脂質(zhì)代謝相關(guān)通路蛋白基因多態(tài)性的分布特征及與aMCI關(guān)系研究

王金俠 陳民

遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙（amnestic mild cognitive impairment，aMCI）是介于正常老化與輕度癡呆之間的一種中間過渡狀態(tài)，是AD 的早期階段，其患病率因診斷標(biāo)準(zhǔn)不同而差異性較大，約為5%～20%。每年約有15%的aMCI 人群會(huì)轉(zhuǎn)化成癡呆，被認(rèn)為是癡呆的“預(yù)警信號(hào)”，他為癡呆的防治提供了一個(gè)“機(jī)會(huì)之窗”［1-2］。目前全基因組關(guān)聯(lián)研究已發(fā)現(xiàn)多個(gè)染色體區(qū)域很可能存在與AD 有關(guān)的基因突變，但只有載脂蛋白E（ApoE）等位基因在世界范圍內(nèi)得到了公認(rèn)。由于ApoE 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的載脂蛋白，在膽固醇動(dòng)員、重新分布及排泄等代謝過程中均具有重要作用，因此人們推測(cè)血脂代謝紊亂可能參與AD 發(fā)病過程。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可以加劇巴馬小型豬海馬、大腦皮層中的β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積及增加血清中Aβ 的含量［3-6］。因此，尋找更多的脂代謝相關(guān)候選基因，對(duì)將來AD 的基因診斷和靶點(diǎn)治療至關(guān)重要。相關(guān)研究顯示，ApoE、低密度脂蛋白受體（LDLR）、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A7（ABCA7）基因多態(tài)性與aMCI 可能存在相關(guān)性，但關(guān)聯(lián)研究尚處于不確定階段。本研究以aMCI 為研究對(duì)象，探討aMCI 脂質(zhì)代謝相關(guān)通路蛋白基因多態(tài)性的分布特征及與aMCI 的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 遵循病例對(duì)照試驗(yàn)原則，本研究在2016 年12 月至2018 年3 月間分別從沈陽市2 個(gè)三級(jí)甲等綜合性醫(yī)院（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、沈陽軍區(qū)總醫(yī)院）及6個(gè)沈陽市養(yǎng)老中心（沈陽市皇姑區(qū)塔灣新家園敬老院、沈陽市養(yǎng)老院、沈陽市于洪區(qū)中心敬老院、沈陽市蘇家屯區(qū)社會(huì)福利院、沈陽市合眾優(yōu)年養(yǎng)老社區(qū)、沈陽市大東區(qū)愛達(dá)養(yǎng)老公寓）選取600例有效樣本。其中aMCI病人300例，年齡60～101歲，平均（75.90±11.21）歲，男192 例，女108 例；與之年齡、性別、疾病史相匹配的認(rèn)知功能正常的老年樣本300例，年齡62～100 歲，平均（73.71±11.87）歲，男189 例，女111 例。所有入選對(duì)象均為沈陽地區(qū)常住人口，且均為漢族。本研究由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 aMCI組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）參照美國(guó)精神病學(xué)會(huì)的精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4修訂版（DSM-Ⅳ）的MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，符合aMCI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡≥60 歲；（3）MMSE 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：文盲16～18 分，小學(xué)19～21分，初中22～24分，高中及以上25～27分；HIS 缺血指數(shù)量表（Hachinski，HIS）≤4 分；漢密爾頓抑郁量表（Hamilton Depression Scale，HAMD）≤12 分（17 項(xiàng)量表）；臨床癡呆評(píng)估（CDR）0或0.5分；Barthel生活活動(dòng)量表（ADL）≥80 分；（4）無嚴(yán)重的心、肺、肝、腎功能障礙；（5）無慢性病急性加重或發(fā)作狀態(tài)；（6）無急性感染性疾??；（7）視力及聽力無明顯障礙，能夠順利完成問卷。

