m，H-2)，6.00～6.07(1H，m，H-2′)，3.33(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3)，3.44(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3′)，6.93，6.92(1H，dd，J= 2.0 Hz，J= 3.0 Hz，H-5)，7.08(1H，d，J= 2.5 Hz，H-6)，7.40，7.38(1H，dd，J= 2.5Hz，J= 2.0 Hz，H-6′)，6.91(1H，s，H-7′)，7.06(1H，s)；7.33(1H，d，J= 2.0 Hz，H-9′)，4.43(2H，s，H-10)，4.54(2H，s，H-10′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.6(C-1)，115.5(C-1′)，137.9(C-2)，136.1(C-2′)，38.6(C-3)，33.9(C-3′)，132.7(C-4)，129.8(C-4′)，113.2(C-5),154.6(C-5′)，128.0(C-6)，128.2(C-6′)，153.1(C-7)，111.4(C-7′)，130.8(C-8)，127.9(C-8′)，130.6(C-9)，130.4(C-9′)，66.9(C-10)，66.7(C-10′)，166.9(C-11)，166.8(C-11′)。

MM-522：5，5′-(((3′，5-聯丙烯-[1，1′-聯苯]-2，4′-取代基)二氧)二(亞甲基))二(2-(甲硫基)-1，3，4-噁二唑)，淡黃色油狀液體，產率36.9%；紫外光譜顯示在217和283 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：3 073、2 933、1 589、1 641、1 486、1 431 cm-1；HR-ESI-MS：m/z523.143 4 [M+H]+(calcd for C26H27N4O4S2，523.147 4)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.00～5.07(4H，m，H-1，H-1′)，5.89～5.98(2H，m，H-2，H-2′)，3.32(4H，d，J= 7.0 Hz，H-3，H-3′)，7.15(2H，d，J= 1.0 Hz，H-5，H-5′)，6.98(2H，d，J= 2.0 Hz，H-6，H-6′)，7.14(2H，s，H-9，H-9′)，5.25(4H，s，H-10，H-10′)，2.66(6H，s，H-13，H-13′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.7(C-1，C-1′)，137.7(C-2，C-2′)，38.6(C-3，C-3′)，132.9(C-4，C-4′)，128.5(C-5，C-5′)，113.6(C-6，C-6′)，153.0(C-7，C-7′)，127.4(C-8，C-8′)，131.3(C-9，C-9′)，60.2(C-10，C-10′)，163.6(C-11，C-11′)，165.5(C-12，C-12′)，14.1(C-13，C-13′)。

HM-522：5，5′-(((3′，5-聯丙烯-[1，1′-聯苯]-2，4′-取代基)二氧)二(亞甲基))二(2-(甲硫基)-1，3，4-噁二唑)，淡黃色液體，產率24.5%；紫外光譜顯示在206、250、288 nm有最大吸收；IR(KBr)ν：3 073、3 013、2 973、2 930、1 638、1 692、1 483、1 428 cm-1；HR-ESI-MS：m/z523.140 8 [M+H]+(calcd for C26H27N4O4S2，523.147 4)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：4.96～5.02(2H，m，H-1)，5.04～5.11(2H，m，H-1′)，5.87～5.94(1H，M，H-2)，5.94～6.01(1H，m，H-2′)，3.32(2H，s，H-3)，3.35(2H，s，H-3′)，7.14，7.12(1H，dd，J= 2.5，J= 2.0 Hz，H-5)，7.16～7.18(1H，m，H-6)，7.30，7.29(1H，dd，J= 2.5，J= 2.0 Hz，H-6′)，7.11(1H，d，J= 2.0 Hz，H-7′)，7.16～7.18(1H，m，H-9)，7.27(1H，d，J= 2.5 Hz，H-9′)，5.31(2H，s，H-10)，5.43(2H，s，H-10′)，2.68(3H，s，H-13)，2.72(3H，s，H-13′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.3(C-1)，115.7(C-1′)，137.8(C-2)，136.5(C-2′)，38.6(C-3)，33.7(C-3′)，133.6(C-4)，130.0(C-4′)，114.1(C-5)，154.1 C-5′)，128.0(C-6)，128.2(C-6′)，152.6(C-7)，112.6(C-7′)，131.0(C-8)，127.9(C-8′)，130.8(C-9)，130.5(C-9′)，60.2(C-10)，69.9(C-10′)，163.6(C-11)，163.5(C-11′)，165.6(C-12)，165.6(C-12′)，14.2(C-13)，2.7(C-13′)。

