一種基于異硫氰酸熒光素的pH 納米傳感器制備

楊步高,趙 一,韋曉菲,郁斯婕,譚家軒,王小卉

(北京郵電大學電子工程學院安全生產智能監(jiān)控北京市重點實驗室，北京 100876)

1 引 言

氫離子對生物體的生命活動起著重要的調控作用，一些生命現(xiàn)象的發(fā)生常伴隨著氫離子濃度的變化，因此在細胞水平等微環(huán)境中實時檢測pH變化具有重要的意義[1-2]。傳統(tǒng)的宏觀pH電化學和光纖傳感器無法精確監(jiān)測細胞等微環(huán)境的pH變化，發(fā)展分子結構或納米量級的pH傳感器可有效實現(xiàn)微環(huán)境檢測[3-5]。在常用的pH檢測方法中，基于熒光信號變化的檢測方法具有高的靈敏度、良好的選擇性和非侵入性等優(yōu)點，受到研究者的廣泛關注[6-8]。異硫氰酸熒光素(FITC)是一種常見的pH敏感熒光染料分子，對pH值的變化能夠迅速響應，且具有高的靈敏度[9-11]。但是熒光分子探針存在光漂白及細胞毒副作用等缺陷，影響檢測結果的準確性。相比于單個熒光染料分子，通過納米顆粒負載熒光染料可提高探針的穩(wěn)定性和發(fā)光強度[12-14]。在熒光生物分析中，熒光納米顆粒正逐漸代替熒光探針分子，在生物標記、成像示蹤和傳感檢測中發(fā)揮著重要的作用[15-17]。

本文利用共沉淀法制備了封裝pH敏感染料FITC的納米顆粒(FITC-NPs)，在納米顆粒中，選擇聚苯乙烯(PS)和十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)為基質材料，F(xiàn)ITC被封裝于顆粒內部，顆粒外表面則包覆多聚賴氨酸殼層(PLL)。異硫氰酸熒光素的熒光強度隨pH增加而逐漸增強，基于納米傳感器的熒光信號變化能夠快速地對pH值的變化作出響應，多聚賴氨酸的表面修飾可提高納米傳感器的生物相容性和細胞吞噬效率，將促進納米傳感器在細胞內pH值檢測方面的應用。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

試劑：異硫氰酸熒光素(FITC)、多聚賴氨酸(PLL)和聚苯乙烯(PS)購自Sigma-Aldrich，十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)購于瑪雅試劑，四氫呋喃(THF)購自國藥集團化學試劑有限公司，實驗過程中均使用去離子水。

熒光pH納米傳感器的激發(fā)和發(fā)射光譜由日立公司生產的F-4600熒光分光光度計測得；納米顆粒的形貌由日立JEM 1400EX透射電子顯微鏡進行表征；利用馬爾文Nano ZS90粒度儀分析納米顆粒的動態(tài)光散射粒徑(DLS)；利用日本分光株式會社V-550分光光度計測試紫外-可見吸收光譜；通過日本尼康公司生產的A1Rsi共聚焦激光掃描顯微鏡進行細胞熒光成像。

2.2 樣品的制備方法與步驟

熒光pH納米傳感器采用共沉淀法進行制備。 首先，配置FITC(2×10-4)、PS(2×10-3)和DTS(2×10-3)的四氫呋喃(THF)溶液，待其溶解后，按照質量比為10∶45∶45進行混合，通過添加THF使最終樣品濃度為5×10-4；然后，在超聲振蕩的條件下，將混合溶液注入到含有0.02 mg/mL PLL的去離子水溶液(pH＝9)中，隨后避光靜置2 h后，再于去離子水中透析12 h以去除有機溶劑，即可得到熒光pH納米傳感顆粒。

3 結果與討論

3.1 熒光pH納米傳感器的制備與表征

利用共沉淀法制備熒光pH納米傳感器[18-19]。將異硫氰酸熒光素(FITC)、十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)和聚苯乙烯(PS)的混合溶液在超聲環(huán)境中注入到含有多聚賴氨酸(PLL)的水溶液中，疏水性物質縮聚形成納米顆粒。納米顆粒的結構如圖1(a)所示，F(xiàn)ITC隨機分散于納米顆粒核心部位，硅氧烷水解縮聚在納米顆粒表面形成二氧化硅殼層，吸附帶正電的多聚賴氨酸分子形成PLL包覆的納米顆粒(FITC-NPs)。納米顆粒的形貌通過透射電子顯微鏡(TEM)進行表征，如圖1(b)所示，顆粒呈球狀，具有良好的分散性。通過分析該納米顆粒溶液的動態(tài)光散射粒徑分布(圖1(c))，發(fā)現(xiàn)納米顆粒的水合粒徑平均值在150 nm左右。為了分析熒光pH納米傳感器的發(fā)光特性，我們對其進行吸收和發(fā)射光譜表征。從圖2中可以看出，F(xiàn)ITC的吸收峰在495 nm左右，發(fā)射峰位于520 nm左右，對于 FITC-NPs，其在480 nm光激發(fā)下產生位于520 nm處對應于FITC的發(fā)射峰(圖3(a))，證明FITC成功摻雜于納米顆粒中，形成熒光pH納米傳感器。

圖1 (a)pH納米傳感器的結構示意圖；(b)納米傳感器的TEM圖像；(c)納米傳感器的動態(tài)光散射粒徑分布。Fig.1 (a)Schematic illustration of FITC-NPs.(b)TEM images of pH nanosensors.(c)Hydrodynamic diameter of nanosensors measured by DLS.

