氣液微萃取和GCMS對臭豆腐中揮發性成分提取與分析

葉琳洋,康 琴,李 剛,牟 莉,*

(1.長春大學食品科學與工程學院,吉林長春 130022;2.吉林省食品檢驗所,吉林長春 130022)

臭豆腐是一種中國傳統風味美食,因地域不同,制作工藝也不盡相同。其中,北方以發酵作為主要的制作手段[1-4],而南方則是以油炸作為主要工藝手段[5]。但由于臭豆腐擁有異于其他食品的氣味,曾有報道[6]對其氣味產生的來源提出質疑,因此本文意在對臭豆腐中的揮發性成分進行研究分析,以探究其香氣的主要成分。

近年來,對于臭豆腐中揮發性香成分的提取方法主要包括固相微萃取法[1]、靜態頂空[7]、頂空固相微萃取法[8]等。本文采取了較為新穎的提取方法,即氣-液微萃取法(GLME)[9]。GLME的裝置的簡單示意圖如圖1所示,GLME是基于頂空液相微萃取技術的原理[10],在對樣品進行加熱同時通過N2將樣品中的目標化合物連續吹掃至萃取溶劑中,再利用“相似相溶”原理使目標化合物均勻地分散在萃取溶劑中,相對于固相微萃取(SPME)[1]等常規的前處理方法更容易操作,其不僅實現了待測樣品的提取、凈化和濃縮一系列前處理操作過程集中一體化,同時還可以在短時間內[11]完成一個樣本的提取,提高了分析檢測的工作效率。

圖1 GLME裝置示意圖Fig.1 GLME device schematic

本次研究采用GLME對臭豆腐進行前處理同時結合GC-MS,使得臭豆腐中的揮發性香成分在短時間內提取并富集于萃取溶劑中,從而實現了前處理一步操作后即可直接上樣進行分析,再通過已存在的相關研究結論做輔助性對比,進而對臭豆腐中的揮發性香成分進行初步探索性研究,以證明GLME可以用于提取臭豆腐中的風味成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臭豆腐 三個市售不同品牌;無水硫酸鈉(使用前在400 ℃條件下灼燒12 h,貯于干燥器中,冷卻后備用) 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;甲醇 色譜純,德國Meker公司;石英玻璃棉 奧瑞斯新材料科技有限公司。

氣相色譜-質譜聯用儀(GCMS-QP2010及GCMS Solution數據處理系統) 日本島津(SHIMADZU)公司;ME-101氣-液微萃取儀 延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室研制開發;FA25勻漿機 德國弗魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 將市售三個不同品牌的臭豆腐樣品編號為01、02、03,分別移取適量樣品進行攪拌制為勻漿,按照順序依次密封,在4 ℃下保存。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:J&W DB-5石英毛細柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:40 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至150 ℃,不保持,以15 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

1.2.3 質譜條件 載氣:氦氣(He),純度≥99.999%,流速1.78 mL/min。進樣量1.0 μL;進樣方式:不分流進樣,電離模式:電子轟擊(EI);轟擊能量:70 eV;GC-MS接口溫度:300 ℃;離子源溫度:230 ℃。全掃描模式,質量掃描范圍:m/z 29～500,溶劑延遲2.5 min。

1.2.4 GLME操作 稱取0.10 g臭豆腐樣品于填裝有石英玻璃棉以及適量無水硫酸鈉的樣品管中,接著將樣品管移至樣品池內,并用橡膠隔墊使樣品池密封;取50 μL醇萃取相添加至200 μL的內襯管中作為接受相置于冷凝槽內;設定GLME條件為萃取溫度:268 ℃、氣流流速:2.5 mL/min、冷凝溫度:-2 ℃、萃取時間:7 min;運行GLME程序至設定時間終止后,洗脫并定容接受相體積至100 μL,渦旋震蕩使樣液混勻,最后經氣相色譜-質譜分析研究。

