苯丁酸鈉對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

郭浩，周淑妮，冉瑞智

作者單位：恩施土家族苗族自治州中心醫院，

a腫瘤內科，

b中醫心血管內科，湖北 恩施445000

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國乳腺癌的年齡標準化發病率為30.69/10萬，位居女性惡性腫瘤的首位，居癌癥相關死因的第5位，我國乳腺癌病人發病年齡多在45～55歲，近些年乳腺癌發病也有明顯的年輕化趨勢，目前手術、化療、放療、內分泌及生物治療等為主的綜合治療是乳腺癌標準的治療方法，乳腺癌及其治療損傷給女性病人心理健康和生活質量帶來了嚴重的影響，乳腺癌的臨床治療療效仍有待進一步提高［1-2］。

苯丁酸鈉（Sodium phenylbutyrate，NaPB）屬于苯丁酸鹽及其衍生物的一種，NaPB可通過抑制DNA修復、誘導細胞凋亡和細胞周期停滯等機制抑制多

種腫瘤細胞的生長和增殖［3］，有研究提示苯丁酸鹽抗腫瘤作用可能與乳腺癌易感基因1（Breast cancer gene 1，BRCA1）有關［4］。BRCA1是一種抑癌基因，其編碼的BRCA1蛋白在乳腺癌的發病、預防、治療及預后中起到了重要作用［5］。NaPB對乳腺癌細胞生長增殖的影響及其作用機制尚無確切結論，本實驗于2018年10月至2019年1月以MDA-MB-231細胞為研究對象，探討NaPB對乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響，同時通過分析NaPB對BRCA1蛋白表達的影響初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞株購自中國醫學科學院上海生物研究所細胞資源中心。NaPB（上海金錦樂實業有限公司生產，批號20171105），溶解于雙蒸水中使用［6］。胎牛血清、DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶均購于美國Gibco Life Technologies公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）溶液（美國Sigma公司生產，型號規格：M2128-100MG，批號20180212）。膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染法細胞凋亡檢測試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司生產，批號20180503）。BRCA1抗體（型號ab213929）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體（型號ab32124）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）抗體（型號ab32503）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（型號ab8226）、過氧化物酶標記山羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗均購于艾博抗（上海）貿易有限公司。

1.2細胞培養技術將人乳腺癌細胞系MDA-MB-231接種于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養液中，培養基中加入100 U/mL青霉素和100 mg/L的鏈霉素，細胞維持培養于37℃、含有5%的二氧化碳、95%濕度的培養箱中，隔天換液，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代后，離心制成單細胞懸液以備NaPB處理、增殖能力檢測、蛋白質印跡法等后續實驗。

1.3四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞增殖活力取處于對數生長期的MDAMB-231細胞接種于96孔板中（細胞濃度5.0×104/mL），過夜培養后加入不同劑量的NaPB（0 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L）處理24 h、48 h和72 h后進行實驗。每組設置5個復孔，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃孵育4 h后終止培養。棄上清后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解MTT結晶，搖床震蕩混勻10 min，然后在酶標儀上選擇490 nm波長，最后測定各孔的光密度（OD）值。MTT法得到各組細胞培養孔中OD值的復孔平均值。細胞增殖存活率＝（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%，實驗檢測重復3次。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡將處于對數生長期的MDA-MB-231細胞以1.0×105密度接種于6孔板上，于培養體系中與藥物共同孵育48 h后，1 500 r/min離心5 min，收集細胞，加入孵育緩沖液洗滌，離心，去上清液，使用500 μL上樣緩沖液（Binding buffer）懸浮細胞，然后再進行熒光標記，先加入5 μL Annexin V-FITC，后加入5 μL PI熒光標記溶液，輕輕混勻，室溫下避光孵育20 min，于1 h內使用流式細胞儀進行檢測。

1.5蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和BRCA1蛋白的表達收集實驗各組細胞，根據蛋白提取試劑盒操作說明于冰上裂解提取各組細胞的目標總蛋白，按照BCA蛋白質定量試劑盒操作說明進行實驗，測定各組細胞的目標蛋白質的濃度，然后經灌膠、上樣處理后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離各組蛋白質，應用濕轉法將分離的蛋白條帶轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），封閉后并分別與抗人Bcl-2、Bax、BRCA1和β-actin一抗置4℃水平搖動過夜，再加入與辣根過氧化物酶標記的二抗反應，洗膜、風干后使用辣根過氧化物酶（HRP）-增強化學發光法（ECL）進行顯影，使用β-actin作為內參進行相對含量的計算和分析。

