白樺HSFA4轉錄因子的克隆及耐鹽功能分析*

劉中原 劉 崢 徐 穎 劉珊珊 田志蘭 解慶軍 高彩球

(東北林業大學 林木遺傳育種國家重點實驗室 哈爾濱 150040)

自然界中，植物不斷受到高溫、干旱、鹽漬等非生物逆境脅迫，由于植物固生于土壤中，故在漫長的進化過程中植物自身形成了一個高效的逆境脅迫響應和逆境應答機制，從而使植物能在各種逆境條件下做出應答并生存。因此，研究植物逆境表達調控網絡對揭示植物抗逆機制至關重要。

熱激轉錄因子(heat shock transcription factor, HSF)被證實是廣泛存在于植物細胞內的一類重要的轉錄調節基因。從最早Scharf等(1990)在番茄(Lycopersiconesculentum)中研究HSF基因以來，大量的HSF基因從各種植物中相繼得到分離和鑒定，如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatabacum)、胡蘿卜(Daucuscarota)、大豆(Glycinemax)、小麥(Triticumaestivum)中分別鑒定出21、24、25、24、35、52、56個HSF家族成員(Guoetal., 2008; 2015; Chungetal., 2013; Wangetal., 2014; Zhouetal., 2013; Huangetal., 2015; Linetal., 2011)。HSF蛋白的分子結構具有4個代表性的重要結構域： DNA結構域(DNA-binding domain, DBD)、寡聚化結構域 (oligomerization domain, OD)、核定位信號(nuclear localization signal, NLS)，及有些HSF具有的C末端轉錄激活結構域(C-terminal domain, CTD)。HSF的DBD和OD結構域是最為保守的區域。DBD由3個α-螺旋(α1、α2和α3)和4個β-折疊(β1、β2、β3和β4)組成。根據OD在區域A與B之間氨基酸的插入個數可將植物HSFs分為A、B和C 3類，其中A和C類分別在區域A與B之間插入21個和7個氨基酸，而B類HSFs結構無氨基酸插入(Dambergeretal., 1994)。

白樺是一種落葉喬木，在亞洲東部廣泛分布。喜光，耐嚴寒，生命力極強，在恢復森林、維護森林的生態效益中起重要作用，同時其木材紋理直、結構細，具有重要的經濟價值。但由于近年來環境不斷惡化，鹽漬化土地面積越來越大，對白樺的栽培和推廣造成困難。因此，培育耐鹽白樺新品種具有重要的意義。本研究從白樺中克隆獲得1條HSFA4基因，利用qRT-PCR分析了白樺受不同非生物脅迫(高鹽、干旱、鎘、熱、冷)和激素處理(ABA、GA3、JA)下HSFA4在根、莖和葉中的表達情況。為進一步探究BpHSFA4基因是否具有耐鹽功能，構建了HSFA4基因過表達載體(pROKⅡ-HSFA4)和抑制表達載體(pFGC5941-HSFA4)，并獲得了瞬時過表達和抑制表達HSFA4基因白樺，分析比較了過表達、抑制表達HSFA4基因白樺與對照白樺(轉pROKⅡ空載)在鹽脅迫下的組織化學染色及生理指標的變化，以初步鑒定HSFA4基因的耐鹽功能。本研究可為深入探究白樺HSFA4基因的耐鹽功能及其機制，以及利用基因工程手段提高植物尤其是林木的耐鹽能力奠定理論基礎，并提供基因材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

植物材料的種植與脅迫處理參照Liu等(2018)，具體步驟為： 將野生白樺種子均勻撒播于泥炭土、蛭石和珍珠巖4∶4∶1 (V/V/V)的混合基質中，置于室溫25 ℃、相對濕度70%～75%、14 h光照/10 h黑暗的溫室中。將2月齡生長勢一致的白樺幼苗分為6組，分別用0.2 mol·L-1NaCl、20% (200 g·L-1) PEG6000、150 μmol·L-1CdCl2、100 μmol·L-1ABA、50 μmol·L-1GA3和100 μmol·L-1JA溶液對幼苗進行根部澆灌脅迫處理，處理時間為6、12、24、48、72 h，同時以正常澆水的白樺材料作為對照。另外，取同一批長勢相同的白樺幼苗分別置于4 ℃和37 ℃的光照培養箱中進行冷熱處理(25 ℃處理作為對照)，處理時間為6、12、24、48、72 h。脅迫處理后分別取相應時間點的白樺根、莖、葉組織，經液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱備用。每個處理重復3次。

