培養條件對奇異變形桿菌生物膜生長的影響

張曉婷,鄧一秒,董冬麗,杜文琪,吳希陽,唐書澤

(暨南大學理工學院食品科學與工程系,廣東廣州 510632)

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis,P.mirabilis)屬于腸桿菌科,變形桿菌屬,是一類無莢膜、無芽孢、兼性厭氧性革蘭氏陰性細菌。變形桿菌為條件致病菌,包含8類菌種,人類52.0%～76.9%的變形桿菌病由P.mirabilis引發[1]。P.mirabilis是尿路系統最常見病原菌,大部分泌尿道感染(Urinary tract infection,UTI)是由于胃腸道P.mirabilis繁殖引起的,另一些是由于人與人之間的傳播[2]。P.mirabilis在健康人腸道帶菌率為1.3%～10.4%[3],其廣泛分布于自然界、動物糞便、人和動物腸道中,易污染動物性食物,特別是熟肉以及內臟的熟制品,引發細菌性食物中毒。常見主要發病類型有感染型急性胃腸炎、毒素型急性胃腸炎、過敏型組胺中毒三種[4],占食源性細菌性疾病比重較大,并呈逐年上升趨勢。根據我國公布的細菌性食物中毒病原譜,P.mirabilis中毒僅次于副溶血弧菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌,成為引起食物中毒的第四大主要病原菌[5]。越來越多的研究表明,單純由浮游菌引起的細菌中毒并不常見,據美國國家健康研究所和疾控中心報道,世界上65%的微生物疾病都與細菌生物膜相關[6]。

生物膜由浮游菌粘附在固體介質表面,被細菌群體自身分泌的胞外多聚物(Extracellular polymeric substances,EPS)和表面蛋白質等基質包裹。生物膜的形態結構、生物學特性、致病性以及對環境因子的敏感性都與浮游菌存在顯著差異[7-8]。生物膜的耐藥性是浮游菌的1000多倍,由于菌群中的特殊亞群——持留菌的存在,成熟后的生物膜由于外部流體剪切力增強和內部因素如內源性酶降解、EPS或表面結合蛋白的釋放[9],浮游菌可再次進入生物膜循環,成為新的污染源[10]。生物膜中含有的持留菌對環境如干燥、紫外線、殺菌劑、消毒劑等具有更強的抗逆能力,因而更難被殺滅,增加食品安全隱患和消費者健康風險[11]。

近年來,有關P.mirabilis的研究主要集中在由浮游菌導致的食物中毒的毒力因子及其致病機制[12]。生物膜的研究主要集中于醫療,尤其是UTI中生物膜防控和耐藥性研究報道較多,有關食品生產加工過程中環境因素對生物膜形成的影響,尤其是細菌粘附材料對生物膜形成的影響少有報道。本文通過建立P.mirabilis生物膜體外模型,研究不同培養條件對P.mirabilis生物膜形成的影響,以期為食品生產加工過中可能出現的變形桿菌污染提供防控技術支撐,降低食品安全風險。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奇異變形桿菌CMCC49005 廣州市疾病預防控制中心;LB肉湯培養基、LB瓊脂培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;結晶紫 Sigma;體積分數10%甲醇、33%冰乙酸 天津市科密歐化學試劑有限公司;硼酸、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖 天津市大茂化學試劑廠;低聚果糖 源葉生物;氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉 廣州化學試劑廠;pH=7.4無菌磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer solutions,PBS) 博士德生物工程有限公司。

多功能酶標儀(Infiniti M200pro,Switzerland) 帝肯貿易有限公司;6/96孔細胞培養板(Costar) 上海田源生物技術有限公司;蓋玻片(玻璃材質,20 mm×20 mm) 廣州健陽生物技術有限公司;2.5 L密封培養罐、三菱原裝MGC 2.5 L CO2產氣袋 廣州美其實驗設備科技有限公司;硅膠片(食品級,20 mm×20 mm) 上海杰炎橡塑五金經營部;聚丙烯(PP,20 mm×20 mm) 深圳市同興泰五金材料有限公司;實木片(20 mm×20 mm) 德清美倫裝飾材料有限公司;智能數字超聲儀器(KQ-350D) 東莞市科橋超聲波設備有限公司;渦旋振蕩儀(QL-901) 海門其林貝爾儀器制造公司;離心機(QL-901) 科大創新股份有限公司;恒溫培養箱(YCE-2000) 上海實驗儀器廠有限公司;掃描電子顯微鏡(LSM700) 德國Zeiss。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備 準確挑取單菌落進行傳代培養,后取單菌落接種于5 mL LB肉湯中,37 ℃、160 r/min震蕩培養14 h至生長穩定期,1075×g離心10 min后棄上清,5 mL PBS沖洗2次,最后懸浮于5 mL PBS中,調整其最終OD600=0.5(約108CFU/mL)用于后續實驗,剩余菌懸液置于4 ℃冰箱中儲存備用。

