五痹湯對大鼠佐劑性關節炎的療效及腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β水平的影響

徐子涵，商瑋，趙智明，沈俊逸，劉春麗，蔡輝

作者單位：東部戰區總醫院中西醫結合科，江蘇 南京210002

類風濕關節炎（類風關）是一種慢性炎癥性自身免疫疾病，以小關節滑膜異常增殖、血管翳形成與骨侵蝕為其主要病理特點［1］。類風關常見關節屈伸不利、紅腫焮熱，肌肉酸楚疼痛、麻木不仁，屬中醫“痹癥”范疇［2］。五痹湯是中醫治療痹癥的名方，出自于《太平惠民和劑局方》，書中記載：“五痹湯，治風寒濕邪，客留肌體，手足緩弱，麻痹不仁；或氣血失順，痹滯不仁，并皆治之?！保?］本方以筋骨酸痛，更以上肢肩臂為甚、舉動不便為辨證要點。佐劑性關節炎大鼠模型是研究類風關的主要動物模型之一［4］。本研究于2017年3—5月通過觀察五痹湯對佐劑性關節炎大鼠足爪腫脹度、關節炎癥、踝關節病理及關節滑液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）水平的影響，探討五痹湯對大鼠佐劑性關節炎的治療效果及潛在機制，在動物實驗層面為五痹湯治療類風關提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠40只，周齡范圍為8～10周，體質量范圍為160～180 g，由東部戰區總醫院實驗動物中心提供，醫學實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0003，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2藥品與試劑五痹湯濃縮液：由姜黃15 g、羌活15 g、白術15 g、防己15 g，炙甘草6 g組成，東部戰區總醫院制劑科配制成濃縮液，每克含生藥量1.32 g。甲氨蝶呤混懸液：甲氨蝶呤片（上海信誼藥廠有限公司，生產批號170113）研呈細末，與0.9%氯化鈉溶液配制成甲氨蝶呤混懸液，濃度為0.1 mg/mL。TNF-α試劑盒（武漢博士德生物技術公司，生產批號BA1205），IL-1β試劑盒（武漢博士德生物技術公司，生產批號BA1122），弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，生產批號160811）。

1.3佐劑性關節炎大鼠模型的制備將大鼠固定后剔除尾根部毛發，75%乙醇消毒，于尾根部皮下注射0.1 mL弗氏完全佐劑，建成佐劑性關節炎大鼠模型［5］。

1.4分組與干預按照隨機數字表法將大鼠分為四組（每組各10只）：健康組、模型組、五痹湯組和甲氨蝶呤組。健康組大鼠于尾根部皮下注射0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液，其余三組均制備佐劑性關節炎大鼠模型。造模9 d后，健康組和模型組以0.9%氯化鈉溶液2毫升/只灌胃。參照“人與動物體表面積計算法”制定給藥劑量，五痹湯組以五痹湯濃縮液6 g·kg-1·d-1灌胃，甲氨蝶呤組每周予以甲氨蝶呤混懸液1 mg/kg灌胃，未用藥的實驗日給予0.9%氯化鈉溶液2毫升/只灌胃，各組均連續灌胃14 d。

1.5測定足爪腫脹度致炎前用足容積測量儀測量每只大鼠右后足容積，從炎癥出現后，每隔3天（d9、d12、d15、d18、d21、d23）測量右后足容積，足爪腫脹度結果用△mL＝|注射后的足爪容積-注射前的足爪容積|［6］。

1.6關節炎癥程度的評估從炎癥出現后，分別于d9、d12、d15、d18、d21、d23進行關節炎指數（arthritis index，AI）評分，評定關節炎程度（0～4分）。0分：無關節炎；1分：關節有紅色斑點或輕度腫脹；2分：關節中度紅腫；3分：關節重度紅腫；4分：關節嚴重紅腫且不能負重［7］。

1.7病理學觀察于最后一次灌胃后1 h處死大鼠，切取右側踝關節，4%多聚甲醛固定后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，不同濃度梯度乙醇逐級脫水，浸蠟、包埋、切片，隨后進行蘇木精-伊紅（HE）染色。光學顯微鏡觀察組織病理變化，并進行病理評分（包括滑膜細胞增殖、細胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質侵蝕）［6］，病理評分越高表明關節組織結構的破壞越嚴重。

1.8血清和關節滑液TNF-α、IL-1β的測定縱行切開大鼠左側后肢膝關節皮膚，暴露膝關節，打開膝關節腔，用0.9%氯化鈉溶液1 mL沖洗關節腔，收集關節滑液［8］。大鼠血清和關節滑液TNF-α、IL-1β水平的測定采用酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）法。

