天麻-附子祛風通絡藥對抗類風濕性關節炎風寒濕痹癥大鼠的干預機制

郭步伐，楊 杰*，彭啟倫，范光忠，姚維一，鄧佳麗，龔弟鴻，丁維俊

1畢節醫學高等專科學校基礎醫學系，畢節 551700；2成都中醫藥大學基礎醫學院，成都 610075

天麻為蘭科植物天麻屬的干燥塊莖，主產于四川、云南、貴州等地。天麻味甘、藥性平和，附子辛、甘、大熱、有小毒。由于兩種中藥均味甘，因此兩藥配伍組成祛風通絡藥對，能相互調和其藥性，廣泛用于類風濕性關節炎的治療[1]。首先，Peng等[2]篩選與天麻配伍具有祛風通絡功效的400首方劑，從中發現天麻與川芎、當歸、牛膝和附子等配伍頻次之高，在治療頑固性痹癥中發揮著重要作用。Lai等[3]采用“中醫傳承輔助系統”篩選出與天麻進行配伍的106首方劑，認為天麻與附子配伍是祛風通絡治療痹病的最佳藥物組合。其次，天麻與附子配伍組成祛風通絡藥對在《太平圣惠方》、《圣濟總錄》和《奇效良方》天麻丸中均有記載，其中明代方賢著所著《奇效良方》天麻丸中天麻與附子配伍的劑量比為1∶1和3∶2。當今，Chen等[4]根據古方天麻丸研制的天麻浸膏丸用于治療類風濕性關節炎，其總有效率為82.8%。因此，我們在古方天麻丸所含天麻-附子劑量配比的基礎上設計天麻-附子藥對1∶1、3∶2和2∶3劑量比組，觀察天麻-附子藥對三種劑量配比抗RA的療效；在此療效的基礎上，從環加氧酶COX-2/COX-1角度闡釋天麻-附子祛風通絡藥對抗膠原誘導的RA風寒濕痹癥大鼠模型[5]的干預機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品

紅天麻GastrodiaelataBl購自貴州畢節大方天麻公司，附子Radix Aconiti Lateralis Preparata購自四川江油鑫臨附子藥業有限公司。產地分別為貴州畢節大方和四川江油。由成都中醫藥大學鄧赟教授鑒定。

天麻-附子祛風通絡藥對(1∶1、3∶2、2∶3)凍干粉制備：按比例稱取天麻、附子粗粉，分別加10倍體積水浸泡30 min，先煎附子1 h，再加天麻煎1 h，過濾；第二次在殘渣中加8倍體積水煎煮1 h，過濾，合并兩次濾液，濃縮至相對密度1∶1.1的膏狀物，再制成天麻-附子藥對不同劑量配比的凍干粉，4 ℃保存備用。

1.1.2 試劑

牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司，批號：20022),完全弗氏佐劑(美國Chondrex公司，批號：7023)；大鼠類風濕因子RF(批號：ERC156)，C反應蛋白CRP(批號：ERC07)，血栓素B2TXB2(批號：ERC88)，前列腺素E2PGE2(批號：ERC16)，前列環素PGI2(批號：ERC129)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自依科賽生物科技有限公司。BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(2X)(碧云天生物技術公司，批號：D7260)。PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司，批號：RR037A)。

1.1.3 動物

SPF級SD雄性大鼠60只，6周齡，購自成都達碩動物有限公司，許可證號SCXK(川)2015-030。飼養于成都中醫藥大學基礎醫學實驗中心清潔級動物房，自由飲水和進食。

1.2 儀器

FYL-YS-138L恒溫冷藏柜(北京福意聯醫療設備有限公司)，Multiskan MK3全自動酶標儀(美國Thermo Scientific公司)，CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)。