1.2.2P.mirabilis生物膜形成與測定 采用結晶紫染色法定量生物膜:在96孔細胞培養板中加入190 μL LB肉湯,再接種10 μL菌懸液混勻,以200 μL LB肉湯作為無菌對照,37 ℃培養24 h后,吸管緩慢吸出孔中培養物,每孔用250 μL無菌PBS清洗3次以除去所有浮游菌。自然風干后每孔加入200 μL 10%甲醇固定15 min后吸出甲醇,自然風干后每孔加入200 μL 0.1%結晶紫溶液,染色10 min后吸出結晶紫染色液,用無菌PBS把多余的染料沖洗3～5次至溶液呈無色,完全風干后,每孔加入160 μL 33%冰乙酸溶液[13],振蕩器振搖5 min以溶解結晶紫并測定培養孔中溶液的OD570值,每組設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

1.2.3 初始菌濃度對P.mirabilis生物膜成膜的影響 配置初始濃度108、107、106、105、104、103、102、101CFU/mL的菌懸液,在96孔細胞培養板中加入190 μL的LB肉湯(pH=7.0±0.2;葡萄糖質量分數0.10%;NaCl質量分數0.50%),再接種10 μL不同濃度的菌懸液混勻,以200 μL LB肉湯作為無菌對照,在37 ℃,有氧狀態下培養24 h,按照1.2.2的方法測定OD570值,每組設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

1.2.4 培養環境對P.mirabilis生物膜成膜的影響

1.2.4.1 培養溫度和時間對P.mirabilis生物膜成膜的影響 在96孔板中加入10 μL 1.2.1制備的菌懸液后加入190 μL LB肉湯(pH=7.0±0.2;葡萄糖質量分數0.10%;NaCl質量分數0.50%),以200 μL LB肉湯作為無菌對照,在4、13、25、37、42 ℃,有氧狀態下培養4、8、12、24、36、48、60 h。按照1.2.2的方法測定OD570值,每組設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

1.2.4.2 氣體環境和時間對P.mirabilis生物膜成膜的影響 在96孔板中加入10 μL 1.2.1制備的菌懸液后加入190 μL LB肉湯(pH=7.0±0.2;葡萄糖質量分數0.10%;NaCl質量分數0.50%),將CO2產氣袋置于密封培養灌內制造無氧環境,將96孔板分別置于有氧和無氧狀態下,37 ℃下培養4、8、12、24、36、48、60 h。按照1.2.2的方法測定OD570值,每組設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

1.2.5 培養基對P.mirabilis生物膜成膜的影響

1.2.5.1 pH對P.mirabilis生物膜成膜的影響 用體積分數為10% HCl和質量分數為10% NaOH調節配置pH3.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、11.0的LB肉湯(葡萄糖質量分數0.10%;NaCl質量分數0.50%),121 ℃高壓滅菌15 min,在96孔板中加入10 μL 1.2.1制備的菌懸液后加入190 μL不同pH的LB肉湯,以200 μL LB肉湯作為無菌對照,在37 ℃,有氧狀態下培養24 h,按照1.2.2的方法測定OD570值,每組設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

1.2.5.2 NaCl含量對P.mirabilis生物膜成膜的影響 向LB肉湯中添加NaCl至質量分數為0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、7.0、10.0%,121 ℃高壓滅菌15 min,在96孔板中加入10 μL 1.2.1制備的菌懸液后加入190 μL不同鹽濃度的LB肉湯(pH=7.0±0.2;葡萄糖質量分數0.10%),以200 μL LB肉湯作為無菌對照,在37 ℃,有氧狀態下培養24 h,按照1.2.2的方法測定OD570值,每組設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

1.2.5.3 碳源種類和濃度對P.mirabilis生物膜成膜的影響 向LB肉湯中添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、低聚果糖至質量分數為0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%,121 ℃高壓滅菌15 min,在96孔板中加入10 μL 1.2.1制備的菌懸液后加入190 μL LB肉湯(pH=7.0±0.2;NaCl質量分數0.50%),以200 μL LB肉湯作為無菌對照,在37 ℃,有氧狀態下培養24 h,按照1.2.2的方法測定OD值,每組設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

