復方甘草片HPLC指紋圖譜及7成分測定

高小惠，胡燕琴，王洪靜，李 寧,2*，劉軍鋒*，楊兆祥

1昆藥集團股份有限公司，昆明 650100；2上海中醫藥大學中藥研究所教育部中藥標準化重點實驗室，上海 201203

復方甘草片是20世紀50年代我國醫藥工作者在國外經典天然藥物處方的基礎上，自主開發的鎮咳祛痰藥[1]。其原方出自約翰·布朗醫師(1735～1788)的布朗合劑。1963年青海制藥廠刪除原方中酒石酸銻鉀并改劑型為片劑，首家注冊復方甘草片。此后復方甘草片的組方工藝幾經變更[2]。目前處方每片含甘草浸膏粉112.5 mg、阿片粉或罌粟果提取物粉4 mg、樟腦2 mg、八角茴香油2 mg、苯甲酸鈉2 mg[2,3]。復方甘草片治療感染后咳嗽安全、可靠，總有效率為77.7%～85.4%，有效性及安全性與中華醫學會呼吸病學分會《咳嗽的診斷與治療指南(2015)》[4]推薦的右美沙芬相當[1]，且較右美沙芬更為經濟[5]。目前，中國有復方甘草片生產廠家33家，涉及36個批準文號，年產復方甘草片約200億片，市場價值約20億人民幣[2]。

質量是藥品療效的根本保證。為提高仿制藥質量，國務院辦公廳2016年3月5日發布了《國務院辦公廳關于開展仿制藥質量和療效一致性評價的意見》(國辦發[2016]8號)，要求開展仿制藥質量和療效的一致性評價。食品藥品監管總局2016年5月25日發布了《2018年底前須完成仿制藥一致性評價品種目錄》，復方甘草片明確列入該目錄中。2018年1月30日，仿制藥質量與療效一致性評價辦公室將復方甘草片列入《289基藥目錄中國內特有品種名單》，鼓勵并要求企業提出科學合理的評價方案。

為解決行業共性問題，進一步完善復方甘草片的質量研究，本研究收集10個廠家共18批次復方甘草片樣品進行了摸底性調查研究，建立了HPLC指紋圖譜分析方法，對其中14個共有峰進行了鑒定，并同時對其中嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸7個主要成分的含量進行測定，為尋求符合復方甘草片特點的一致性評價路徑提供新的技術手段和基礎性研究資料。

1 材料、儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(包括DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、在線脫氣機、四元梯度泵)(美國Agilent公司)；XP205、XPE26分析電子天平(Mettler公司)；5510E-DTH超聲提取儀(美國Branson公司)；Milli-Q 超純水機(美國Millipore公司)。

1.2 材料與試劑

18批復方甘草片(編號見表1)由昆藥集團股份有限公司(以下簡稱昆藥集團或昆藥)提供，包括9批昆藥集團樣品和9批其他廠家(廠家1～9)樣品；嗎啡、磷酸可待因、苯甲酸鈉、甘草苷、甘草酸銨、反式茴香腦對照品購自中國食品藥品檢定研究院；刺甘草查爾酮、甘草查爾酮A、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、光甘草定、異甘草苷對照品購自成都曼思特生物科技有限公司；芹糖甘草苷對照品購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈為色譜純(MERCK公司)，甲醇為分析純(天津市風船化學試劑科技有限公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取本品20片，精密稱取，研細，精密稱取1片量，置50 mL量瓶中，加50%甲醇適量，超聲提取30 min，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(0.45 μm濾膜)，取續濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，加少量甲醇溶解后，用50%甲醇水溶液稀釋定容，即得各對照品儲備液。根據實驗需要，分別精密吸取各儲備液適量，用50%甲醇水溶液稀釋定容配成混合對照品溶液。其中含量測定用嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液，每 1 mL分別約含嗎啡0.008 mg、磷酸可待因0.004 mg、芹糖甘草苷0.036 mg、甘草苷0.016 mg、苯甲酸鈉0.040 mg、異甘草苷0.016 mg、甘草酸銨0.180 mg。

