人參皂苷Rg₁對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的預防作用及機制研究

武文文　吳詩卉　劉春紅　包翠芬　閔連秋

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）11-1287-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.02

摘 要 目的：研究人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血再灌注損傷（CIRI）模型大鼠的預防作用及機制。方法：將78只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、丁苯酞對照組（陽性對照，10 mL/kg）和人參皂苷Rg1低、中、高劑量組（10、20、40 mg/kg），每組13只。各給藥組大鼠腹腔注射相應藥物，假手術組和模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續7 d。給藥結束后，除假手術組外，其余各組大鼠均采用右側大腦中動脈栓塞法復制局灶性CIRI模型。造模完成后，參照改良神經功能缺損評分標準對大鼠進行神經功能缺損評分，采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法測定大鼠腦梗死體積百分比，采用干濕重法測定大鼠腦含水量，采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清中白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6含量，分別采用免疫組織化學法和Western blotting法測定大鼠腦組織中磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、磷酸化核因子-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白表達情況。結果：與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺失評分、腦梗死體積百分比、腦含水量和血清中IL-1β、IL-6含量以及腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65陽性蛋白表達細胞數和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且人參皂苷Rg1的作用具有一定的劑量依賴性趨勢;人參皂苷Rg1中、高劑量組與丁苯酞對照組比較，上述指標差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：人參皂苷Rg1對局灶性CIRI模型大鼠具有一定的預防作用。其機制可能與下調p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達，抑制炎癥因子IL-1β、IL-6的釋放有關。

關鍵詞 人參皂苷Rg1;磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶;磷酸化核因子-κB p65;腦缺血再灌注損傷;炎癥;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To study preventive effect and mechanism of ginsenoside Rg1 on focal cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI） model rats. METHODS：Totally 78 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， butylphthalide control group （positive control， 10 mL/kg）， ginsenoside Rg1 low-dose， medium-dose and high-dose groups （10， 20， 40 mg/kg）， with 13 rats in each group. Administration groups were give relevant medicine intraperitoneally， sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intraperitoneally， once a day， for consecutive 7 d. After medication， except for the sham operation group， focal CIRI model was induced by middle cerebral artery occlusion （MCAO） method in other groups. After modeling， neurological deficit scoring was performed according to the modified neurological difict scoring standard;? TTC staining was used to detected the percentage of cerebral infarction of rats; the cerebral water content was measured by dry/wet weight method; serum contents of IL-1β and IL-6 were detected by ELISA; the protein expressions of p-p38 MAPK and p-NF-κB p65 in cerebral tissue were determined by immunohistochemistry and Western blotting assay. RESULTS： Compared with sham operation， neurological deficits score， percentage of cerebral infarction and cerebral water content， serum contents of IL-1β and IL-6， positive expression numbers of cells and protein expressions of p-p38 MAPK and p-NF-κB p65 in cerebral tissue were increased significantly in model group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above index levels of administration groups were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and the effect of ginsenoside Rg1 had a dose-dependent trend; there was no significant difference of all above indexes between ginsenoside Rg1 middle-dose，high-dose groups and butylphthalide control group （P>0.05）. CONCLUSIONS： Ginsenoside Rg1 has a certain preventive effect on focal CIRI model rats， the mechanism of which may be associated with down-regulating the protein expression of p-p38 MAPK and p-NF-κB p65， inhibiting the release of inflammatory factors such as IL-1β and IL-6.

KEYWORDS? ?Ginsenoside Rg1; p-p38 MAPK; p-NF-κB p65; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Inflammation; Rats

缺血性腦卒中具有高復發率、高致殘率和高致死率的特點，嚴重危害人類健康。目前，對于該病的治療原則主要為溶解血栓、恢復血液供應，但血液再通時經常會導致腦缺血再灌注損傷（Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[1]。減輕再灌注損傷已成為缺血性腦血管疾病治療的重要環節。研究顯示，炎癥是CIRI的主要原因之一[2-3]。從抑制炎癥反應方面探討藥物是否對CIRI有防治作用已成為目前研究的熱點。人參皂苷Rg1為傳統中藥人參的主要活性成分之一，以往研究證實，人參皂苷Rg1能夠改善缺血再灌注損傷癥狀，發揮神經保護作用，其作用機制可能與抗細胞凋亡、抗氧化作用有關[4-5]。目前，也有文獻證實，人參皂苷Rg1可通過抑制炎癥反應發揮對中腦黑質多馬胺能神經元的保護作用[6-7]。但是關于人參皂苷Rg1對CIRI中的炎癥反應是否有抑制作用，目前還不甚清楚。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）/核因子-κB（NF-κB）是目前較為經典的炎癥通路，可以調控多種炎癥因子的表達，從而調節炎癥反應[8]。鑒于此，本研究擬通過研究人參皂苷Rg1對局灶性CIRI模型大鼠炎癥反應的影響，并通過p38 MAPK/NF-κB通路探索其作用機制，為治療缺血性腦卒中疾病的新藥開發提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