1.9統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。觀測資料主要是計量資料，以x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1對足爪腫脹度的影響結果見表1。造模后d9，模型組、五痹湯組和甲氨蝶呤組雙側足爪出現明顯的腫脹，d18達到峰值，之后各組大鼠足爪腫脹度逐漸降低。建立模型后，甲氨蝶呤組大鼠的足腫脹與模型組相比在d18后有所減輕（P＜0.05）。與模型組相比，五痹湯組大鼠d21開始足腫脹緩解（P＜0.05），與甲氨蝶呤組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1佐劑性關節炎大鼠足爪腫脹度/（mL，±s）

表1佐劑性關節炎大鼠足爪腫脹度/（mL，±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別模型組五痹湯組甲氨蝶呤組F值P值d23 0.67±0.30 0.41±0.29a 0.36±0.17a 4.094 0.028鼠數10 10 10 d9 0.41±0.26 0.50±0.34 0.45±0.33 0.209 0.813 d12 0.56±0.33 0.58±0.47 0.53±0.29 0.046 0.956 d15 0.62±0.49 0.60±0.32 0.58±0.33 0.027 0.974 d18 0.89±0.38 0.64±0.12 0.50±0.45a 3.241 0.055 d21 0.75±0.20 0.54±0.11a 0.49±0.19a 6.474 0.005

2.2對AI評分的影響造模后d9模型組有不同程度的關節炎表現，隨著病程的延長，AI指數逐漸升高，d18達到峰值，隨后逐漸降低。與模型組相比，五痹湯組與甲氨蝶呤組大鼠AI評分明顯降低，從d18起差異有統計學意義（P＜0.05）。五痹湯組與甲氨蝶呤組比較差異無統計學意義（P＞0.05），但從均值分析來看，甲氨蝶呤組AI評分更低，表明五痹湯和甲氨蝶呤均有緩解關節炎癥的作用，而后期甲氨蝶呤的治療效果更佳（表2）。

2.3對踝關節病理評分的影響踝關節切片HE染色結果顯示，健康組大鼠關節結構完整，滑膜組織無充血與水腫，關節軟骨表面光滑。模型組大鼠可見滑膜組織水腫，并可見小血管形成，伴有大量炎癥細胞浸潤，滑膜細胞增生，血管翳形成，局部滑膜組織造成軟骨損傷和骨侵蝕。模型組大鼠踝關節切片病理評分明顯增高，與健康組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。五痹湯組與甲氨蝶呤組大鼠踝關節病理評分均低于模型組（P＜0.05）。見表3。

2.4對血清和關節滑液TNF-α、IL-1β水平的影響與健康組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β的水平均升高（P＜0.05）；給藥14 d后，五痹湯組和甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯降低，與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中，甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平下降更為明顯。

與健康組相比，模型組、五痹湯組大鼠關節滑液TNF-α、IL-1β的水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，五痹湯組和甲氨蝶呤組大鼠關節滑液TNF-α、IL-1β水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表2佐劑性關節炎大鼠關節炎指數（AI）評分/（分，±s）

表2佐劑性關節炎大鼠關節炎指數（AI）評分/（分，±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別模型組五痹湯組甲氨蝶呤組F值P值d23 8.87±4.02 5.05±2.09a 3.89±1.71a 8.685 0.001鼠數10 10 10 d9 2.70±1.31 2.50±0.99 3.55±1.67 1.700 0.202 d12 7.43±3.50 5.88±3.24 6.70±2.48 0.624 0.543 d15 9.25±2.78 7.80±1.01 7.72±3.07 1.224 0.310 d18 11.12±2.43 8.14±1.38a 6.21±2.90a 11.318 0.000 d21 10.44±3.01 6.56±3.12a 4.11±2.33a 12.617 0.000

表3各組大鼠踝關節病理評分比較/（分，±s）

表3各組大鼠踝關節病理評分比較/（分，±s）

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別健康組模型組五痹湯組甲氨蝶呤組F值P值骨質侵蝕0.40±0.52 1.60±0.97a 0.70±0.67b 0.50±0.71b 5.544 0.003鼠數10 10 10 10滑膜細胞增殖0.10±0.32 2.10±0.88a 1.20±0.92ab 0.50±0.71b 13.813 0.000細胞侵蝕0.20±0.42 1.40±0.84a 0.50±0.71b 0.50±0.71b 3.545 0.024血管翳形成0.40±0.52 2.10±0.74a 1.00±0.82b 0.70±0.82b 10.17 0.000炎癥0.70±0.67 2.10±0.74a 1.10±0.88b 1.00±0.82b 6.043 0.002

3 討論

類風關是一種不斷發展的與免疫失調相關的系統性疾病，在病人中不同程度影響關節，隨之而來的是許多并發癥。流行病學調查資料顯示，在中低收入國家男性類風關的患病率為0.16%（95%CI：0.11%～0.20%），女性達到 0.75%（95%CI：0.60%～0.90%）［9］。類風關發作之前的細胞因子存在明顯的波動，其中一些細胞因子已與關節炎形成過程中的自身抗體激活以及相關關節的疼痛和骨骼破壞有關，細胞因子可能觸發了從全身免疫到關節炎的轉變。細胞因子的暴露還可以進一步觸發滑膜基質細胞，以維持促炎環境。在某些情況下，細胞因子之間所產生的相互作用可促進浸潤的免疫細胞之間的串擾，甚至維持異位淋巴結構的發育，這些最終成為關節炎難以解決的源頭。目前，由于尚不清楚其確切的發病機理，在治療方法以消炎止痛及延緩進展的對癥治療為主，臨床上，類風關病情通常難以控制而時常復發［10］。中醫治療類風關源遠流長，近年來，一些報道顯示中西醫結合療法更能使病人受益，聯合西藥增效的同時亦可減低西藥治療所引起的毒副作用［11-12］。