2016年筆者采用培訓結束時，安排現場提問的環節，獲得比較好的反響。并且大概了解了本科學歷以上的員工基本都使用過類似的數據庫檢索和下載文章，大專學歷的員工相對不太熟悉，而這部分員工大部分是臨床護理人員，平時工作比較繁忙，因此，大專學歷的員工是筆者重要的服務對象，可以在授課之前先了解這部分員工的數量。

1.2.5.4 培養基用量對P.mirabilis生物膜成膜的影響 配置用量減半、正常和雙倍的LB肉湯培養基,121 ℃高壓滅菌15 min,在96孔板中加入10 μL 1.2.1制備的菌懸液后加入190 μL LB肉湯,以200 μL正常濃度LB肉湯作為無菌對照,在37 ℃,有氧狀態下培養24 h,按照1.2.2的方法測定OD值,每組設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

1.2.6 接觸材料對生物膜成膜的影響

1.2.6.1 接觸材料前處理 將蓋玻片、6孔板、96孔板在75%的乙醇中浸泡24 h后在超凈工作臺中晾干,紫外殺菌30 min。硅膠、PP、木片首先在40 kHz超聲下處理30 min,然后在甲醇中浸泡30 min,121 ℃高壓滅菌15 min,在超凈工作臺中晾干,紫外殺菌30 min[14]。

1.2.6.2 載體表面P.mirabilis生物膜內活菌計數 將前處理后的4種不同載體置于6孔板中,每孔加入200 μL菌懸液,再加入5 mL LB肉湯,對照組只加5 mL LB肉湯,在37 ℃,有氧狀態下培養24、48、72 h。將長有生物膜的薄片經無菌PBS漂洗5次,將薄片放入裝有10 mL含有玻璃珠的無菌PBS中,40 kHz超聲10 min后1200 r/min渦旋振蕩2 min至生物膜完全洗脫,取100 μL菌液進行10倍系列梯度稀釋,選取3個合適梯度菌液置于平板中,注入約15 mL添加0.1%硼酸的LB瓊脂培養基[15],37 ℃恒溫培養箱內培養24 h后進行活菌計數,每個稀釋梯度設置3個平行,試驗重復3次,結果為實驗組平均值與對照值之差。

1.2.6.3 掃描電鏡觀察P.mirabilis生物膜結構 將前處理后的4種不同載體置于6孔板中,每孔加入200 μL菌懸液,再加入5 mL LB肉湯,在37 ℃,有氧狀態下培養24 h。經過24 h培養后將長有生物膜的薄片置于新的6孔板中,用無菌PBS沖洗除去浮游菌,2.5%的戊二醛固定樣品4 h,PBS沖洗后依次用30%、50%、70%、80%、100%乙醇梯度對樣品進行脫水,每個梯度15 min,進行CO2臨界點干燥,噴金,置于掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)下進行觀察、拍照[16]。

1.3 數據處理

實驗重復三次,并采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析,結果用平均值±標準差表示,方差分析采用ANOVA分析各實驗組間、組內的顯著性差異,P<0.05 表明有顯著性差異;采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 初始菌濃度對P. mirabilis生物膜成膜的影響

圖1 初始菌濃度對奇異變形桿菌生物膜形成的影響Fig.1 Effects of initial bacterial concentrationon biofilm formation of P. mirabilis注:不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05),圖4～圖5同。

2.2 培養溫度和氣體環境對P. mirabilis生物膜成膜的影響

2.2.1 培養溫度和時間對P.mirabilis生物膜成膜的影響 不同培養溫度和時間,P.mirabilis生物膜形成量表現出較大的變化,溫度不僅可以影響細菌的生理狀態,還可以影響生物膜成分的物理性質[10]。圖2顯示,在25～37 ℃范圍內,生物膜的形成條件適宜,37 ℃生物膜形成量最高,4 h完成初粘附,4～8 h即可完成粘附,8～24 h形成成熟、穩定的生物膜,之后生物膜脫落,P.mirabilis進入下一個生長周期。喻華英等[18]通過研究大腸桿菌生物膜生長曲線指出,由于營養物質有限,代謝物質累積,浮游菌進入一種類芽孢狀態,下一個生長周期的生物膜峰值與第一個相比降低。在4、13、42 ℃下,生物膜量呈緩慢遞增趨勢,溫度會影響酶活,細菌營養代謝依賴酶的活性,遠離最佳生長溫度使細菌代謝活力降低,進而使生物膜生長周期變長[19]。