1.2.5 SPME 操作 取攪勻的02號樣品20 g置于40 mL的固相萃取瓶中,在50 ℃的水浴中加熱20 min,待頂空平衡后,將萃取頭插入瓶中,在50 ℃頂空下吸附30 min,取出萃取頭,在GC-MS下解析。

1.3 數據處理

利用NIST 08譜庫對總離子流色譜圖進行檢索定性鑒定出各成分(相似度≥80%),對不同品牌臭豆腐之間的揮發性香成分進行對比分析。

2 結果與分析

2.1 三種臭豆腐揮發性香成分總離子流色譜圖

利用GLME-GC-MS得到的三種臭豆腐揮發性香成分總離子流色譜圖分別由圖2、圖3、圖4表示,具體的鑒定結果(相似度≥80%)在表1、表2和表3中進行相關解釋。

圖2 01號臭豆腐樣品中揮發性成分總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatilecomponents in No. 01 stinky tofu sample

圖3 02號臭豆腐樣品中揮發性成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatilecomponents in No. 02 stinky tofu sample

表1 01號臭豆腐樣品中揮發性香成分的GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis of volatile aroma components in No. 01 stinky tofu samples

圖4 03號臭豆腐樣品中揮發性成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatilecomponents in No. 03 stinky tofu sample

2.2 三種臭豆腐的揮發性香成分分析

根據NIST 08譜庫對圖2、圖3、圖4中對成分進行鑒定,其結果如表1、表2、表3所示。

表2 02號臭豆腐樣品中揮發性香成分的GC-MS分析結果Table 2 GC-MS analysis of volatile aroma components in No. 02 stinky tofu samples

表3 03號臭豆腐樣品中揮發性香成分的GC-MS分析結果Table 3 GC-MS analysis of volatile aroma components in No. 03 stinky tofu samples

在臭豆腐這類發酵型食品中,酸類物質既是發酵原料,又可提供特殊香氣。表1中酸類化合物峰面積占比最大這一結果也可以佐證;在01號樣品中,胺類物質占比相對較高,這類物質因N元素存在而具有特殊氣味,其可能是原料大豆在發酵過程中形成的;其次,醇類的存在令臭豆腐的風味更淳厚[1-2];酯類令其有果香或酒香[5];酮類物質通常賦予食品果香[2];苯酚在增香的同時還可以殺菌[1];雜環類物質中,吲哚的存在賦予臭豆腐特殊的臭味;烷烴類則對于臭豆腐風味的貢獻較小,由此可知,正是這種多樣的風味成分構成了臭豆腐的特殊風味。

由表2可知,酸類占比最大,酯類次之,而在02號樣品中,醇類并未被檢出,最大的可能是在臭豆腐的制作過程中,由于酸類成分較多,醇類在加工時參與了酯化反應,使得樣品更多地體現出酯類的酒香;與01號樣品相比,02號樣品的風味物質中有二甲基三硫參與,其賦予臭豆腐臭蘿卜的氣味[8],在吲哚存在的同時,這種混合揮發性成分的存在使得臭豆腐更具特異性風味。

根據表3可知,與01、02號樣品相似,03號樣品的酸類占比重最大,其次是胺類,同時有醇類、酯類和酮類化合物,這會使臭豆腐的特殊香氣更濃郁;在雜環類中均為含氮類化合物,其中,肟類物質是由含羰基化合物與羥胺作用而形成的,結合表3的分析結果推斷該化合物的出現可能是加工過程中的副產物,此外,吲哚的存在會令臭豆腐在嗅覺上產生令人不愉悅的臭味[5]。