用結構分析的方法對6種衍生物的結構進行了分析。鑒于各衍生物的結構相似性，以化合物MM-522和HM-522的結構表征為例，證明反應的可靠性和真實性。HRMS(ESI)證實化合物MM-522的分子式為C26H26N4O4S2。紅外光譜表明其含有芳香氫(3 073.98 cm-1)、甲基氫(2 933.2 cm-1)、碳鏈雙鍵(1 589.06 cm-1)、羰基(1 641.13 cm-1)和苯環(1 486.85、1 431.89 cm-1)。化合物MM-522的1H NMR譜顯示其結構中有1個甲基單峰位于最高場[2.66(6H，s)]為13和13′位上的氫信號，1個亞甲基雙重峰[3.32(4H，d，J= 7.0 Hz)]為3和3′位上的氫信號，由于受到2及2′位上氫的影響使其分裂為雙重峰，1個亞甲基單峰位于低場[5.25(4H，s)]為10和10′位上的氫信號，由于受到氧原子的影響，其化學位移向低場移動，1個烯鍵多重峰[5.01～5.09(4H，m)]為1和1′位上的氫信號以及1個次甲基多重峰[5.89～5.98(2H，m)] 為2和2′位上的氫信號，2個次甲基雙重峰[7.15(2H，d，J= 1.0 Hz)，6.98(2H，d，J= 2.0 Hz)]，1個次甲基單峰[7.15(2H，s)]為苯環上氫的信號。根據13C NMR譜和DEPT譜顯示有26個碳信號，其中包括6個亞甲基信號分別為3，3′，10，10′，1，1′位上的碳信號，10個甲基信號或次甲基信號，其中化學位移值位于最高場的為13和13′位上的碳信號，10個季碳信號。

如圖3-a中所示，根據1H-1H COSY、HMBC表明H-3，3′與H-2，2′及H-1，1′互為偶合關系，驗證了1H NMR里的推論；而H-5，5′與H-6，6′互為偶合關系，因此表明化學位移為7.15的2H單峰為9和9′的信號；根據HMBC顯示H-10，10′與C-7，7′以及C-11，11′有遠程偶合關系，可以得出1，3，4-惡二唑環通過10位亞甲基與厚樸酚7位上的酚羥基相連；又根據HMBC顯示C-12，12′與H-13，13′有遠程偶合得出1，3，4-惡二唑環的12位被甲硫基取代。綜上所述，此化合物的結構被確定為5，5′-(((5，5′-聯丙烯-[1，1′-聯苯]-2，2′-取代基)二氧))二(亞甲基))二(2-(甲硫基)-1，3，4-噁二唑)，簡稱為MM-522。

圖3 MM-522(a)和HM-522(b)的HMBC和1H-1H COSY相關示意圖Fig.3 The HMBC and 1H-1H COSY correlation of MM-522(a) and HM-522(b)

HM-522的分子式為C26H26N4O4S2。紅外光譜表明HM-522的結構中含有芳香氫(3 073.98和3 013.23 cm-1)、甲基氫(2 973.70和2 930.31 cm-1)、碳氫鏈雙鍵(1 638.23 cm-1)。羰基(1 692.23 cm-1)和苯環(1 483.96和1 428.99 cm-1)。化合物HM-522的1H NMR譜表明其結構具有兩個甲基單峰[2.68(3H，s)，2.72(3H，s)]分別為13和13′位上H的信號， 兩個次甲基多重峰[5.87～5.94(1H，m)，5.94～6.00(1H，m)]為2和2′位上H的信號，兩個烯鍵多重峰[4.96～5.02(2H，m)，5.04～5.11(2H，m)]分別為1和1′位上H的信號，四個亞甲基單峰[5.31(2H，s)，5.43(2H，s)，3.32(2H，s)，3.35(2H，s)]，苯環上六個H信號[7.14，7.12(1H，dd，J= 2.5 Hz，J= 2.0 Hz)，7.16～7.18(2H，m)，7.30，7.29(1H，dd，J= 2.5 Hz，J= 2.0 Hz)，7.11(1H，d，J= 2.0 Hz)，7.27(1H，d，J= 2.5 Hz)]。13C NMR譜和DEPT譜表明有26個碳信號，其中包括10個甲基或者次甲基信號，6個亞甲基和10個季碳。如圖3-b所示，H-2，2′與 H-1，1′和H-3，3′具有關系，直接相連。H-10與C-7、C-11有遠程偶合關系而H-10′與C-5′、C-11′，可以得出兩個1，3，4-惡二唑環分別通過10和10′位亞甲基鍵與厚樸酚7和5′位上的酚羥基相連；又根據HMBC顯示C-12與H-13，C-12′與H-13′有遠程偶合得出1，3，4-惡二唑環的12和12′位被甲硫基取代。綜上所述，此化合物的結構被確定為5，5′-(((3′，5-聯丙烯-[1，1′-聯苯]-2，4′-取代基)二氧)二(亞甲基))二(2-(甲硫基)-1，3，4-噁二唑)，簡稱為HM-522。

