酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的工藝優(yōu)化

朱德艷

(荊楚理工學(xué)院,湖北荊門 448000)

葛根是豆科植物野葛的干燥根[1-2],是我國傳統(tǒng)的常用中藥材之一,可藥食兩用。葛根的化學(xué)成分主要有黃酮類、三萜皂苷類、葛酚苷類、香豆素類、有機(jī)酸等[3]。《藥典》中記載“葛根味甘、辛,性涼,歸脾、胃、肺經(jīng),解肌退熱,生津止渴,透疹,升陽止瀉,通經(jīng)活絡(luò),解酒毒”是臨床應(yīng)用較為廣泛的一種中藥[4]。在現(xiàn)代科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)葛根還具有保肝護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、降血糖、抗氧化、降血糖、降血壓、抗炎、雌激素樣作用、改善腎功能、增加骨密度、保護(hù)神經(jīng)等藥理功能[5-7]。葛根中含有大量膳食纖維,可調(diào)理腸胃,有助于排出體內(nèi)毒素;長期食用還可以使皮膚光滑,美容養(yǎng)顏。而且葛根中還富含了大量的黃酮類化合物,是一種天然抗氧化劑,且具有降血脂、增強(qiáng)免疫力等多種功效[8-12]。

酵素是采用一種或多種原料,經(jīng)有益菌發(fā)酵的含有多種酶和次級代謝產(chǎn)物等成分的發(fā)酵產(chǎn)品[13],是一類特殊的具有催化功能的復(fù)雜蛋白質(zhì),一部分由人體自身生成,一部分由飲食補(bǔ)充。對機(jī)體健康而言,酵素扮演著不可或缺的角色,其數(shù)量減少或性能衰退會引發(fā)各種不適癥狀[14]。酵素的功能很多,可以促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)胃腸道的消化吸收、調(diào)節(jié)人體機(jī)能、抗氧化性、抗疲勞、美容養(yǎng)顏等[15-18]。近年來,隨著人們生活水平質(zhì)量的提高,越來越多的人都很注重提高自身的健康和保健,對于保健品和健康的飲食的需求也越來越高,而“體內(nèi)酵素的性能和數(shù)量”是衡量健康的一項(xiàng)重要指標(biāo)[19]。

韓國、日本、歐洲等國家較早對酵素進(jìn)行了研究與開發(fā)[20-27],國內(nèi)現(xiàn)在逐漸研發(fā)了一些新型的酵素飲品[28-30],但對于復(fù)雜的發(fā)酵過程及加工工藝研究不夠深入[31]。本實(shí)驗(yàn)以葛根為主要原料,在單因素的基礎(chǔ)上,以黃酮含量為響應(yīng)值[32],采用響應(yīng)面優(yōu)化酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的工藝參數(shù),為葛根的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根 湖北省仙之靈食品有限公司;蕓香葉苷(盧丁) 成都曼思特生物科技有限公司;高效活酵母 安琪酵母股份有限公司;纖維素淀粉酶 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司,亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙醇、檸檬酸 均為分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;碳酸氫鈉、葡萄糖 均為分析純,天津市廣成化學(xué)試劑有限公司。

JY1002電子天平 上海上天精密儀器有限公司;DK-98-1恒溫水浴鍋 亞榮生化儀器廠;YC10-18L高壓蒸汽滅菌鍋 北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司;DH-600電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司;PH20恒溫?fù)u床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司,LB20T手持測糖儀 廣州銘睿電子科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根酵素的加工工藝流程 葛根酵素工藝流程見圖1。葛根清洗后,烘干粉碎,按照比例1∶10 g/mL加入蒸餾水進(jìn)行混合,加熱煮沸1 h,冷卻后加入纖維素淀粉酶進(jìn)行酶解,酶的添加量為14 U/g,在50 ℃的水浴中酶解2 h。在酶解完成后的葛根試液中按照1∶10 g/mL的比例加入白砂糖調(diào)節(jié)葛根溶液的糖度,調(diào)整糖度至18%。將高效活酵母按1%的比例進(jìn)行配制,準(zhǔn)確稱量后加入到溫度為35 ℃的糖水中溶解活化,放置30 min后備用。將處理好的葛根試液裝瓶后放入高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌,在90 ℃的溫度下,滅菌15 min后冷卻至室溫。向處理好的葛根試液中,按照試驗(yàn)中要求的比例接種活化后的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵。向接種好的葛根試液,在試驗(yàn)要求的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液的pH和菌種的接種量的條件下,靜置發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后測量葛根酵素中黃酮的含量確定最佳的發(fā)酵工藝。