圖2 FITC的吸收和發(fā)射光譜Fig.2 Absorption and emission spectra of FITC dissolved in THF aqueous

3.2 納米傳感器的pH響應特性

為了研究納米傳感器的pH響應特性，我們分析了不同pH條件下納米傳感器發(fā)光強度的變化。如圖3(a)所示，隨著pH值的升高，納米傳感器在520 nm處的發(fā)射峰強度也逐漸增強，這是由于FITC對pH具有高的敏感性。為進一步分析納米傳感器的pH敏感性，利用 FITC-NPs在520 nm處熒光發(fā)射強度與不同pH的Sigmoidal擬合曲線(圖3(b))，計算得到 pKa值為6.07[20]。當pH值由3增加到5時，納米傳感器熒光強度增長較為緩慢；pH值由5上升到7時，熒光強度迅速增加；而pH值大于7以后，熒光強度增長趨于緩慢。當pH從3變到9時，熒光強度增大約38倍，表明該納米傳感器對pH具有良好的靈敏度。

圖3 (a)納米傳感器在不同pH環(huán)境中的發(fā)射光譜；(b)熒光強度在不同pH環(huán)境中的響應擬合曲線。Fig.3 (a)Emission spectra of nanosensors at various pH concentrations.(b)Sigmoidal fitting plot of fluorescence intensity.The experiment data were calculated from Fig.3(a).

熒光pH納米傳感器的光穩(wěn)定性對檢測精確度具有重要影響，為分析FITC-NPs的光穩(wěn)定性，本文對比研究FITC溶于THF溶液中和摻雜于納米顆粒內的光泄漏情況(圖4)。在480 nm光持續(xù)輻照條件下，通過光譜儀表征納米顆粒隨光照時間變化的熒光響應。在相同輻照條件下，對比于四氫呋喃溶液中的 FITC發(fā)光強度，納米顆粒中FITC的發(fā)光強度下降較少，表明摻雜FITC的納米傳感器有較好的光穩(wěn)定性。

圖4 FITC在THF溶液中和納米顆粒中的光穩(wěn)定性Fig.4 Photobleaching of FITC in THF and NPs

為了研究熒光pH納米傳感器的可逆性，將納米傳感器交替置于pH為3和9的環(huán)境中，然后對其發(fā)射光譜變化情況進行表征。如圖5所示，當緩沖液的pH于3和9之間交替變化時，納米傳感器的熒光強度可以隨著pH值的改變而迅速恢復到原有水平。實驗結果表明該熒光pH納米傳感器具有良好的可逆性。

圖5 納米傳感器熒光強度對pH響應的可逆性Fig.5 Reversibility of the responsiveness of nanosensor towards pH

3.3 熒光pH納米傳感器的生物相容性

細胞代謝過程受細胞內pH的調控，細胞內pH的檢測可為研究單個細胞的生理和病理過程提供重要信息，pH納米傳感器的生物相容性及細胞吞噬效率是影響細胞內pH檢測的重要因素。為驗證FITC-NPs的生物相容性，我們通過MTT毒性檢測方法分析了FITC-NPs對細胞存活率的影響(圖6)。首先在96孔板中，將HepG2細胞以每孔8 000個細胞的密度進行接種；培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的 FITC-NPs分散液(5，10，15，20，25 mg/L)；孵育24 h后，每孔加入0.02 mL的MTT溶液；4 h后清除孔內廢液，每孔加入0.15 mL DMSO，利用酶標儀測定樣品在490 nm波長處的光吸收值，進而來評估細胞的相對成活數(shù)量。從圖中可以看出，未吞噬納米顆粒的HepG2細胞的存活率為100%，當納米顆粒的濃度從5 mg/L逐漸增加至20 mg/L時，均未對細胞活性產生明顯抑制作用，實驗結果表明熒光pH納米傳感器具有良好的生物相容性。

圖6 利用MTT法檢測FITC-NPs對HepG2細胞的毒性Fig.6 Viability of HepG2 cells loaded with FITC-NPs at various concentrations determined by MTT assay

細胞對納米傳感器的吞噬效率是細胞內pH檢測的關鍵，通過共聚焦顯微鏡成像觀察FITCNPs在HepG2細胞中的分布情況。首先將HepG2細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中孵育過夜，加入含有FITC-NPs(20 mg/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；然后進行激光共聚焦熒光成像，激發(fā)波長選擇488 nm，發(fā)射光收集波段選擇520～580 nm。如圖7所示，HepG2細胞中可以檢測到FITC-NPs的綠色熒光信號，納米顆粒主要分布于細胞質中，并未進入細胞核內；納米顆粒的吞噬過程主要是基于細胞的內吞作用，位于細胞質中的納米顆粒發(fā)光分布不均勻，可能是因為顆粒產生積聚。共聚焦成像結果表明熒光pH納米傳感器具有良好的生物相容性，能夠被細胞有效吞噬，有利于細胞內pH的檢測應用。

圖7 負載FITC-NPs的HepG2細胞的明場成像(a)、共聚焦成像(b)和疊加圖(c)。Fig.7 DIC(a)，confocal fluorescence images(b)and overlay fluorescence image(c)of HepG2 cells loaded with FITC-NPs.

4 結 論

本文利用共沉淀法制備了一種新型的熒光pH納米傳感器。該納米傳感器采用異硫氰酸熒光素作為pH敏感染料分子，異硫氰酸熒光素熒光強度隨pH增加而上升，當pH值從3變至9時，熒光強度增大約38倍，pKa值為 6.07，納米傳感器熒光信號具有良好的pH響應靈敏度。該熒光pH納米傳感器具有小粒徑、高靈敏度、較好的光穩(wěn)定性、良好的可逆性和生物相容性。通過激光共聚焦成像表明該傳感器具有較高的細胞吞噬效率，在細胞內pH值的實時動態(tài)監(jiān)測方面具有廣闊的應用前景。