由于第三步反應為環化反應，產率較低，影響因素較多，因此通過考察溶劑、溫度、時間、催化劑、原料配比等因素對反應條件進行了優化。以無水乙醇、無水甲醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、異丙醇、二氯甲烷(DCM)、乙腈、1，4-二氧六環為反應溶劑，由于二氯甲烷的沸點太低，達不到反應要求的溫度。當丙酮和1，4-二氧六環作為溶劑時，此反應不發生，而當乙腈和無水乙醇作為溶劑時產率較高，但兩者產率相差不大，鑒于乙腈毒性較大，因此后續實驗選擇無水乙醇作為反應溶劑。在溫度方面，我們發現當反應達到沸點時，產率達到最大。而當溫度繼續升高時，收率并沒有隨之增加。考察了氫氧化鉀、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、三乙胺和甲醇鈉對反應收率的影響。結果表明，以無水碳酸鈉為催化劑時，無水碳酸鈉的收率最高。另外，當反應時間12 h，原料配比為酰肼∶無水碳酸鈉∶二硫化碳=1∶2∶2時，中間體的收率最高，為66.01%。此外，值得注意的是，本研究采用溶劑法對各衍生物進行純化，避免應用半制備液相色譜儀及硅膠層析柱等處理方式，所獲得的衍生物純度高且適用于體外活性研究。

2.2 生物學評價

2.2.1 衍生物對RAW264.7細胞增殖的影響

本實驗采用MTT法研究厚樸酚與和厚樸酚各衍生物對細胞存活率的影響。實驗結果如圖4-a所示，厚樸酚與和厚樸酚對RAW 264.7細胞的毒性較大，厚樸酚濃度在200～400 μM時就能將細胞全部殺死，而和厚樸酚毒性較厚樸酚大，濃度在50～100 μM時就能將細胞全部殺死；在衍生物中，MM酯與MM-522在800 μM時對細胞毒性仍然較小，細胞存活率較高，而其他的衍生物隨著藥物濃度的升高，對細胞存活率的影響也增大，細胞存活率降低，但是所有衍生物的毒性與厚樸酚相比都有所降低。各處理組對正常細胞的IC50值如表1所示。

2.2.2 衍生物的體外抗炎作用研究

如圖4-b所示，正常RAW 264.7細胞在未受LPS刺激的情況下幾乎不分泌炎性介質NO；然而，細胞在受到LPS刺激后，炎癥模型組較對照組分泌大量的NO，有顯著性的變化(P<0.01)，而陽性藥布洛芬組NO濃度較炎癥模型組顯著性降低(P<0.01)，說明此炎癥模型造模成功。通過衍生物干預之后，各實驗組中NO的分泌均受到不同程度的抑制作用，其中MM酯組(11.62 μmol/L)、MM-522組(10.52 μmol/L)、HM酰肼組(10.07 μmol/L)、HM-522 組(12.74 μmol/L)對NO的抑制作用與陽性藥布洛芬相當，且HM 酰肼對NO的抑制作用最強。所有衍生物的抑制作用均強于厚樸酚組(14.47 μmol/L)，并與和厚樸酚組(11.21 μmol/L)抑制作用相當。

化合物Compound半數抑制濃度IC50(μmol/L)厚樸酚 Magnolol52.23 ± 2.51MM酯 MM ester>800**MM酰肼 MM hydrazide104.23 ± 3.42*MM-522 > 800*和厚樸酚 Honokiol22.18 ± 1.46HM酯 HM ester220.08 ± 3.53*HM酰肼 HM hydrazide238.01 ± 4.53*HM-522 304.24 ± 5.21*

注：與原料藥對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01.