1.2.2 認(rèn)知正常組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）MMSE 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：文盲＞18 分，小學(xué)＞21 分，初中＞24 分，高中及以上＞27 分；HIS 評(píng)分≤4 分；HAMD 評(píng)分（17 項(xiàng)量表）≤12分；CDR 為0 分；ADL 評(píng)分≥80 分。（2）日常生活功能良好。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有卒中史；（2）血管性癡呆或其他原因?qū)е碌陌V呆；（3）引起腦功能障礙的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ鏟D、正常腦壓腦積水或腦炎等）；（4）認(rèn)知損害由顱外傷所致；（5）其他可引起認(rèn)知功能損害的疾病，如嚴(yán)重貧血、梅毒、甲狀腺功能異常、艾滋病等；（6）心、肺、肝、腎等功能衰竭，急性感染或重度感染性疾病；（7）中毒性腦病病人。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料采集：收集年齡、性別、受教育程度、疾病史、飲酒史、吸煙史、體育鍛煉、生活方式等資料。

1.3.2 基因分型方法：本項(xiàng)目委托上海天昊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，采用iMLDRTM多重單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型試劑盒對(duì)600 個(gè)樣本進(jìn)行5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用t 檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用Maim-Whitney U 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用頻次表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。探討因變量與多個(gè)自變量的關(guān)系采用多元回歸分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組的基本資料比較 aMCI 組的受教育程度、MMSE 評(píng)分、ADL 評(píng)分皆低于認(rèn)知正常組，HAMD 評(píng)分高于認(rèn)知正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。aMCI組的吸煙史、飲酒史病人比例較認(rèn)知正常組高（P ＜0.05）。見表1。

表1 2組的一般資料比較（n，n=300）

續(xù)表1

2.2 標(biāo)簽基因多態(tài)性哈溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡分析 研究中4 個(gè)基因共5 個(gè)標(biāo)簽SNPs，通過Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有SNPs 均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P ＞0.05）。

2.3 2 組ApoE ε2、ε3、ε4 基因多態(tài)性分布 2 組間ApoE ε2/2、ε4/4 基因型和ε2、ε4 等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 2組ApoE ε2、ε3、ε4的基因型和等位基因型頻率分布（n，%，n=300）

2.4 2 組LDLR 基因rs688 和rs5925 多態(tài)性分布 2組rs688 基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；aMCI 組C 等位基因頻率高于認(rèn)知正常組（88.50%比84.00%，P ＜0.05）。而2 組LDLR rs5925 基因多態(tài)性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3。

2.5 2 組ABCA7 基因rs3752246 多態(tài)性分布 2 組間ABCA7 rs3752246 基因多態(tài)性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表4。

表3 2組LDLR基因rs688和rs5925多態(tài)性分布（n，%，n=300）

表4 2組ABCA7 rs3752246基因多態(tài)性分布（n，%，n=300）

2.6 各基因多態(tài)性與aMCI 相關(guān)性的多因素Logistic回歸分析 經(jīng)校正性別、受教育程度、吸煙史、飲酒史、生活方式、體育鍛煉、疾病史等因素后，結(jié)果顯示，ApoE ε4等位基因是aMCI的易感等位基因，aMCI發(fā)病率是非ε4 攜帶者的1.453 倍；ε2 等位基因是aMCI 的保護(hù)等位基因，aMCI 發(fā)病率是非ε2 攜帶者的0.498倍。ABCA7 的rs3752246 基因多態(tài)性與aMCI 發(fā)病存在明顯相關(guān)性，C 等位基因攜帶者是非攜帶者發(fā)病率的2.092 倍。LDLR 的rs688 基因多態(tài)性與aMCI 發(fā)病存在明顯相關(guān)性，T 等位基因攜帶者是非攜帶者發(fā)病率的1.356倍。見表5。