1.2 白樺HSFA4基因的克隆和序列分析

從白樺轉錄組數據庫中篩選獲得1條HSFA4基因(命名為BpHSFA4)，在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行序列比對和ORFFinder查找以確定HSFA4基因是否具有完整開放閱讀框。根據BpHSFA4基因序列，設計引物(表1)，以白樺葉cDNA為模板，RT-PCR擴增獲得該基因，克隆進pMD?18-T載體，測序驗證所克隆的BpHSFA4基因序列。對克隆獲得的BpHSFA4基因進行序列分析。使用在線工具ProtParam (https:∥web.expasy.org/protparam/)推導BpHSFA4基因編碼蛋白質的分子量及理論等電點。在NCBI上對白樺BpHSFA4蛋白進行氨基酸序列同源性比對，選取與白樺BpHSFA4蛋白同源性較高的19種植物的HSFA4蛋白序列，利用BioEdit7.0.9軟件進行多序列比對，具體操作參考Hall(1999)，并利用MEGA5.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)預測系統發生樹，采用默認參數進行分析，具體操作參考Tamura等(2011)。這19種植物分別是栓皮櫧(Quercussuber)、核桃(Juglansregia)、土瓶草(Cephalotusfollicularis)、蓖麻(Ricinuscommunis)、木薯(Manihotesculenta)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、麻風樹(Jatrophacurcas)、毛果楊(Populustrichocarpa)、克萊門柚(Citrusclementina)、胡楊(Populuseuphratica)、甜橙(Citrussinensis)、可可(Theobromacacao)、榴蓮(Duriozibethinus)、野大豆(Glycinesoja)、番木瓜(Caricapapaya)、醉蝶花(Tarenayahassleriana)、相思子(Abrusprecatorius)、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)、杭白菊。

1.3 實時熒光定量RT-PCR

利用RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司BioTeke)提取各處理時間點的白樺根、莖和葉的總RNA。按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit (TaKaRa)試劑盒說明將RNA反轉錄成cDNA。將反轉錄產物稀釋10倍，用作qRT-PCR反應模板。選擇白樺微管蛋白基因(Tubulin，登錄號： FG067376)和泛素基因(Ubiquitin，登錄號： FG065618)作為內參基因。內參和BpHSFA4基因的qRT-PCR引物見表1。qRT-PCR反應體系為20 μL，其中包括稀釋后的模板2 μL、基因特異性上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL。qRT-PCR反應條件為： 94 ℃預變性30 s； 94 ℃變性12 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，80 ℃讀板1 s，45個循環。為了確保試驗結果的重現性，qRT-PCR進行了3次獨立的試驗(Liuetal., 2018)?；虮磉_量分析采用2-△△Ct法(Livaketal., 2001)。

1.4 BpHSFA4基因植物過表達載體和抑制表達載體構建

根據植物過表達載體pROKⅡ的多克隆位點和BpHSFA4基因特征，在設計引物時于BpHSFA4基因5′端和3′分別添加了XbaⅠ和KpnⅠ限制性內切酶位點(引物見表1)。將以白樺cDNA為模板克隆獲得的BpHSFA4基因插入到XbaⅠ和KpnⅠ限制性內切酶位點之間(圖1A)。通過單克隆PCR和測序驗證，獲得BpHSFA4基因過表達載體，命名為pROKⅡ-BpHSFA4，轉化進根癌農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)菌株EHA105中。將構建好的EHA105(pROKⅡ-BpHSFA4)保存在-80 ℃備用。

抑制表達載體構建時先構建pFGC5941-BpHSFA4-Cis，根據植物抑制表達載體pFGC5941的多克隆位點及BpHSFA4基因的特征，在BpHSFA4基因5′端和3′端分別添加AscⅠ和SwaⅠ限制性內切酶位點，設計引物(表1)。進而以pROKⅡ-BpHSFA4質粒為模板，pFGC5941-BpHSFA4-Cis-F/R為引物進行PCR，擴增帶有AscⅠ和SwaⅠ限制性內切酶位點的目的基因。通過酶切，連接后重組載體為pFGC5941-BpHSFA4-Cis，進而轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)，檢測正確后，保存備用。再以pFGC5941-BpHSFA4-Cis為基礎，在XbaⅠ、BamHⅠ酶切位點之間插入BpHSFA4-Anti鏈，通過單克隆PCR和測序驗證，獲得BpHSFA4基因抑制表達載體(圖1B)，命名為pFGC5941-BpHSFA4，轉農桿菌菌株EHA105。將構建好的EHA105(pFGC5941-BpHSFA4)保存在-80 ℃。