圖1 工藝流程Fig.1 Technological process

1.2.2 葛根酵素中黃酮含量的測定 葛根酵素中黃酮含量的測定方法參考文獻(xiàn)[33]。選取蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,在500 nm處測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=9.8943X+0.0021,R2=0.9994。參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線,測量發(fā)酵液的吸光度,確定發(fā)酵液中黃酮含量。

1.2.3 酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 發(fā)酵時(shí)間確定 按1.2.1制備葛根液,設(shè)發(fā)酵時(shí)間為24、48、72、96、120 h,其他固定因素是:酵母菌的接種量2%,發(fā)酵初始pH4.5,發(fā)酵溫度30 ℃。發(fā)酵結(jié)束后,測定發(fā)酵液中黃酮的含量。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度的確定 按1.2.1制備葛根液,設(shè)發(fā)酵溫度為25、27、29、31、33 ℃,其他固定因素是:酵母菌的接種量2%,,發(fā)酵初始pH4.5,發(fā)酵時(shí)間72 h。發(fā)酵結(jié)束后,測定發(fā)酵液中黃酮的含量。

1.2.3.3 發(fā)酵液初始pH的確定 按1.3.1制備葛根液,設(shè)發(fā)酵初始pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,其他固定因素是:酵母菌的接種量2%,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時(shí)間72 h。發(fā)酵結(jié)束后,測定發(fā)酵液中黃酮的含量。

1.2.3.4 菌種接種量的確定 按1.2.1制備葛根液,設(shè)酵母菌的接種量為1%、2%、3%、4%、5%,其他固定因素是:發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵初始pH4.5,發(fā)酵時(shí)間72 h。發(fā)酵結(jié)束后,測定發(fā)酵液中黃酮的含量。

1.2.4 酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的工藝優(yōu)化 本試驗(yàn)采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析確定因素水平,以黃酮含量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析(Response surface methodology,RSM)試驗(yàn)。以發(fā)酵液中黃酮含量為響應(yīng)值,采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of the response surface experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵葛根酵素的單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對葛根酵素中黃酮含量的影響 發(fā)酵時(shí)間對酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素時(shí),發(fā)酵液中黃酮含量的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí),葛根酵素中的黃酮含量為60.13 μg/mL;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí),葛根酵素中的黃酮含量上升到68.52 μg/mL;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí),葛根酵素中的黃酮含量達(dá)到78.34 μg/mL;發(fā)酵時(shí)間>72 h后,葛根酵素中的黃酮含量有所下降。在發(fā)酵初期,菌種代謝促進(jìn)黃酮的釋放,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加釋放量越多,黃酮的含量增多,但隨著發(fā)酵時(shí)間延長,作用不明顯,發(fā)酵液中的部分黃酮因氧化等作用被消耗,因此含量呈現(xiàn)下降趨勢[34]。因此,酵母菌發(fā)酵葛根酵素的最佳時(shí)間為72 h。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對黃酮含量的影響Fig.2 Effects of fermentation time on flavonoid content

2.1.2 發(fā)酵溫度對葛根酵素中黃酮含量的影響 發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素時(shí),發(fā)酵液中黃酮含量的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知,當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí),葛根酵素中的黃酮含量為53.18 μg/mL;當(dāng)發(fā)酵溫度從25～29 ℃逐步上升,葛根酵素中的黃酮含量呈上升趨勢;但發(fā)酵溫度達(dá)到29 ℃時(shí),葛根酵素中黃酮含量達(dá)到最大,為77.31 μg/mL;當(dāng)發(fā)酵溫度>29 ℃后,葛根酵素中黃酮含量下降。在適宜的溫度范圍內(nèi)對酵母菌的代謝活動起到一定的促進(jìn)作用,酶促反應(yīng)較為活躍,有利于黃酮的釋放;而當(dāng)發(fā)酵溫度過低或者過高都不利于酵母菌的生理代謝活動,影響其酶促反應(yīng)的進(jìn)行[35]。因此,29 ℃為酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的最佳的發(fā)酵溫度。

圖3 發(fā)酵溫度對黃酮含量的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on flavonoid content

2.1.3 發(fā)酵液初始pH對葛根酵素中黃酮的含量的影響 由圖4可知,酵母菌發(fā)酵的初始pH為4.0時(shí),葛根酵素中黃酮含量為59.65 μg/mL;當(dāng)初始pH逐漸增大時(shí),葛根酵素中的黃酮含量逐漸升高;當(dāng)初始pH為4.5時(shí),葛根酵素的黃酮含量最大,為81.65 μg/mL;初始pH>4.5后,葛根酵素中的黃酮含量下降。可見酸性環(huán)境對酵母菌的生理代謝活動影響較大,在pH為4.5時(shí),黃酮含量達(dá)到最大,偏離此值時(shí),黃酮含量下降較為明顯。實(shí)驗(yàn)中調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至關(guān)重要,調(diào)節(jié)不當(dāng)則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的最適初始pH為4.5。