2 方法

2.1 類風濕性關節炎風寒濕痹癥大鼠模型的建立

選用SPF級SD雄性大鼠60只，6周齡，大鼠適應性喂養1周后，任意選取8只大鼠作為正常組，其余大鼠參考文獻按照膠原誘導的關節炎法(CIA法)[5]造模。取2 g/L牛Ⅱ型膠原置于4 ℃冰箱中過夜，與含有5 g/L卡介苗的完全弗氏佐劑(CFA)等體積混合，充分研磨至乳白色黏稠液體，使之乳化，膠原最終質量濃度為1 g/L。于大鼠的尾根部至后背部進行皮下注射膠原乳化劑0.2 mL。14天后按初次致炎的方法和劑量重復致炎。風寒濕刺激條件:自致炎第1天起，將致炎大鼠置于恒溫冷藏柜中，風速18 m/s，相對濕度95%～100%，每次30 min，每天1次，連續18天。定期觀察大鼠的一般情況、關節腫脹程度、顏色、關節活動情況等變化。

2.2 動物分組及給藥

致炎21天，根據關節炎指數≥4篩選模型建立成功的大鼠，按各組大鼠關節炎指數無統計學差異，均勻地分為模型組、天麻-附子祛風通絡藥對1∶1(含藥對生藥2.7 g/kg)、2∶3(含藥對生藥3.4 g/kg)、3∶2(含藥對生藥3.4 g/kg)劑量比組，每組8只，灌胃給藥每日一次，連續21天。正常組和模型組按10 mL/kg灌胃生理鹽水。各給藥組劑量均按體表面積換算的成人臨床等效劑量[5]的1.5倍進行計算，同時以明代《奇效良方》天麻丸所含天麻附子配伍的比例為依據。

2.3 檢測指標

2.3.1 大鼠體重

致炎前起，每周稱量并記錄大鼠體重。

2.3.2 關節炎指數

致炎第21天起，每周按大鼠多發性關節炎全身5級評分法[5,6]對病變程度進行評分。0分，正常；1分，足趾關節紅腫；2分，多個趾關節或趾跖關節腫脹；3分，踝關節以下的足爪腫脹；4分，全部足爪腫脹。累計四肢關節炎積分為每只大鼠的關節炎指數，最高為16分。

2.3.3 血清細胞因子

致炎42天后，10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉各組大鼠，心臟取血2～3 mL，3 000 rpm離心20 min，分離血清，-80 ℃保存備用。ELISA法測定血清類風濕因子(RF)、C反應蛋白(CRP)、血栓素B2(TXB2)、前列腺素E2(PGE2)和前列環素(PGI2)的水平。

2.3.4 RT-qPCR檢測各組大鼠全血COX-1和COX-2 mRNA的表達量

致炎42天后，10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉各組大鼠，心臟取血1～2 mL，置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的離心管中，加3倍體積紅細胞裂解液，輕輕顛倒混勻，3 000 rpm離心10 min，棄上清，用2 mL 磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，放入1 mL RNA Later之中，-80 ℃保存。

根據Multisource Total RNA Miniprep Kit(AXYGEN，AxyPrepTM，07418KD1)試劑盒操作說明書提取各組樣本總RNA。按照PrimeScript TM RT Reagent Kit (Takara)說明書進行反轉錄操作。采用20 μL反應體系(SYBR Green qPCR Mix 10 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6 μL)，擴增反應條件如下：95 ℃ 30 s 熱啟動和預變性，95 ℃ 5 s 變性，60 ℃ 35 s 退火，72 ℃ 30 s 充分延伸，共40個循環。引物信息見表1。β-actin為內參基因，相對表達水平采用2-△△Ct公式進行計算。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 天麻-附子不同劑量配比對大鼠一般情況及體重的影響

致炎10天，類風濕性關節炎風寒濕痹癥大鼠足趾皮膚發紅，輕度腫脹，致炎14天再次強化免疫，大鼠足背、踝關節腫脹明顯，活動量減少，食少，體重增長緩慢，甚至下降；致炎21天，大鼠足背、踝關節腫脹進一步加重，體重下降，下肢觸地無力。自致炎第21天開始給藥，各治療組大鼠體重逐漸上升，見表2。致炎第42天(給藥第21天)，各治療組大鼠體重較模型組明顯升高(見表2)。

表2 天麻-附子不同劑量配比對大鼠體重的影響Table 2 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ weight = 8)

注：與正常組相比，*P<0.05；#P<0.01。與模型組相比，△P<0.01；△△P<0.05。TF11、TF32、TF23組分別為天麻-附子藥對1∶1、3∶2、2∶3劑量比組。

Note:Compared with normal,*P<0.05;#P<0.01.Compared with model,△P<0.01;△△P<0.05.TF11,TF32 and TF23 group were GRHP 1∶1,3∶2 and 2∶3 dose-ratio groups,respectively.