3個樣品經GLME提取并通過GC-MS分析后,將各樣品的主要揮發性成分進行整理,結果如表1～表3所示。再通過圖5比較3個樣品之間貢獻香氣的化合物類別,發現本實驗所鑒定出的3種臭豆腐中揮發性香成分之間存在較大的差異。在01號樣品中,共檢出8類22種揮發性香成分,其中醇類3種、酸類3種、酯類4種、胺類6種、酮類2種、雜環類化合物2種、酚類1種、以及烷烴類1種;在02號樣品中,共檢出酸、酯、胺、酮、雜環化合物、腈、硫化物7類、29種化合物;在03號樣品中,共檢出酸、醇、酯、胺、酮、酚、雜環化合物、腈、烷烴以及氨10大類、43種化合物。整理后發現本次研究中所檢出的結果與已有文獻[1-2]中的結果有所差異,在相關文獻中所鑒定出的醇類物質較多,幾乎沒有鑒定出胺類物質,然而在本文中鑒定出較多的胺類物質,所鑒定出的醇類較少。其可能的原因一是與產品的產地和原材料之間存在差異有關,二是與不同的前處理方法相關。GLME是短時內的提取方法,化合物的損失可能會小于常規長時間提取方法;GLME是在較高溫度下進行提取過程,相對于較低的水浴溫度提取方法而言,也可能會存在不一樣的產物。

圖5 3種樣品揮發性成分類別統計圖Fig.5 Statistical chart of volatilecomponent categories of three samples

2.3 三種樣品中主要揮發性成分分類分析

2.3.1 酸類化合物 在發酵過程中,有原料大豆的脂類水解反應,其主要產物就是酸類物質,同時還會有使臭豆腐產生獨特氣味的酯化反應;另外在自然發酵過程中也會產生一部分的酸[12],這是臭豆腐中酸的最可能的來源。酸類化合物的存在會令臭豆腐的背景風味更獨特[13]。3個樣品中均檢出乙酸,乙酸在發酵型食品中既是調味劑,又是酯化反應中最常用的原料,因此在臭豆腐中乙酸的相對含量會較高。在01號樣品中酸類物質也有很高的香氣貢獻,在02、03號中酸都是貢獻最大的化合物。3個樣品中02號樣品酸的相對含量最大同時種類也最多,共包含了10種酸,其中檢出了另外2個樣品中未檢出的異戊酸,異戊酸具有腐爛水果的氣味[14],同時有研究證明[15]它還和酒精發酵相關。經比較發現不同品牌的臭豆腐成分之間存在一定的差異。

2.3.2 醇類化合物 在3個樣品中,檢出的醇類物質種類都很少,可能是因為在發酵過程中醇幾乎完全用于與酸發生酯化反應,而且本次研究中的提取溶劑是甲醇,可能對提取以及檢出過程存在一定影響。01號中檢出3種,02號未檢出,在03中檢出2種,3者之間檢出的醇類有很大差別。在01號中,醇類中相對含量最大的是糠醇,糠醇具有硫化物的酯香、霉香、甜香的發酵味道[16-17];而在03號中檢出了香葉基芳樟醇,這是一種具有木香氣味的化合物[18],其最可能的來源是樣品原料中添加的香辛料。在臭豆腐中,醇類物質雖然檢出種類少,但卻具有獨特的氣味可以起到助香作用。

2.3.3 酯類化合物 在傳統臭豆腐發酵過程中通常以酒曲作為原料,因此在制作過程中最為常見的就是醇酸酯化反應,酯類為臭豆腐提供了花香、果香或者酒香的香氣[2]。在01和02號中都存在丁位壬內酯,這是一種具有類似堅果、奶油的香氣[2]的化合物;03號中是2種氨基酸發生酯化反應的產物,其最可能的來源是原料大豆在水解過程中與醇類物質反應而得到的產物。

2.3.4 胺類化合物 胺類化合物也對臭豆腐提供了一定的香氣貢獻,并且大多數胺類化合物均有腐敗、腥臭味,這會對臭豆腐的特征性香氣更加透發。在其他相關文獻中胺類化合物幾乎沒有被提及[1-2],原因可能是胺類的含量微乎極微,在前處理過程中可能被剔除掉,而在GLME的處理下即使相對含量很低的胺類化合物被提取且檢查出來,證明GLME在揮發性物質的提取工作中具有一定的優勢;在01號中有6種,02號中存在7種,03號包含17種。在3個樣品中均含有丁二酰亞胺,但在相關文獻中并沒有介紹[5,8],如若將其判定為臭豆腐的一種特征性香氣物質還需更詳細的研究。