1.6統計學方法應用SPSS 20.0軟件包進行統計學數據的整理和分析。實驗中計量數據均以±s表示，多組樣本均數的比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用Bonferroni校正法，P＜0.05（兩兩比較時P＜0.016 7）表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1NaPB對MDA-MB-231細胞增殖活力的影響實驗根據NaPB的劑量（0 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L）不同將乳腺癌MDA-MB-231細胞分為對照組（0 mmol/L NaPB組），2 mmol/L NaPB組4 mmol/L NaPB組。MTT實驗結果表明NaPB作用于MDAMB-231細胞24 h后，對照組、2 mmol/L NaPB組4 mmol/L NaPB組細胞生存率分別為（100.00±0.00）%、（82.05±7.11）%和（67.46±4.77）%，三組間比較差異有統計學意義（F＝32.174，P＜0.001）；48 h后，對照組、2 mmol/L NaPB組4 mmol/L NaPB組細胞生存率分別為（100.00±0.00）%、（74.33±4.46）%和（58.75±5.12）%，三組間比較差異有統計學意義（F＝82.864，P＜0.001）；72 h后，對照組、2 mmol/L NaPB組4 mmol/L NaPB組細胞生存率分別為（100.00±0.00）%、（70.63±4.26）%和（48.98±3.59）%，三組間比較差異有統計學意義（F＝184.127，P＜0.001）。該結果提示NaPB可顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖活力，且隨著劑量的增加其抑制作用有增加的趨勢。

2.2NaPB對MDA-MB-231細胞凋亡的影響流式細胞學檢測MDA-MB-231細胞凋亡結果（圖1A）表明，對照組、2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組細胞的凋亡率分別為（4.25±0.89）%、（14.11±2.98）%和（32.73±1.89）%，三組比較差異有統計學意義（F＝166.668，P＜0.001）；兩兩比較采用Bonferroni校正法，2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組細胞凋亡率均明顯低于對照組（P＝0.002；P＜0.001）；2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。

應用蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2的表達水平結果表明，對照組、2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組Bcl-2蛋白相對灰度值分別為（0.78±0.02）、（0.58±0.04）和（0.39±0.02），三組比較差異有統計學意義（F＝162.437，P＜0.001）；與對照組相比，2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組Bcl-2的表達均有明顯降低（P＜0.001；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB組Bcl-2的表達低于2 mmol/L NaPB組（P＜0.001）。凋亡相關蛋白Bax的相對灰度值對照組、2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組分別為（0.26±0.02）、（0.41±0.02）和（0.69±0.04），三組比較差異有統計學意義（F＝210.437，P＜0.001）；與對照組相比，2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組Bax的表達均有明顯增加（P＝0.001；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB組Bax的表達高于2 mmol/L NaPB組（P＜0.001）。各組Bcl-2和Bax蛋白質印跡法結果見圖1B。以上數據提示NaPB可誘導乳腺癌細胞凋亡，且劑量越高誘導作用越明顯。

2.3NaPB對MDA-MB-231細胞BRCA1蛋白表達的影響蛋白質印跡法檢測結果表明，應用NaPB后MDA-MB-231細胞BRCA1的表達量顯著降低（圖2），對照組、2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組Bcl-2蛋白相對灰度值分別為（0.83±0.03）、（0.61±0.05）和（0.30±0.04），三組比較差異有統計學意義（F＝117.348，P＜0.001）；2 mmol/L NaPB 組和4 mmol/L NaPB組BRCA1的表達均明顯高于對照組（P＝0.002；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB組BRCA1表達高于2 mmol/L NaPB組（P＜0.001）。以上數據表明NaPB可抑制乳腺癌細胞中BRCA1的表達，且高劑量抑制作用更明顯。

3 討論

化療與手術、放療并稱為惡性腫瘤的三大治療方法，乳腺癌通過化療可以達到臨床治愈或者長期生存的效果，探索新的有效的治療乳腺癌的藥物具有重要臨床意義［7］。

作為一種氨清除劑，在人體內，苯丁酸鹽被氧化成苯乙酸鹽，再與谷氨酰胺結合以苯乙酰谷氨酰胺的形式從尿中排出，從而介導廢物氮的清除，目前是治療尿素循環障礙和高氨血癥的常用藥物。然而，體外和體內研究均證明苯丁酸鹽及其衍生物具有明顯的抗腫瘤作用，其作用包括抑制腫瘤生長、侵襲和遷移，并在不同類型的實體瘤（如舌癌、惡性膠質瘤、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等）以及血液腫瘤（如急性髓性白血病）中誘導細胞分化和凋亡［6，8-10］。苯丁酸鹽及其衍生物抗腫瘤作用的可能機制總結如下：抑制組蛋白去乙酰化酶（HDAC），抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡，誘導分化，抑制血管生成，抑制DNA修復，抑制腫瘤細胞轉移以及免疫調節作用。此外，苯丁酸鹽及其衍生物的抗腫瘤作用還具有劑量依賴性和細胞類型選擇性，因此需要進行針對不用類型的腫瘤進行實驗研究以驗證其作用［3］。