3.2 天麻-附子不同劑量配比對大鼠關節炎指數的影響

致炎28天，模型組大鼠關節炎指數達到高峰。各治療組隨著治療時間的延長，關節炎指數逐漸下降。致炎42天(給藥第21天)，各治療組與模型組相比，其關節炎指數明顯下降(見表3)。

表3 天麻-附子不同劑量比對大鼠關節炎指數的影響Table 3 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ AI = 8)

注：與模型組相比，*P<0.05；#P<0.01。

Note:Compared with model,*P<0.05;#P<0.01.

3.3 天麻-附子不同劑量配比對血清RF、CRP水平的影響

表4所示，模型組血清RF、CRP水平明顯高于正常組，可成為類風濕性關節炎風寒濕痹癥大鼠模型的判定標準之一。與模型組相比，天麻-附子1∶1、2∶3、3∶2劑量比組能明顯降低類風濕性關節炎風寒濕痹癥大鼠血清RF和CRP的水平(P<0.05，P<0.01)，因而各劑量比組可改善大鼠足趾及踝關節腫脹癥狀。

表4 天麻-附子不同劑量比對大鼠血清RF和CRP水平的影響Table 4 Effect of different dose-ratios of GRHP on RF and CRP levels in rats′ blood = 8)

注：與正常組相比，*P<0.01。與模型組相比，#P<0.05；△P<0.01。

Note:Compared with normal,*P<0.01.Compared with model,#P<0.05;△P<0.01.

3.4 天麻-附子不同劑量配比對血清TXB2、PGE2、PGI2水平的影響

表5所示，致炎42天，與正常組相比，模型組血清PGE2和PGI2水平明顯升高，為類風濕性關節炎風寒濕痹癥大鼠主要的致炎因子之一。與模型組相比，各劑量配比組血清PGE2和PGI2水平下降，其中天麻-附子藥對1∶1劑量組和2∶3劑量組下降最為明顯，P<0.01。

表5 天麻-附子不同劑量比對大鼠血清TXB2、PGE2、PGI2水平的影響Table 5 Effect of different dose-ratios of GRHP on TXB2,PGE2 andPGI2 levels in rats′ blood serum = 8)

注：與正常組相比，*P<0.01；#P<0.05。與模型組相比，△P<0.01；△△P<0.05。

Note:Compared with normal,*P<0.01;#P<0.05.Compared with model,△P<0.01;△△P<0.05.

3.5 天麻-附子不同劑量配比對COX-1和COX-2 mRNA表達的影響

致炎42天，與正常組相比，模型組COX-1 mRNA表達低于正常組，COX-2 mRNA表達高于正常組，P<0.05。與模型組相比，各劑量組能明顯降低COX-2 mRNA的表達。各劑量組之間COX-1 mRNA、COX-2 mRNA表達無統計學差異(見表6)。

表6 天麻-附子不同劑量比對大鼠全血COX mRNA表達的影響Table 6 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ whole blood COX mRNA = 8)

注：與正常組相比，*P<0.05。與模型組相比，#P<0.05；△P<0.01。

Note:Compared with normal,*P<0.05.Compared with model,#P<0.05;△P<0.01.