DNM-9602G型酶標分析儀（廣州滬瑞明儀器公司）;PowerPac 3000型電泳儀、Trans-BlotSDcell型半干轉印儀（美國Bio-Rad公司）;Vibra Cell Vcx105型超聲波細胞粉碎機（美國Sonics公司）;CM1900型冰凍切片機（德國Leica公司）;YZ20P6型手術顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司）;Primo Start型熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）;Matrx VIP 3000型動物麻醉機（美國Midmark公司）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rg1對照品（吉林大學有機化學教研室，批號：201810，純度：>95%）;丁苯酞注射液（石藥集團恩必普制藥有限公司，批號：618180813，規格：每100 mL中含丁苯酞25 mg、氯化鈉0.9 g）;兔抗磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）多克隆抗體、兔抗磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（英國Abcam公司）;異硫氰酸熒光素（FITC）標記的免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）;白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（美國R&D公司，批號：均為201901）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：93H001100）;增強化學發光顯影劑（ECL，上海碧云天生物技術有限公司）;2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色劑（美國Sigma公司）;4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色劑（美國Genview公司）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

健康清潔級SD大鼠78只，雄性，體質量（280±50） g，由錦州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（遼）2017-0003。飼養環境溫度為20～25 ℃、相對濕度為50%～60%，飲用水為無菌純凈水。本研究已通過錦州醫科大學實驗動物倫理委員會審核（批件編號：2018014） 。實驗過程中對動物的處置符合科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求。

2 方法

2.1 分組、給藥與造模

將78只SD大鼠采用抽簽法隨機分為假手術組、模型組、丁苯酞對照組（陽性對照，10 mL/kg）[9]和人參皂苷Rg1低、中、高劑量組（10、20、40 mg/kg）[10-11]，每組13只。各給藥組大鼠腹腔注射相應藥物，假手術組和模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續7 d。給藥結束后，除假手術組外，其余各組大鼠均采用右側大腦中動脈栓塞法（MCAO）[12]復制局灶性CIRI模型：異氟烷氣體麻醉大鼠后，沿頸旁正中切口，分離頸部動脈，分別找到頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），用動脈夾夾閉ICA;在ECA剪一切口，插入線栓，沿著ICA走向在ICA內緩慢推進直至感覺有少許阻力為止（從ECA與ICA分叉處起始插入約22 mm，此時已插至大腦前動脈端，阻斷了大腦中動脈血流）;栓塞2 h后拔出線栓，再灌注24 h。假手術組大鼠不插入線栓，其他操作步驟相同。

2.2 大鼠神經功能缺損評分

造模結束并待大鼠蘇醒后，每組隨機取5只大鼠，參照改良神經功能缺損評分標準[13]對其進行評分，評分越高則表明神經功能缺損越嚴重。

2.3 大鼠腦梗死情況檢測

采用TTC染色法檢測。每組隨機取4只大鼠，斷頭取腦組織，置于冰上腦模內，沿冠狀切面以腦腹側視交叉為中點切第1片，連續切5片，每片厚約2 mm。將切片置于1%TTC染色液中，在37 ℃染色20 min左右，以10%福爾馬林固定后拍照，并采用Image J 1.36b軟件計算大鼠腦梗死體積占對側半球體積的百分比（即腦梗死體積百分比）。

2.4 大鼠腦含水量檢測

采用腦組織干濕重法[14]檢測。每組隨機取3只大鼠，斷頭取腦后稱定濕質量，之后將腦組織在烘箱中（105 ℃）干燥72 h，再次稱定質量。計算腦含水量[腦含水量（%）=（濕質量-干質量）/濕質量×100%]，以此反映腦水腫情況。

2.5 大鼠血清中IL-1β、IL-6含量檢測

采用ELISA法檢測。每組隨機取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，將其于仰臥位行心臟取血（取血后放回用于后續實驗），血樣以1 500 r/min離心20～30 min，取上清液，于-20 ℃保存，備測。按照ELISA試劑盒說明書方法操作，檢測血清中IL-1β、IL-6含量。