3 討論

ApoE 是一種載脂蛋白，其基因位于19 號(hào)染色體上，在人群中呈多態(tài)性。其遺傳多態(tài)性主要受控于兩個(gè)SNP 位點(diǎn)rs429358 和rs7412，并通過不同的核酸組合決定了ApoE 的3 種等位基因型：ε2、ε3、ε4［8］。ApoE ε4 等位基因是遲發(fā)型AD 的主要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，攜帶ε4 等位基因者發(fā)展為AD 的風(fēng)險(xiǎn)增加2～3 倍［9］。與非ε4 個(gè)體相比，ε4 攜帶者早在40 歲時(shí)即表現(xiàn)出腦淀粉樣蛋白病理改變并且經(jīng)歷更快的認(rèn)知下降［10］。另外，ApoE ε4 還可促使腦內(nèi)tau 蛋白發(fā)生異常磷酸化，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFT）。有研究將鼠ApoE 基因敲除后，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元突觸完整性和可塑性受到影響；將老齡鼠ApoE 基因敲除后，其表現(xiàn)出類似AD 的一些特征：膽堿能神經(jīng)元丟失、過多脂質(zhì)氧化、認(rèn)知紊亂、突觸丟失、異常tau 蛋白磷酸化等。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，ApoE 基因多態(tài)性確實(shí)與aMCI 發(fā)病相關(guān)，ApoE ε4是aMCI 發(fā)病的危險(xiǎn)因素，而ApoE ε2 則是保護(hù)性因素。

表5 各基因多態(tài)性與aMCI相關(guān)性的多因素Logistic回歸分析

LDLR 基因位于人類第19 號(hào)染色體短臂末端（p13.1-p13.3），全長(zhǎng)45 kb，由18 個(gè)外顯子和17 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。rs5925位點(diǎn)位于LDLR 第18個(gè)外顯子NocI限制性酶切多態(tài)位點(diǎn)，rs5925位點(diǎn)基因多態(tài)性與TC 和LDL 水平間有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，LDLR 基因rs688位點(diǎn)位于LDLR 基因的第12 個(gè)外顯子中［11］。LDLR 在AD 發(fā)病機(jī)制中的作用，特別是在晚發(fā)性AD 中，在過去25 年里被遺傳、神經(jīng)病理學(xué)和生物標(biāo)志物分析（臨床研究）或細(xì)胞和動(dòng)物模型系統(tǒng)（臨床前研究）研究最多。雖然有一些矛盾的報(bào)道，但越來越多的證據(jù)表明，LDLR不僅能調(diào)節(jié)大腦和外周的Aβ，還能維護(hù)大腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)，延緩AD 的發(fā)病。雖然LDLR rs688 基因多態(tài)性對(duì)認(rèn)知障礙的機(jī)制并不是很明確，但是有幾條證據(jù)表明LDLR 基因多態(tài)性是與AD 有關(guān)的優(yōu)良候選基因。首先，LDLR 是ApoE 的主要腦受體，其等位基因已被廣泛接受用于調(diào)節(jié)AD 風(fēng)險(xiǎn)［12-13］。其次，LDLR 缺乏與Tg2576 APP 轉(zhuǎn)基因小鼠中Aβ 沉積增加有關(guān)，盡管不是PD APP 轉(zhuǎn)基因小鼠，但暗示LDLR 和AD 標(biāo)記之間可能存在聯(lián)系。第三，小鼠LDLR 缺乏與學(xué)習(xí)能力不足有關(guān)。最后，rs688 基因多態(tài)性都與膽固醇穩(wěn)態(tài)有關(guān)，膽固醇穩(wěn)態(tài)本身與Aβ 的產(chǎn)生和AD 風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)［14］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，rs688 確實(shí)與aMCI 發(fā)病相關(guān)，rs688 T等位基因是aMCI發(fā)病的易感等位基因。

ABCA7 基因位于染色體19p13.3。ABCA7 可促進(jìn)膽固醇外流和抑制Aβ分泌，并能通過C1q補(bǔ)體途徑增強(qiáng)巨噬凋亡細(xì)胞的功能。ABCA7 是大腦小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大家族的一部分。研究結(jié)果證明，ABCA7 通過增強(qiáng)吞噬Aβ、凋亡細(xì)胞和合成底物的作用來降低AD 的危險(xiǎn)性［15］；也有研究顯示，ABCA7通過清除Aβ沉積來降低AD的危險(xiǎn)性［16-18］。本研究結(jié)果表明，ABCA7 rs3752246 C 等位基因是aMCI發(fā)病的易感等位基因。

ApoE、LDLR、ABCA7 基因多態(tài)性與aMCI 的發(fā)病確實(shí)存在相關(guān)性，但其在認(rèn)知障礙發(fā)病機(jī)制中的作用還有待進(jìn)一步闡明。