2.3 色譜條件

Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；以乙腈為流動相A，以0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀2.72 g，加水至1 000 mL，磷酸調pH至4.0)為流動相B，進行梯度洗脫(0～10 min，2%→10% A；10～25 min，10%→38% A；25～35 min，38%→55% A；35～40 min，55%→60% A；40～50 min，65% A；50～55 min，65%→2% A；55～65 min，2% A)；流速1.0 mL/min；檢測波長為220和254 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

3 結果

3.1 指紋圖譜的方法學考察

3.1.1 精密度試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的規定連續進樣6次，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，RSD小于0.5%。以甘草酸色譜峰為參照，主要共有峰相對保留時間RSD小于1%，相對峰面積RSD小于3%。結果表明儀器精密度良好。

3.1.2 重復性試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下的規定進樣分析，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，RSD小于0.5%。以甘草酸色譜峰為參照，主要共有峰相對保留時間RSD小于1%，相對峰面積RSD小于3%。結果表明本方法重復性良好。

3.1.3 穩定性試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、18、24、48、72、96 h進樣，按“2.3”項下的規定進樣分析，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，RSD小于0.5%。以甘草酸色譜峰為參照，主要共有峰相對保留時間RSD小于1%，相對峰面積RSD小于3%。結果表明樣品于96 h內穩定。

3.2 指紋圖譜的建立、相似度分析及共有峰指認

取不同批號復方甘草片共18批，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的規定進樣分析，將220 nm波長的色譜圖輸入相似度評價軟件進行相似度比較，剪切10 min之前和50 min之后的色譜峰，采用中位數法生成參照指紋圖譜。各批次藥品指紋圖譜的疊加圖及共有模式指紋圖譜分別見圖1和圖2。以共有模式為參照，各批次樣品的相似度計算結果見表1，所有批次樣品的相似度均在0.95 以上。指紋圖譜中可見27個主要共有峰(圖2)，占總峰面積80%以上。與對照品色譜圖對照保留時間，共有峰1、3、8、9、10、14、16、17、19、20、22、24、25、26分別指認鑒定為嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、甘草酸、刺甘草查爾酮、異甘草素、甘草查爾酮A、光甘草定、反式茴香腦。

圖1 18批樣品指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 18 batches of samples

圖2 18批樣品指紋圖譜共有模式Fig.2 Fingerprint common patterns of 18 batches of samples

3.3 指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積

以19號峰甘草酸為參照峰計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2。19號峰結構確切，與相鄰色譜峰分離良好，易于識別，且保留時間及峰面積均較穩定，適于作為參照峰。共有峰的相對峰面積分布在一個較寬的范圍內，最大RSD(26號峰)達61.66%，客觀反映了化學成分的批間差異。

表1 18批樣品相似度Table 1 Similarities of 18 batches of samples

表2 18批樣品共有峰相對保留時間及相對峰面積Table 2 The relative retention time and relative peak areas of common peaks of 18 batches of samples

續表2(Continued Tab.2)

峰號No.相對保留時間RRT相對峰面積Relative peak areaS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18RSD(%)201.0260.4170.2880.3310.3930.3140.3230.2890.2940.3310.2760.3340.2910.2890.2790.2680.2770.2760.27313.51211.0800.4110.0680.2700.3580.1670.4010.1630.1640.4970.2720.4750.2780.2800.2760.2650.2740.2730.27238.49221.1020.1890.0930.2000.1430.1690.3290.1060.1120.3490.1920.3130.1750.1680.2160.0840.2080.1770.16040.66231.1160.2060.0810.1240.1900.1580.1880.1280.1300.2050.1560.1930.1430.1400.1600.1510.1600.1580.15520.11241.3020.1080.1390.1040.0430.0960.1750.0850.0940.1020.0550.0950.1200.1120.0590.0240.0560.0490.04644.28251.3430.3070.3910.2600.4260.3460.3160.2500.2540.2700.2760.3000.2630.2680.2710.2610.2740.2760.25616.83261.3800.1000.9170.4270.5080.1701.6870.6460.6470.5791.2800.5240.3100.3071.3501.4141.3361.3021.50561.66271.4150.4790.7250.2110.4210.5210.4630.4670.4630.4930.2370.4830.4890.5110.2250.2410.2190.2370.23837.73

3.4 含量測定的方法學考察

本研究建立的指紋圖譜分析方法可同時對復方甘草片中嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸面積7個主要成分進行含量測定。