2.6 大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達情況檢測

2.6.1 采用免疫組織化學法檢測 每組隨機取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，通過心臟經4%多聚甲醛-戊二醛混合液灌流固定，斷頭取腦組織，以蔗糖沉糖后行10 μm冰凍切片。切片采用牛血清白蛋白封閉1 h，滴加p-p38 MAPK（稀釋比例為1 ∶ 100）、p-NF-κB p65（稀釋比例為1 ∶ 200）一抗工作液，于4 ℃孵育過夜;次日取出，恢復至室溫后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，每次5 min;滴加二抗工作液（稀釋比例為1 ∶ 200），于37 ℃下孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min;加入DAPI染色劑復染細胞核，在 37 ℃下孵育5 min后，PBS漂洗3次，每次5 min。以熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照（目標蛋白的陽性表達呈黃綠色熒光;細胞核呈藍色熒光，用以定位細胞位置）。每只大鼠選取5張切片，在高倍鏡（×400）下計數陽性表達細胞數，取平均值。

2.6.2 采用Western blotting法檢測 每組取剩余3只大鼠，10%水合氯醛麻醉，通過心臟經生理鹽水灌流后斷頭取腦，于腦模上冠狀切取部分腦組織，加入RIPA裂解液，超聲粉碎，在4 ℃下以12 000 r/min離心25 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白含量后，制成含蛋白2.5? ? ? ?g/mL的組織提取液。取20 ?L組織提取液行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，然后在300 mA、25 ℃條件下轉移80 min至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上;將膜置于含1%牛血清白蛋白封閉液中，搖床上振搖1.5 h進行封閉;然后分別加入p-p38 MAPK（稀釋比例為1 ∶ 1 000）、p-NF-κB p65（稀釋比例為1 ∶ 2 000）和GAPDH（稀釋比例為1 ∶ 5 000）抗體，于4 ℃孵育過夜;以TBST清洗3次，加入相應的二抗（稀釋比例均為1 ∶ 2 000），室溫下振搖1.5 h;再次用TBST清洗3次后，以ECL進行發光顯色，采用Image J 1.36b軟件測定條帶吸光度。以GAPDH為內參，根據目的蛋白條帶與內參蛋白條帶吸光度的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。結果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，當方差齊性時組間兩兩比較采用LSD檢驗，當方差不齊時組間兩兩比較采用Tamhanes T2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠神經功能缺損評分結果

與假手術組比較，模型組和各給藥組大鼠神經功能缺損評分均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠神經功能缺損評分均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組大鼠神經功能缺損評分顯著降低（P<0.05）。與丁苯酞對照組比較，人參皂苷Rg1各劑量組大鼠神經功能缺損評分差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠神經功能缺損評分結果見表1。

3.2 大鼠腦梗死體積百分比測定結果

除假手術組大鼠腦組織呈均勻紅色、無梗死灶外，其余各組大鼠均有深淺不同的白色梗死灶，其中以模型組最為明顯。與假手術組比較，模型組和各給藥組大鼠的腦梗死體積百分比均有不同程度的升高，且除人參皂苷Rg1高劑量組外的其余各組大鼠差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦梗死體積百分比均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組大鼠腦梗死體積百分比顯著降低（P<0.01）。與丁苯酞對照組比較，人參皂苷Rg1各劑量組大鼠腦梗死體積百分比差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠腦組織TTC染色結果見圖1，腦梗死體積百分比測定結果見表1。

3.3 大鼠腦含水量測定結果

與假手術組比較，模型組和各給藥組大鼠腦含水量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦含水量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;人參皂苷Rg1不同劑量組間比較以及人參皂苷Rg1各劑量組與丁苯酞對照組比較，大鼠腦含水量差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠腦含水量測定結果見表1。

3.4 血清中IL-1β、IL-6含量測定結果

與假手術組比較，除人參皂苷Rg1中、高劑量組大鼠血清中IL-6含量外，其余各組的IL-1β、IL-6含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。人參皂苷Rg1不同劑量組間比較以及人參皂苷Rg1各劑量組與丁苯酞對照組比較，大鼠血清中IL-1β含量差異均無統計學意義（P>0.05），但人參皂苷Rg1中、高劑量組和丁苯酞對照組大鼠血清中IL-6含量顯著低于人參皂苷Rg1低劑量組（P<0.05）。各組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量測定結果見表2。