2.3.5 雜環類化合物 雜環類化合物種類較復雜,但在臭豆腐樣品中多數都是含有氮元素的雜環,并且大都具有特殊的香氣特征,這可能與臭豆腐的制作過程中的大豆發酵相關。其中在3種樣品中均含有吲哚,吲哚作為一種香料,在一定的濃度范圍內會呈現出特殊的臭味,這對臭豆腐具有特殊香氣提供了主要貢獻。由本實驗以及過往文獻[1-2]可以推斷吲哚是臭豆腐中的特征揮發性香氣之一。

2.3.6 酮類化合物 酮類化合物能夠令臭豆腐的香氣透發[1],在臭豆腐中,酮類物質最可能的來源是:多不飽和脂肪酸發生氧化或降解反應得到的產物以及發酵過程中微生物代謝的產物[19]。在3種樣品中檢出的酮類化合物種類都很少并且相對含量較低,因此在臭豆腐中更多的是起到香氣輔助的作用,比如3種樣品中均檢出的2-吡咯烷酮,根據文獻知,2-吡咯烷酮與烤制類食品的香氣有一定關聯[20]。但這一化合物的相對含量低,在相關臭豆腐的揮發性香成分的文獻中未有提及,這可能與提取方式相關,但仍需更多的實驗進行作證。

2.3.7 其他類化合物 在臭豆腐樣品中還檢出了酚、腈、烷烴、硫化物以及氨類化合物。對于酚類化合物,在01號中檢出苯酚,苯酚作為一種香料既為臭豆腐提供增香效果還擁有對食品殺菌、防腐的功效[1],這對于產品的貯存起到一定作用;在03號中檢出了2,6-二甲氧基苯酚也是具有木香氣味的化合物[21],通常會在熏制食品中檢出;烷烴類化合物的存在可能與傳統自然發酵過程相關,在大多的發酵型臭豆腐中都會添加如花椒等的香辛料[22],01號樣品中烷烴的相對含量較低,在對臭豆腐的揮發性香氣貢獻上并沒有很大的作用;腈類化合物,查閱文獻可知,苯代丙腈是腌漬雪菜中的一種特征香氣物質[23],因此在樣品中出現很可能是原料中包含類似雪菜的物質,而正十六腈被檢出很可能是樣品中的飽和烷烴與含氮化合物之間發生反應的產物;在02號中還檢出了一種含硫化合物——二甲基三硫,在已有相關研究中幾乎都會檢出該化合物[1-2],這種化合物具有臭蘿卜、洋蔥的氣味,添加二甲基三硫等硫化物會使得臭豆腐的特征氣味更加濃郁,讓人印象更深刻;同時還檢出了1個氨類化合物—二異戊基氨,同樣在相關研究中未被提及,可能是在提取過程中含氮化合物參與了某種反應得到或者是其提取含量較低而被其他物質掩蓋。

2.4 臭豆腐揮發性香氣物質主成分分析

由于揮發性成分類別較多,為了更直觀簡明地分析比較各數據,通過主成分分析法(PCA)比較各類揮發性成分對臭豆腐的貢獻,結果由表4、圖6表示。

表4 因子總方差分析結果Table 4 Results of factor total variance analysis

圖6 旋轉空間成分圖Fig.6 Composition diagram of therotating space

由表1～表3可知,臭豆腐的揮發性成分最多可以分為11類,但各實驗樣品間的結果也存在差異。為了找出代表性的揮發性香成分,因而對臭豆腐樣品的揮發性成分進行主成分分析。表4是對01～03號樣品中各官能團(即因子)之間的總方差分析結果。