圖2 不同溫度下P. mirabilis生物膜形成量的光密度值隨時間的變化Fig.2 Changes of optical density value of P. mirabilisbiofilm formation at different temperatures with time

2.2.2 氣體環境和時間對P.mirabilis生物膜成膜的影響P.mirabilis是一種兼性厭氧菌,其在有氧和無氧狀態下均能繁殖[20]。氧氣可用性決定細菌能量產生,減少氧氣會導致細菌生長緩慢[21],因此氣體環境對生物膜形成具有潛在影響。圖3表明,氧氣充分條件下,24 h生物膜量達到峰值,完成第一個生長周期,在無氧環境下P.mirabilis生物膜生長緩慢,36 h還未完成粘附,不利于生物膜生長和成熟。因此P.mirabilis生物膜形成能力顯著依賴于氧氣含量。

圖3 不同氣體環境下P. mirabilis生物膜形成量的光密度值隨時間的變化Fig.3 Changes of optical density value of P. mirabilisbiofilm formation at aerobic and anaerobic conditions with time

2.3 培養基成分對P. mirabilis生物膜成膜的影響

2.3.1 pH對P.mirabilis生物膜成膜的影響 酸堿條件下會改變生物膜的物理化學性質并影響細菌粘附的基因表達[22]。初始pH3.0～5.0強酸性環境不利于細菌的生長,P.mirabilis很難形成生物膜(見圖4)。裴標等[23]研究發現P.mirabilis在pH8.0～10.0的堿性蛋白胨水中生長良好,表明該菌具有嗜堿性,本實驗證明P.mirabilis在pH8.0時生物膜量最大,pH11.0時,P.mirabilis仍能形成一定量的生物膜,進一步表明P.mirabilis是一種尿液病原體,在堿性導尿管表面易形成生物膜[10]。

圖4 初始培養基pH對P. mirabilis生物膜形成的影響Fig.4 Effects of medium initial pHon P. mirabilis biofilm formation

2.3.2 NaCl含量對P.mirabilis生物膜成膜的影響P.mirabilis屬于耐鹽菌,在1.0%～10.0%的NaCl的溶液中均能生長[24]。圖5顯示,菌膜量隨NaCl濃度增加而增大,NaCl質量分數2.0%對生物膜形成具有很強的促進作用,為原LB肉湯(NaCl質量分數0.50%)的1.24倍。NaCl質量分數超過2.0%后,菌膜量不斷下降,NaCl質量分數10%幾乎不產生生物膜。

圖5 初始鹽濃度對P. mirabilis生物膜形成的影響Fig.5 Effects of medium initial salinityon P. mirabilis biofilm formation

2.3.3 碳源種類和濃度對P.mirabilis生物膜成膜的影響 碳源種類和濃度均對生物膜的形成有顯著影響(P<0.05)(圖6)。在LB肉湯中添加質量分數為0.2%～1.0%麥芽糖對生物膜生長有明顯的促進作用,麥芽糖質量分數為1.0%時達到生物膜量峰值;向原LB肉湯(葡萄糖質量分數0.10%)中添加葡萄糖、蔗糖和低聚果糖的質量分數超過0.20%,麥芽糖質量分數超過1.0%對生物膜形成量有抑制作用,抑制作用隨添加量的增加而增加,抑制順序從大到小依次為:低聚果糖>葡萄糖>蔗糖>麥芽糖。

圖6 碳源種類和濃度對P. mirabilis生物膜形成的影響Fig.6 Effects of carbon source type and concentrationon P. mirabilis biofilm formation

2.3.4 培養基用量對P.mirabilis生物膜成膜的影響 LB肉湯培養基用量對生物膜的形成影響顯著(圖7)。正常培養基營養物質含量(蛋白質質量分數1.0%;NaCl質量分數0.50%;葡萄糖質量分數0.10%;酵母膏質量分數0.50%)和培養基用量加倍,生物膜量均在24 h達到峰值,用量加倍的培養基生物膜量顯著高于另外兩組(P<0.05),說明P.mirabilis在富營養環境下更有利于生物膜生成,培養基用量減半的生物膜形成速率降低,生長周期延長,生物膜形成能力減弱。