3.5 大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達情況測定結果

3.5.1 免疫組織化學法測定結果 與假手術組比較，模型組和各給藥組大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白陽性表達細胞數均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白陽性表達細胞數均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1中、高劑量組和丁苯酞對照組大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白陽性表達細胞數均顯著減少（P<0.05或P<0.01），且人參皂苷Rg1中、高劑量組和丁苯酞對照組大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白陽性表達細胞數組間差異無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達的免疫熒光染色顯微圖見圖2（圖中，“Merge”表示染色的疊加圖），陽性表達細胞計數結果見表3。

3.5.2 Western blotting法測定結果 與假手術組比較，模型組和人參皂苷Rg1低劑量組大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達水平以及人參皂苷Rg1中劑量組和丁苯酞對照組大鼠腦組織中p-p38 MAPK蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。人參皂苷Rg1不同劑量組間比較以及人參皂苷Rg1各劑量組與丁苯酞對照組比較，大鼠腦組織中p-p38 MAPK蛋白表達水平差異均無統計學意義（P>0.05），但人參皂苷Rg1中、高劑量組和丁苯酞對照組大鼠腦組織中p-NF-κB p65蛋白表達水平均顯著低于人參皂苷Rg1低劑量組（P<0.05）。各組大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達電泳圖見圖3，蛋白表達水平測定結果見表4。

4 討論

CIRI是由于血流再通所引起的級聯反應導致的對腦組織的二次損傷，其常常導致機體出現神經功能缺損、腦梗死和腦水腫等癥狀，嚴重者可引起偏癱、失語甚至死亡[15]。本研究結果顯示，CIRI后大鼠均出現了不同程度的神經功能缺損、腦組織梗死和腦水腫癥狀，但是在給予不同劑量人參皂苷Rg1處理后，CIRI大鼠的神經功能缺損癥狀和腦水腫程度均顯著減輕、腦梗死體積顯著縮小，且其作用與丁苯酞（丁苯酞為臨床常用藥，對急性腦缺血性腦卒中患者的神經功能缺損有明顯改善作用[16]，故本文以其為陽性對照）相近，這提示人參皂苷Rg1能夠減輕缺血再灌注所造成的腦組織損傷，具有一定的神經保護作用。

炎癥反應在CIRI中扮演著重要角色，許多炎性細胞和炎性介質均參與了炎癥反應[17-18]。抑制炎癥反應、減輕腦組織損傷，是腦卒中治療的重要手段之一[19-20]。IL由多種細胞產生，在炎癥反應、體液免疫方面發揮著重要作用[21]。狄政莉等[22]發現，IL-1β和IL-6參與了腦缺血再灌注后炎癥損傷的病理過程。本研究結果顯示，CIRI后大鼠血清中IL-1β、IL-6含量顯著升高，而給予不同劑量人參皂苷Rg1處理可以顯著降低CIRI大鼠血清中 IL-1β、IL-6含量，且人參皂苷Rg1中、高劑量組和丁苯酞組間兩者含量差異均無統計學意義（P>0.05）。NF-κB廣泛存在于真核細胞內，能與大量炎癥反應基因的啟動子結合，是一種重要的轉錄激活因子，其調控基因可以編碼細胞因子、免疫調節分子等，通過上述作用參與炎癥反應等生物學進程[23-24]。在腦缺血時，NF-κB被炎性因子、細胞因子、鈣超載等因素刺激而磷酸化，誘導細胞因子、黏附分子、炎性酶類的表達，形成炎癥反應的惡性循環，導致腦組織水腫和神經細胞的損傷[25-27]。而作為MAPK家族成員之一的p38 MAPK，在炎癥反應及其調控中發揮了重要作用[28]：p38 MAPK受到刺激后被磷酸化，激活為特異性底物p-p38 MAPK，參與炎癥反應的調控。p-p38 MAPK作為NF-κB的上游信號分子，可促使NF-κB的磷酸化，活化后的NF-κB分解為p50和p65，之后進行核轉位進入細胞核，調節炎癥基因的轉錄[29]。本研究結果顯示，CIRI后大鼠腦組織中p-p38 MAPK、p-NF-κB p65陽性表達細胞數顯著增加，其相應蛋白表達水平也顯著升高;而經人參皂苷Rg1處理后，大鼠腦組織中只有少量的陽性表達細胞，蛋白表達水平也顯著降低。

綜上所述，本研究證實了人參皂苷Rg1可通過下調p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白的表達，減輕腦梗死癥狀，從而發揮腦保護作用。然而，本研究還存有許多不足之處，如只選用單一時間點進行考察、未進行時-效關系分析等。在后續實驗中，筆者將進一步對此進行完善。

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（收稿日期：2019-12-27 修回日期：2020-04-14）

（編輯：林 靜）