由表4,第一主成分和第二主成分的特征值分別是7.984和3.052,累計貢獻率累計100%,第一主成分72.254%,第二主成分為27.746%。在一般情況下,當主成分累計貢獻率≥85%,即可利用主成分代表原始數據[24]。經分析臭豆腐的第一主成分分別是酮類、腈類、酸類、烷烴、硫化物、醇類、酚類以及酯類,第二主成分為雜環類化合物、氨類和胺類。圖6是臭豆腐樣品旋轉空間成分圖,即是通過在二維空間上將所分析的兩個主成分的特征值和特征向量通過一定的旋轉角度反映出來,經旋轉后可以將樣品中的致香官能團的數據濃縮在二維空間中,可以更明確直觀地表示第一主成分與第二主成分中揮發性香成分對臭豆腐所產生影響的異同。其中,第一主成分分為三簇,即酯類、硫化物、酸類和腈類為一簇,酚類、醇類以及烷烴為一簇,酮類單獨為一簇;第二主成分每一類別均單獨為一簇,同樣共計三簇。對所提取的兩個主成分的PCA分析結果如表5所示,表5是反映經SPSS處理后的第一、第二主成分的特征向量的系數,在第一主成分中呈正相關關系較高的官能團類別有酮類、腈類、酸類和酯類,烷烴則表現出較高的負相關;第二個主因子中雜環和醇類有較高的正相關關系,氨類表現出較高的負相關。再由表4中前兩個主因子的總方差貢獻率高于50%可以推斷,酮類、腈類、酸類、酯類、烷烴、雜環類、醇類以及氨類為臭豆腐揮發性香氣中的特征官能團類別。

表5 臭豆腐主成分矩陣得分系數Table 5 Matrix of scoring coefficients ofprincipal components of stinky tofu

2.5 前處理方法比較

GLME作為一種新穎的前處理方法,還并未有利用這種技術對臭豆腐中揮發性成分提取的相關研究。為了判斷GLME是否可以用于對臭豆腐中的揮發性成分進行提取,本文選取了SPME與GLME對同一樣品進行提取,經GC-MS分析鑒定提取成分,結果如表6所示。SPME對02號臭豆腐樣品處理并經GC-MS分析結果如圖7所示。

表6 SPME與GLME提取02號臭豆腐樣品揮發性成分的GC-MS分析結果Table 6 GC-MS analysis results of SPME and GLME extracting volatile components of No. 02 stinky tofu samples

續表

圖7 利用SPME提取02號臭豆腐樣品中揮發性成分總離子流色譜圖Fig.7 Total ion chromatogram of volatile componentsin No. 02 stinky tofu samples extracted by SPME

注:“-”在相對含量中表示未檢出。

對SPME與GLME方法提取同一樣品的分析結果之間的比較見表6,SPME共鑒定出23種成分,GLME鑒定出29種成分,其中二者均鑒定出的成分共5種,分別為乙酸、丙酸、丁酸、吲哚、二甲基三硫。對二者的檢出成分對比可知,GLME單獨檢出了胺類、腈類,而SPME檢出了醇類、酮類、醛類、酚類。這種檢出的差異性可能是由于提取溫度條件不同所致。GLME的提取溫度是由低溫不斷升溫至指定溫度,并在指定溫度下保留相應的時間對樣品進行萃取[10],例如像胺類等這類化學基團較復雜的化合物可以被提取出來,而SPME是在較低且恒定的提取溫度下對樣品進行提取[2],因此對于一些高氣化點的風味物質難以提取被鑒定出來。同時,分析共同鑒定出的5種成分的占比可知,GLME的結果要高于SPME。推測GLME相對于SPME而言,具有高效、節約成本、提取效果好的優勢,因此GLME可以用于提取臭豆腐中的揮發性成分。

3 結論

3個樣品經GLME-GC-MS分析,鑒定出酮類、腈類、酸類、烷烴、硫化物、醇類、酚類、酯類、雜環類化合物、氨類和胺類11大類物質。經PCA分析可得,臭豆腐揮發性香氣中主要致香的官能團為酮類、腈類、酸類、酯類、烷烴、雜環類、醇類以及氨類。根據3種樣品間的對比,對臭豆腐的揮發性成分貢獻較大的有吲哚、丙酸、丁酸,二甲基三硫等。

本次研究還可以證明GLME相比較常規的前處理方法,可以快速地提取被檢測成分,提高了檢測效率。因此,GLME作為一種新型的前處理方法,可以有效地提取樣品中較為復雜的成分,這將有利于食品的快速檢測,為樣品的前處理提供更加便捷、高效的手段。