表1 qRT-PCR和載體構建的引物序列

圖1 植物過表達載體pROKⅡ-BpHSFA4(A)和抑制表達載體pFGC5941-BpHSFA4(B)的構建圖譜

1.5 瞬時轉化白樺的獲得及耐鹽功能分析

根據Liu等(2018)和Zhang等(2012)的方法將構建好的EHA105(pROKⅡ-BpHSFA4)、EHA105(pFGC5941-BpHSFA4)和EHA105(pROKⅡ)(空載體，作為對照)分別瞬時侵染白樺，分別標記為OE、SE和CK。分析比較鹽脅迫后瞬時過表達、抑制表達BpHSFA4基因白樺和對照白樺的鹽脅迫相關生理生化指標，以初步探究BpHSFA4基因是否具有耐鹽功能及其可能參與的生理調控通路。具體的步驟為:將生長30～40天白樺組培苗放入轉化液中，25 ℃ 90 r·min-1培養3 h后，快速將苗轉移至洗滌液中，復水90 s，再用無菌濾紙吸干菌液轉移至共同培養培養基。共培養48 h后，將3種白樺轉基因株系分別轉移至含150 mmol·L-1NaCl的MS培養基上。將鹽脅迫處理0、2 h后的瞬時侵染白樺苗置于50 mL離心管中，分別加入20 mL二氨基聯苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)和伊文思藍(Evans blue)染色液，室溫染色3～5 h。染色結束后，用75%(V/V)乙醇+5%(V/V)甘油沸水浴脫色(Zhangetal., 2011; Kimetal., 2003; Liuetal., 2018)。此外，收集脅迫處理12、24、36 h后的白樺幼苗，進行生理指標分析(Zhangetal., 2018; Liuetal., 2018)。同時以正常MS培養白樺轉基因株系作為對照。每次試驗至少包含9株白樺幼苗，并重復3次。

2 結果與分析

2.1 BpHSFA4基因的克隆及序列分析

BpHSFA4基因cDNA長度為1 170 bp，具有完整的開放讀碼框，編碼389個氨基酸，編碼蛋白的相對分子量(molecular weight)為44.15 kDa，理論等電點(theoretical pI)為5.14。BpHSFA4蛋白具有典型HSF結構域。選擇19種與白樺BpHSFA4蛋白同源性較高的已知HSFA4蛋白序列，利用BioEdit軟件和MEGA軟件分別進行多序列比對和進化樹構建，結果顯示20種植物的HSFA4蛋白序列均有保守的HSF結構域(圖2A)。氨基酸序列一致性在68%～79%，其中白樺BpHSFA4蛋白與杭白菊(79%)、栓皮櫧(79%)、土瓶草(71%)的HSFA4蛋白的同源性較高。進化樹分析結果也顯示，白樺與杭白菊、栓皮櫧、土瓶草親緣關系較近，歸為一組(圖2B)。

圖2 白樺BpHSFA4蛋白與其他19種植物HSFA4蛋白的多序列比對(A)和系統進化樹分析(B)

2.2 不同脅迫處理下BpHSFA4基因的表達模式分析

2.2.1 非生物脅迫處理下BpHSFA4基因的表達模式 為了初步分析BpHSFA4基因能否對各種非生物脅迫逆境做出應答，利用qRT-PCR分析了鹽、干旱、鎘、高溫和低溫脅迫處理后白樺BpHSFA4基因的表達模式。結果顯示： NaCl脅迫下BpHSFA4在白樺根、莖和葉中均被誘導表達。葉中，BpHSFA4在脅迫初期(12 h)表達量變化不明顯，隨后上調表達，至脅迫48 h達到最高表達水平； 莖中，脅迫24 hBpHSFA4基因表達水平達到最高，為對照的58.1倍； 根中，脅迫24 h前均表現為下調表達，脅迫6 h達到最低表達水平，48 h后上調表達(圖3A)。鎘脅迫下，葉中BpHSFA4基因在整個脅迫過程中為顯著上調表達(除6 h無明顯變化)，24 h表達達最高水平； 莖中表達趨勢與葉中類似，6 h后全部上調表達； 而在根中，BpHSFA4基因表達先下調隨后上調，脅迫12 h達到最低表達水平，48 h達最高表達水平(圖3B)。高溫脅迫下，葉和根中BpHSFA4基因在整個脅迫過程中均全部被誘導表達，且都在12 h表達達到最高水平； 莖中，BpHSFA4基因在脅迫過程中也受高溫誘導，但表達量變化不如葉和根中明顯(圖3C)。低溫脅迫下，葉和根中，BpHSFA4基因在整個脅迫過程中全部被誘導表達，48 h達到最高水平； 但在莖中，BpHSFA4基因在整個脅迫過程中無明顯變化(圖3D)。PEG6000脅迫下，葉中，BpHSFA4基因在所有研究時間點均為上調表達，48 h達到最高表達水平； 根中，BpHSFA4基因在脅迫過程中受PEG6000誘導，大部分時間點上調表達，且在2個時間點表達量增加超過了2倍； 而在莖中，BpHSFA4基因在脅迫過程中無明顯變化(圖3E)。