圖4 發(fā)酵液初始pH對黃酮含量的影響Fig.4 Effects of initial pH on flavonoid content

2.1.4 酵母菌接種量對葛根酵素中黃銅含量的影響 由圖5可以看出,當(dāng)酵母菌的接種量為1%時(shí),葛根酵素中的黃酮含量為60.13 μg/mL;酵母菌的接種量逐步上升時(shí),葛根酵素中黃酮的含量呈上升趨勢;當(dāng)酵母菌的接種量為3%時(shí),葛根酵素中黃酮含量達(dá)到79.54 μg/mL;當(dāng)酵母菌接種量繼續(xù)增加時(shí),葛根酵素的黃酮含量增加幅度不大。因此,選擇最佳酵母菌接種量為3%。

圖5 菌種的接種量對黃酮含量的影響Fig.5 Effects of inoculation quantity on flavonoid content

2.2 酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,以黃酮含量為響應(yīng)值,采取RSM法優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件,結(jié)果見表2。并利用Design-Expert對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

應(yīng)用Design Expert進(jìn)行分析,得到回歸方程為:

Y=80.40-1.87A-4.51B-3.37C-1.68D-1.93AB+0.85AC+1.50AD+3.85BC+2.80BD+0.30CD-12.02A2-8.59B2-9.13C2-2.85D2

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the regression equation

2.2.2 響應(yīng)面交互分析 根據(jù)表2設(shè)計(jì),四個(gè)變量中任意兩個(gè)變量取零水平時(shí),其余兩個(gè)變量對葛根酵素中黃酮含量影響的響應(yīng)面分析圖見圖6。圖形的坡度越陡,表明響應(yīng)因素對響應(yīng)指標(biāo)的影響越大[36]。圖6顯示,發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵時(shí)間、酵母接種量中任意兩個(gè)變量取水平時(shí),其余兩個(gè)變量對葛根酵素中黃酮含量的影響。由圖6可知,發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵液pH之間的交互作用對響應(yīng)值的影響明顯,其他因素兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響不明顯。

圖6A為發(fā)酵液初始pH為4.5、酵母接種量為3%時(shí),發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對酵素中黃酮含量的交互作用。可知,當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,黃酮含量先增大后趨于平緩。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí),隨著發(fā)酵溫度的升高,黃酮含量先增加后下降,而且響應(yīng)面顯示坡度較陡,表明發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間交互作用極顯著。

圖6B顯示,發(fā)酵溫度為29 ℃、酵母接種量為3%時(shí),發(fā)酵液初始pH和發(fā)酵時(shí)間對葛根黃酮含量的交互作用。當(dāng)發(fā)酵液初始pH一定時(shí),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,黃酮含量增加,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過一定值后,黃酮含量呈下降趨勢。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí),隨著發(fā)酵液初始pH的升高,黃酮含量呈下降趨勢,響應(yīng)面圖坡度較陡,表明發(fā)酵液初始pH與發(fā)酵時(shí)間交互作用極顯著。

圖6 各因素交互作用對黃酮含量影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of fermentation conditions on the flavonoid content

2.2.3 最佳條件預(yù)測及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-Expert分析,酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的最佳工藝為發(fā)酵時(shí)間72.16 h,發(fā)酵溫度27.90 ℃、發(fā)酵液初始pH4.38、接種量2.25%,此時(shí)葛根酵素中黃酮含量的理論最大值為81.909 μg/mL。結(jié)合實(shí)際情況,將條件調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間72 h,發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵液初始pH4.5、接種量2.5%,在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,黃酮含量的平均值為(81.667±0.21) μg/mL,與理論值的誤差值為0.295%,說明該模型有效。

3 結(jié)論

以葛根為原材料,以酵母菌為菌種發(fā)酵制備葛根酵素,通過響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝。實(shí)驗(yàn)得出最佳的發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間72 h,發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵液初始pH4.5、接種量2.5%。在此條件下實(shí)際測定的黃酮含量可達(dá)到81.667 μg/mL,與模型預(yù)測值81.909 μg/mL大致相符。

目前報(bào)道中,水果類酵素制備工藝較多。葛根中含有70多種功能性化合物,特別是黃酮類化合物,具有多種藥理作用。利用酵母菌發(fā)酵葛根,制備一種新型保健飲品-酵素,符合葛根資源綜合利用的趨勢。在制備葛根酵素的基礎(chǔ)上,還可以結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)理論和現(xiàn)代化的提取、分離、純化和制劑等工藝,使我國的葛根資源優(yōu)勢和中醫(yī)理論優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為技術(shù)經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢,為我國中醫(yī)現(xiàn)代化做出貢獻(xiàn)。