目前尚不完全清楚NaPB在乳腺癌中的抗瘤作用，本研究通過細胞實驗初步探究了NaPB在乳腺癌藥物治療上的潛在應用價值。結果表明NaPB能顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖活力，并可誘導其凋亡，NaPB可誘導凋亡相關蛋白Bcl-2表達水平下降和Bax表達水平升高，NaPB的抗腫瘤作用在高劑量組中表現得更明顯。與本實驗的研究結果相似，孫象軍等［11-12］的研究表明NaPB可有效地抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖活力，且該作用具有劑量-時間依賴性，其作用機制可能與NaPB上調HOXA5基因mRNA表達水平影響乳腺癌細胞的轉錄過程有關。研究人員還就NaPB對乳腺癌細胞超微結構的影響進行了深入的研究，結果發現應用NaPB后可引起乳腺癌細胞形態發生顯著改變，主要表現在誘導MCF-7細胞向成熟表型方向分化，降低其惡性程度，同時，NaPB可導致乳腺癌細胞周期發生G0/G1期阻滯，影響乳腺癌細胞DNA的合成。另外，還有研究發現NaPB可以顯著抑制HER2陽性的乳腺癌SKBR3細胞的增殖并誘導SKBR3細胞凋亡，同時，NaPB可增加抗HER2受體的單克隆抗體曲妥珠單抗治療的敏感性，NaPB的這種作用與p27Kip1蛋白的表達增加有關［13］，但是上述NaPB的作用在HER2陰性的乳腺癌HCC1937細胞中不存在，其原因可能與苯丁酸鹽抗的癌作用具有細胞類型選擇性有關。

BRCA1基因編碼的蛋白可作用于DNA損傷修復、細胞增殖與凋亡、基因轉錄調控和細胞周期調節等多種細胞生命活動過程。BRCA1蛋白的表達水平與乳腺癌的預后及對化療藥物敏感性的影響尚未明確，現有的研究結果也不一致［5，14-16］。本實驗發現NaPB可明顯降低乳腺癌細胞BRCA1蛋白的表達水平，該結果提示NaPB可能通過調節BRCA蛋白水平發揮抗癌作用。類似的，有研究發現在頭頸部惡性腫瘤細胞中，苯丁酸鹽可通過降低BRCA1蛋白表達抑制腫瘤細胞的DNA損傷性修復，從而增強了細胞對順鉑的敏感性［4］。但是，有研究表明miR-185可以通過上調BRCA1的表達抑制三陰乳腺癌細胞的增殖與侵襲［17］，分析其原因可能是BRCA1蛋白在不同藥物中的作用機制不同造成的。BRCA1蛋白可通過同源重組參與DNA雙鏈的損傷性修復，研究表明BRCA1基因突變的乳腺癌病人由于BRCA1蛋白表達量降低，造成了同源重組修復功能缺陷，可能對順鉑、卡鉑和多聚聚合酶（PARP）抑制劑等DNA損傷藥物更為敏感［18-19］，而紫杉醇誘導的乳腺癌細胞的凋亡需要BRCA1蛋白參與，故BRCA1基因突變可誘導腫瘤細胞對紫杉醇耐藥，此外，BRCAl對腫瘤細胞的凋亡也具有不同調節功能［20］。

綜上所述，NaPB可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞生長增殖和誘導細胞凋亡，NaPB可顯著降低乳腺癌細胞BRCA1蛋白表達水平，該結果提示NaPB可能通過調節BRCA1蛋白水平影響DNA損傷修復，從而發揮抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的作用，這也是NaPB抗腫瘤的機制之一，NaPB介導的BRCA1途徑有望成為乳腺癌治療的作用靶點，該結論有待進一步的研究以明確。

（本文圖1，2見插圖6-3）

圖1 苯丁酸鈉（NaPB）對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響：A為流式細胞儀檢查MDA-MB-231細胞各組凋亡情況；B為蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）的表達水平

圖2 苯丁酸鈉（NaPB）對乳腺癌MDA-MB-231細胞BRCA1（乳腺癌易感基因1）蛋白表達的影響