表4 各組大鼠血清和關節滑液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）水平比較/（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠血清和關節滑液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）水平比較/（pg/mL，±s）

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別TNF-αIL-1β健康組模型組五痹湯組甲氨蝶呤組F值P值關節滑液25.12±3.57 43.90±3.21a 32.11±1.82ab 28.03±4.94b 53.680 0.000鼠數 1 0 10 10 10血清40.70±3.33 165.54±21.81a 105.62±7.01ab 78.20±5.67ab 194.679 0.000關節滑液19.63±4.28 38.33±8.67a 22.04±5.30b 17.13±3.43b 27.515 0.000血清9.88±0.62 33.67±4.51a 19.10±3.85ab 15.02±2.56ab 82.996 0.000

五痹湯主治風寒濕痹，經絡不利，肢節疼痛，麻痹不仁。方中以姜黃為君，姜黃散風寒，行氣血，通經止痛，入血分能活血行瘀，入氣分能行散滯氣，具有氣血兼理之功效［3］；羌活祛風除濕；防己祛風濕止痛；生姜辛散寒濕；白術健脾除濕，甘草調和諸藥。全方配伍，共達散風除濕，通絡止痛之效。臨證之時，如見腰骶痛，加桑寄生、杜仲；肩背痛，加防風、桑枝；腰腿痛，加續斷、牛膝、威靈仙等。

大鼠佐劑性關節炎模型是類風關動物模型的雛形，制備方法簡單易行，其病理學改變表現與人類類風關相似，因此被廣泛應用于研究類風關發病和尋找新的治療方法［13-14］。在本實驗中，造模后d9大鼠開始出現明顯的關節紅腫，以踝關節為重，并逐漸加重，可侵及足墊甚至全足，觀察至d18，AI評分達到最高。本實驗中所制備的佐劑性關節炎大鼠模型特征與李培培等［6］的研究中所描述的相符合，模型建立成功。

為進一步探討五痹湯對大鼠佐劑性關節炎的治療作用，于造模后出現炎癥反應后即給予藥物干預治療，甲氨蝶呤為陽性對照藥。甲氨蝶呤是治療類風關的主要藥物，但是，在腎功能不全或癡呆的情況下，甲氨蝶呤則無法使用，此時生物制劑單一療法可能是一種治療選擇，而糖皮質激素應盡可能減少，因為它是感染的危險因素之一。本研究發現，與模型組相比，在足爪腫脹度、炎癥程度及病理變化上五痹湯組和甲氨蝶呤組均有所改善，提示五痹湯和甲氨蝶呤對大鼠佐劑性關節炎起到一定的治療效果，并且五痹湯對大鼠佐劑性關節炎的療效與甲氨蝶呤相當。

類風關病人血清中TNF-α、IL-1β、白細胞介素6（IL-6）等細胞因子與其疾病活動度密切相關，這些細胞因子參與炎癥反應在類風關的病理過程中發揮重要作用［15］。這些炎癥細胞因子中TNF-α、IL-1β發揮的作用尤為重要［16］。TNF-α可誘導血管細胞黏附因子、血管內皮生長因子和組織因子等的表達，這些分子作用于血管內皮細胞，促進滑膜血管翳的生成。IL-1β與TNF-α兩者間還可發揮協同作用，同時刺激軟骨細胞以及成纖維樣滑膜細胞，產生炎性介質，促進軟骨基質降解和關節軟骨的破壞［17-18］。在過去的20年中，有效的生物制劑和小分子激酶抑制劑的開發大大提高了臨床療效?？筎NF藥物是首個用于治療類風關的分子靶向藥物。但是，抗TNF藥物的使用存在許多未解決的問題，包括感染的風險，原發性無反應者，繼發性療效下降和藥物經濟學問題。因此有必要尋找有效而又安全的新藥物［19］。本研究結果顯示五痹湯能有效降低佐劑性關節炎大鼠血清和關節滑液TNF-α、IL-1β水平，提示五痹湯具有緩解模型大鼠全身和關節局部炎癥細胞因子浸潤，從而起到改善關節炎癥的作用。

本研究顯示，五痹湯可減輕佐劑性關節炎大鼠足爪腫脹，緩解關節炎癥反應，改善踝關節病理評分，降低血清和關節滑液TNF-α、IL-1β水平，對大鼠佐劑性關節炎具有治療作用。