3.4.1 專屬性試驗

取昆藥集團樣品及空白輔料，按“2.1”項下方法制備供試品溶液和空白輔料溶液，取對照品，按“2.2”項下方法制備對照品溶液，分別按“2.3”項下的規定進樣分析。如圖4中可見，空白輔料溶液色譜圖中無干擾峰影響定量，對照品溶液與供試品溶液色譜圖中嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸與相鄰峰分離良好(分離度大于1.5)。結果表明本方法專屬性良好。

3.4.2 精密度試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的規定連續進樣6次，測得嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸峰面積RSD為0.68%～1.29%。結果表明儀器精密度良好。

3.4.3 重復性試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“3.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下的規定進樣分析，測得嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸峰面積RSD為0.21%～3.90%。結果表明本方法重復性良好。

3.4.4 穩定性試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、18、24、48、72、96 h進樣，按“2.3”項下的規定進樣分析，測得嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸的峰面積 RSD為0.98%～4.53%。結果表明樣品于96 h內穩定。

3.4.5 線性關系試驗

精密稱取7個對照品，以50%甲醇水溶液溶解并逐級稀釋成一系列不同濃度的工作液。按“2.3”項下的規定進樣分析。于220 nm檢測嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉和異甘草苷，254 nm檢測甘草酸。以濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y繪制工作曲線，計算回歸方程。結果見表3，嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸在相應的質量濃度范圍內線性關系良好。

3.4.6 定量限

取各成分對照品溶液，逐級稀釋測定，滿足S/N≥10，即為定量限。結果表明嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸的定量限為2.3、4.5、7.3、3.8、9.5、4.0、4.8 ng。

3.4.7 加樣回收率試驗

分別取已知含量的同一批號昆藥集團樣品9份，每份約0.0685 g置50 mL量瓶中，精密稱取。分為3組，分別加入供試品中待測定成分量為80%、100%、120%的對照品。以上9份按“2.1”項下方法，自“加50%甲醇適量”開始制備加樣回收供試品溶液，按“2.3”項下的規定進樣分析，計算加樣回收率。嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸的平均加樣回收率分別為104.45%、103.47%、100.07%、100.60%、97.54%、94.73%、102.83%，RSD值分別為0.81%、3.89%、0.68%、0.89%、2.91%、1.52%、1.35%。結果表明本方法回收率良好。

圖3 空白(a和b)、對照品(c和d)和供試品(e和f)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank (a,b)，reference (c,d) and sample (e,f)注：1.嗎啡；2.磷酸可待因；3.芹糖甘草苷；4.甘草苷；5.苯甲酸鈉；6.異甘草苷；7.甘草酸。Note:1.Morphine;2.Codeine phosphate;3.Liquiritinapioside;4.Liquiritin;5.Sodium benzoate;6.Isoliquiritin;7.glycyrrhizic acid.

表3 7種指標成分的線性關系Table 3 Linear relationships of 7 constituents

3.5 樣品含量測定

取18批樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，取嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸對照品，按“2.2”項下方法制備對照品溶液，分別按“2.3”項下的規定進樣分析，根據標準曲線計算各批次樣品中7個化合物的含量，結果見表4。

4 討論

復方甘草片作為復方天然藥物，化學成分復雜，質量受藥材來源及工藝參數等多種因素的影響，其一致性評價方法與化學仿制藥有顯著的區別。中藥、天然藥物的一致性評價是復雜的系統科學，是行業普遍關注的熱點問題，眾多學者提出了多種研究模式與思路[2,6-8]。其中，指紋圖譜和多成分含量測定是較為公認的技術手段與評價方法。建立指紋圖譜分析方法，與多成分含量測定相結合，構建中藥整體成分質量控制體系，已成為中藥質量標準的發展方向[9]。

復方甘草片的指紋圖譜及含量測定方法已有相關文獻報道[10-15]。但不同研究者的角度、研究目的及實驗條件不同，報道的分析方法各異，多數無法在獲得指紋圖譜的同時進行多成分精確含量測定，且測定的指標性成分數量較少。本課題組前期采用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液質聯用技術從復方甘草片中分析鑒定了55個成分[16]。該方法可用于進一步獲取復方甘草片的化學輪廓及55個成分的定量與半定量。但方法測試成本較高且需要配備專門的儀器及分析人員。為解決行業共性問題，本研究基于HPLC及紫外檢測器建立了更為通用的分析方法，更加適于工業界推廣應用。