4 討論

類風濕性關節炎是一種以關節滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反復發作，可導致關節內軟骨和骨的破壞，關節功能障礙，甚至殘廢，嚴重影響患者的生活質量[7,8]。目前，CIA和AIA法是常見的復制類風濕性關節炎動物模型的方法之一，CIA法大鼠模型關節炎癥狀與人類類風濕性關節炎相類似[9]。經大鼠尾根部至后背部皮下注射膠原乳劑14天之后，大鼠足趾及踝關節紅腫癥狀逐漸加重，飲食減少乃至體重增幅減少。致炎21天，以關節炎指數≥4為模型判定標準，顯示52只SD大鼠成模率為61.54%。血清RF、CRP水平是類風濕性關節炎的診斷標準之一[8]，我們采用ELISA法檢測類風濕性關節炎大鼠血清RF和CRP的水平。結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清RF、CRP血清濃度明顯升高，進一步證實RA模型復制成功。

藥對是臨床上常用的兩味藥物的配伍形式。根據中藥藥性理論，天麻味甘、藥性平和，附子辛、甘、大熱、有小毒，兩味藥配伍組成祛風通絡藥對用于類風濕性關節炎的治療。在與天麻配伍具有祛風通絡功效的400首方劑中，其中天麻與附子配伍的頻次較高[2]。《大平圣惠方》、《奇效良方》和《圣濟總錄》中記載的天麻丸所用的天麻-附子劑量配比為1∶1和3∶2。因此，本課題組在古方天麻丸所用天麻-附子劑量配比的基礎上，觀察天麻-附子劑量配比1∶1、3∶2和2∶3抗RA的療效。

首先，給藥21天(致炎42天)之后，天麻-附子藥對各劑量比可降低RA大鼠關節炎指數及血清RF、CRP的水平，同時增加其各劑量組大鼠的體重，提示了天麻-附子祛風通絡藥對各劑量配比組具有較好的抗炎抗風濕作用(見表2、表3和表4)。從RA大鼠關節炎指數、血清炎癥因子水平到COX mRNA表達程度，天麻附子1∶1和3∶2劑量比組對各檢測指標的影響與模型組相比，統計學差異不一致；然而，天麻附子藥對2∶3劑量比組對各檢測指標的影響，與模型組相比，P值均小于0.01,可認為是天麻附子藥對抗RA的最佳劑量比，在于此劑量比附子用量稍高于天麻，并與附子溫通經絡治療痹癥的中醫理論有一定的關系[10,11]。

其次，COX是影響花生四烯酸代謝的限速酶，包括COX-1和COX-2兩種類型，COX-1 mRNA表達于胃粘膜、腎血管等正常組織中，具有生理性保護作用，COX-2 mRNA在炎癥刺激下強烈表達，并促進前列腺素等炎癥因子的釋放[12,13]。大多數研究均表明[14,15]，COX表達于類風濕性關節炎滑膜組織中，COX-1 mRNA表達衍生的TXA2具有促凝作用，COX-2 mRNA表達衍生的PGI2具有抗凝作用，因此，TXA2與PGI2在生理功能上呈現相互拮抗。TXA2半衰期較短，難以檢測，故通過檢測TXB2的濃度進行間接地評價[16]。表5所示，各組大鼠血清中PGI2的濃度明顯高于TXB2的濃度，與COX mRNA表達程度相關(見表6)。由于天麻-附子藥對各劑量比組均能明顯降低RA大鼠COX-2 mRNA的表達，對COX-1 mRNA表達影響較小(見表6)，且各劑量組能明顯降低RA大鼠血清PGE2和PGI2的含量(見表5)，因此天麻-附子藥對通過下調COX-2 mRNA表達而成為其具有抗炎抗風濕作用的原因之一。

至今，從單味藥到復方，從單一成分到多組分，從單一靶點到多靶點網絡效應，天麻藥對研究層次逐漸深入。由天麻與川芎組成的兩味方含有20種活性成分，與48個偏頭痛相關靶點結合，產生了潛在的協同治療效應[17,18]。天麻鉤藤飲是治療腦缺血及相關疾病的常用方劑，其主要的藥物是天麻和鉤藤，其神經保護效應的分子機制在于能上調Nrf-2、Bcl-2及抗氧化反應信號轉導通路基因的表達，明顯縮短大腦中央動脈阻塞的范圍[19]。我們首次從COX-2/COX-1角度闡釋古方天麻丸中天麻-附子祛風通絡藥對劑量配比抗RA的作用機制，其天麻-附子藥對多成分、多靶點和多途徑的網絡效應機制有待于進一步深入研究。