根據4-c所示，RAW 264.7細胞受到LPS刺激后，炎癥模型組較對照組分泌大量的IL-1β，有極顯著的差異(P<0.01)。各實驗組中IL-1β的分泌均受到不同程度的抑制作用，其中MM-522(12.87 pg/mL)的抑制作用最強，其他衍生物的抑制作用與布洛芬(16.68 pg/mL)相當或較強。所有衍生物的抑制作用與厚樸酚組(12.23 pg/mL)、和厚樸酚組(14.73 pg/mL)抑制作用相當。從圖4-d可知，所有藥物組TNF-α濃度與炎癥模型組相比，都有顯著性變化(P< 0.01)，因此均能不同程度地抑制LPS刺激后的RAW 264.7巨噬細胞分泌TNF-α，抑制強度與厚樸酚(16 618.66 pg/mL)、和厚樸酚(16 326.89 pg/mL)以及陽性藥布洛芬(15 028.40 pg/mL)相當，其中MM酰肼(12 554.76 pg/mL)與HM酰肼(12 407.54 pg/mL)抑制TNF-α分泌的作用最強。因此衍生物在體外抗炎活性方面到達了增效減毒的作用。

2.2.3 衍生物體外抗腫瘤作用研究

為了初步探究各衍生物的體外抗腫瘤活性，本實驗以MCF-7、HepG2、H1299及A549為研究對象，采用MTT法以厚樸酚與和厚樸酚為對照對衍生物的體外抗腫瘤活性進行評價。結果如表2、表3中所示，經過結構修飾后，原料藥厚樸酚與和厚樸酚對四種腫瘤細胞均有較好的抑制作用，而衍生物的抑制作用有所減弱，但也表現出明顯的抑制作用。衍生物HM酯對MCF-7表現出較好的抑制作用，濃度在100 μmol/L的時候，細胞存活率大約是30%，并且具有濃度依賴性；對于HepG2抑制實驗中，和厚樸酚在低濃度時就能將癌細胞全部殺死，衍生物HM酯和MM酯均表現出了較好的抑制作用，MM酯在低濃度時細胞存活率低于30%；衍生物HM酯、HM酰肼對A549表現出較好的抑制作用，HM酯在濃度為400 μmol/L的時候，幾乎殺死全部A549；在H1299抑制實驗中，衍生物MM酰肼、HM酯、HM酰肼均表現出較好的抑制作用。

圖4 各衍生物的細胞毒性及其對炎癥因子影響Fig.4 Cytotoxicity of derivatives and their effects on inhibiting inflammatory factors

3 結論

基于“減毒增效”及總結前人研究的基礎上，設計修飾并合成了6個衍生物，其中，MM酰肼、MM-522、HM酯、HM酰肼及HM-522國內外未見文獻報道。所有衍生物的細胞毒性與原料相比都有所降低。在抗炎活性探究中發現，多數衍生物在保持較低細胞毒性的同時，衍生物MM酯、HM酰肼及MM-522具有良好抑制炎性介質生成的作用。在評價衍生物腫瘤的活性評價中，原料藥厚樸酚與和厚樸酚具有良好的抗腫瘤活性，而衍生物的抗腫瘤活性略有下降。但是，MM酯、HM酯在保持低細胞毒性的情況下，仍然表現出一定的抗腫瘤活性。由此可知，原料藥厚樸酚于和厚樸酚良好的的抗腫瘤作用與其較強的細胞毒性存在某種關聯。本研究中的MM酰肼、MM-522、HM酯及HM酰肼等對細胞毒性較小，且抗炎及抗腫瘤活性優于陽性藥物及原料藥。因此，本研究達到降低毒性，維持藥效的目的，對先導化合物的開發和修飾具有一定的研究意義。

表2 衍生物對MCF-7和HepG2的存活率Table 2 The survival ratio of derivatives against MCF-7 and HepG2

注：濃度單位：μmol/L，下同。

Note:Concentration unit:μmol/L,the same below.

表3 衍生物對A549和H1299的存活率Table 3 The survival ratio of derivatives against A549 and H1299