圖7 培養基用量對P. mirabilis生物膜形成的影響Fig.7 Effects of medium dosageon P. mirabilis biofilm formation

2.4 接觸材料對P. mirabilis生物膜的影響

2.4.1 對P.mirabilis生物膜內活菌數的影響 不同的接觸材料在不同的培養時間下對生物膜內活菌數具有顯著影響(P<0.05)(圖8)。自然環境下調控生物膜形成方法之一是改變材料表面特征。有研究表明,通過研究特殊材料或對材料表面進行物理化學修飾可控制生物膜形成過程[25]。PP、木片、硅膠、玻璃是食品加工設備和器具中常用的原材料,圖8反應了在其他條件相同條件下,分別培養24、48、72 h后,通過平板計數法測得4種不同材料表面上的生物膜內的活菌數目。24 h后,4種材料表面形成的生物膜內活菌數差異顯著,其中木片粘附的菌體數目最多,硅膠次之,蓋玻片和PP較少。菌體在木片、硅膠和蓋玻片上培養24 h之后生物膜活菌總量遞減,而菌體在PP片培養48 h后才形成較多生物膜,48 h后生物膜量降低。在生物膜形成的初始粘附階段,接觸材料表面的電荷性、親疏水性及表面粗糙度都會直接影響微生物的附著、固定。Hyde等[26]研究發現疏水性表面的細菌粘附及生物膜成熟速度比親水性表面要慢,因此P.mirabilis更易在親水性材料表面附著,玻璃、硅膠、木材都為親水表面,PP為疏水表面。在正常環境下,微生物表面為負電荷,更易附著在帶正電荷的材料表面,材料的粗糙度,表面的縫隙、凸起都會影響細菌的粘附[27]。

圖8 接觸材料對P. mirabilis生物膜形成的影響Fig.8 Effects of contact materialson P. mirabilis biofilm formation注:不同大寫字母代表相同培養時間下不同材料之間具有顯著性差異(P<0.05);不同小寫字母表示同種材料不同培養時間具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4.2P.mirabilis生物膜SEM結構觀察 圖9為P.mirabilis經過24 h培養在木片、PP片、硅膠、蓋玻片4種不同食品接觸材料下形成的生物膜掃描電鏡顯微結構圖。從圖中可見,木片表面粗糙且不均勻,有明顯的孔隙、溝壑(圖9a)。在木片上聚集的菌體在整個區域生長,菌體之間通過大量的卷曲菌毛粘連在一起,細菌鞭毛、菌毛和菌毛的附屬物克服電雙層的物理排斥力,可以鞏固細菌-基質結合[19],在細胞外聚集形成廣泛的無定形基質,參與生物膜的發育[28]。PP片表面平整,有明顯的裂紋和深淺不一的孔隙,菌體在空隙內菌體數量偏多,分泌的細胞外基質少,24 h內未形成穩定生物膜結構(圖9b)。硅膠片表面平整,有較多溝紋,無明顯孔隙,硅膠片上形成蘑菇狀生物膜結構,菌體被EPS包裹,集中在溝壑較深的部位(圖9c)。玻璃材質的蓋玻片最為光滑,無明顯溝紋,幾乎看不到孔隙,蓋玻片上的菌體連接在一起,生物膜被EPS包裹緊密,結構呈扁平狀(圖9d)。P.mirabilis生物膜結構有蘑菇狀和扁平狀兩種,其不僅受碳源種類和培養基種類的影響[29],也受接觸材料的影響。

圖9 不同接觸材料表面形成P. mirabilis生物膜的SEM圖Fig.9 SEM images of P. mirabilis biofilm formedon the surface of different contact materials

3 結論

本文研究表明,奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)容易形成抗性較強的生物膜。初始菌濃度很低(10 CFU/cm2)時,經過一定時間培養也能成膜。培養基營養組成、用量、環境條件以及接觸表面材料特性對P.mirabilis生物膜形成具有顯著影響。P.mirabilis形成生物膜的最適環境:溫度37 ℃、有氧狀態下培養24 h;最適培養基組成:pH8.0、NaCl質量分數2.0%、麥芽糖質量分數1.0%;在富營養環境和粗糙的木片上P.mirabilis更易成膜。食品加工過程中綜合運用這些條件,通過遠離最適培養環境,調控營養組分并避免富營養環境的形成,選擇合適的接觸材料,有可能達到預防和控制P.mirabilis生物膜形成的目的,從而確保加工食品的生物安全性。