表4 18批樣品7成分含量測定結果Table 4 Results of content determination of 7 constituents

本研究的色譜條件參考文獻[13]，并在此基礎上進行了優化調整。首先，采用了耐水的反相色譜柱。為保證嗎啡及相鄰色譜峰的基線分離，本方法以98%水相做為起始流動相，耐水色譜填料的使用可避免高水相引起的色譜柱塌陷，延長色譜柱壽命。其次，選擇220 nm為指紋圖譜的檢測波長。該波長下的色譜圖色譜峰數量多，峰形及分離度良好，來源于甘草浸膏粉、阿片粉或罌粟果提取物、八角茴香油的色譜峰及苯甲酸鈉均有體現，且各色譜峰峰面積比例適中。雖然254 nm波長的化學信息也較豐富，但甘草酸色譜峰的峰面積占總峰面積的比例過大，對整體相似度貢獻過大。第三，選擇220 nm做為嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸的定量波長。選擇254 nm做為甘草酸的定量波長。對7個成分進行了完整的含量測定方法學考察。其中嗎啡、磷酸可待因為阿片粉或罌粟果提取物的活性成分，芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷和甘草酸為甘草浸膏粉的特征性成分，且兼顧了苯甲酸鈉，多指標共同定量使分析結果更具代表性。

本研究首先通過指紋圖譜相似度評價法，通過與對照指紋圖譜計算相似度評價藥品質量。18批樣品的相似度均在0.95以上，總體來說，不同廠家、批次復方甘草片的指紋圖譜具有相對較好的一致性。其次對主要共有峰的相對峰面積范圍進行了比較分析。相對峰面積反映了各色譜峰的比例關系，進而更加細致地反映制劑的內在質量。在本研究中，各批次藥品共有峰的相對峰面積在較寬的范圍內波動，客觀反映了不同批次樣品成分比例的差異。本研究進而對7個指標性成分進行了含量測定，18批制劑7成分含量總和的平均值超過處方總重量的10%。18批復方甘草片中，嗎啡、可待因、苯甲酸鈉、甘草酸的含量一致性較好，RSD分別為3.89%、6.20%、6.92%和6.79%。芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷的含量一致性較差，RSD分別為15.86%、18.17%和14.34%。本研究對10個廠家18批次市場流通樣品進行了分析，對復方甘草片的質量進行了初步的摸底性調查研究。但復方甘草片生產企業多，產量大，批次多，未來的工作中，建議利用本研究建立的分析方法，進一步增大樣本數量，對不同廠家、批次樣品的質量情況進行更加深入的調查研究。

阿片粉或罌粟果提取物粉屬于國家管控的麻醉藥品，由指定的企業統一供應，各復方甘草片廠家所用的原料來源相對一致，成品中嗎啡和可待因的含量也相對穩定。甘草浸膏是甘草經加工制成的浸膏[3]，生產廠家較多，來源多樣。甘草為多基源藥材，至少涉及甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.、光果甘草G.glabraL.三種藥用植物[3]，物種本身的化學成分和活性存在差異[17]，野生及栽培藥材的質量參差不齊[9]，不同品種、不同采收期栽培藥材的有效成分含量亦有不同[18]。各廠家浸膏生產工藝的差異進一步造成了甘草浸膏粉的質量差異。復方甘草片現行國家標準[3]對甘草酸含量進行了規定，因此各廠家采取了技術手段以保障甘草酸含量的相對穩定。但是對于未訂入質量標準的成分，如芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷等，批間含量波動較大，一致性較差。在未來的研究工作中，應加強對藥材源頭的研究和管控，系統研究各成分在藥材、中間體、制劑間的轉移傳遞規律，制訂更為科學、合理的質量標準。本研究為進一步研究提供了分析方法和技術保障。

5 結論

本研究建立了復方甘草片的HPLC指紋圖譜及嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸 7成分測定方法。實驗結果表明本方法簡便、快速、準確、可靠，可用于復方甘草片的質量控制，為尋求符合復方甘草片特點的一致性評價路徑提供了新的技術手段和基礎性研究資料。