圖3 非生物脅迫處理下白樺BpHSFA4基因表達分析

2.2.2 激素處理下BpHSFA4基因的表達模式 ABA處理后，葉中BpHSFA4基因下調表達，并在48 h達到最低表達水平； 莖中，BpHSFA4基因在處理前期無明顯表達，48 h明顯下調后開始上調表達，于72 h時達到最高表達水平； 而根中，BpHSFA4基因全部被誘導表達(圖4A)。GA3處理后，葉中，BpHSFA4基因表達在脅迫初期不明顯，隨后表達量逐漸增加，48 h達到最高表達水平(為對照的8.79倍)； 但在莖和根中，與對照相比，BpHSFA4基因在GA3處理后，表達量變化不明顯(圖4B)。JA處理后，在葉和莖中BpHSFA4上調表達，其中葉中處理24 h時表達量達最高水平，為對照的7.36倍，莖中處理6 h表達量達到最高水平； 在根中，6 h達到最低表達水平，而在12 h達到最高表達水平(圖4C)。

圖4 激素處理下白樺BpHSFA4基因表達分析

2.3 BpHSFA4 基因耐鹽功能分析

2.3.1 瞬時表達白樺的獲得 分別提取3種瞬時侵染后的轉基因白樺株系的總RNA，反轉錄成cDNA，利用qRT-PCR分析3種瞬時轉基因白樺株系中BpHSFA4基因的表達情況。結果顯示，在非脅迫處理時(脅迫0 h)，過表達株系中BpHSFA4基因的表達量顯著增加，是對照的3.11倍，而抑制表達株系則顯著降低，是對照的58.76%。在150 mmol·L-1NaCl脅迫12、24、36 h后過表達株系中BpHSFA4基因的表達量分別是對照的16.1、16.19、3.83倍，而抑制表達株系則分別是對照的17.9%、56.3%、26.8%。表明成功獲得了瞬時過表達和抑制表達BpHSFA4基因白樺株系(圖5)。

圖5 150 mmol·L-1 NaCl脅迫下瞬時轉化白樺BpHSFA4基因的表達

Evans blue可以進入細胞膜結構不完整或喪失活性的細胞內，并將細胞染成藍色。Evans blue染色試驗可以通過細胞染色的深淺判斷轉基因白樺細胞的損傷或死亡情況。與DAB和NBT染色結果相似，非脅迫條件下，3種轉基因植株的染色無明顯差異。但在鹽脅迫條件下，與對照植株相比，過表達BpHSFA4植株染色淺，表明細胞損傷程度較輕、細胞死亡量較少，而抑制表達植株染色深，表明細胞受損程度高、細胞死亡量較多(圖6C)。

2.3.3 鹽脅迫后3種瞬時轉化白樺生理指標的比較 在無鹽脅迫條件下，過表達BpHSFA4、抑制表達BpHSFA4和對照白樺株系的H2O2含量、MDA含量、SOD活性、POD活性和相對電導率無顯著差異。但是，NaCl脅迫條件下，過表達BpHSFA4植株的H2O2含量、MDA含量和相對電導率明顯低于對照植株，抑制表達BpHSFA4植株的H2O2含量、MDA含量和相對電導率則明顯高于對照植株； 過表達BpHSFA4植株的SOD和POD活性明顯高于對照植株，而抑制表達BpHSFA4植株的SOD和POD活性明顯低于對照株系(圖7)。表明鹽脅迫條件下，過表達BpHSFA4基因能提高活性氧清除能力、降低膜脂氧化程度從而提高耐鹽能力，BpHSFA4基因可能是一個耐鹽能力優良的候選基因。

圖6 150 mmol·L-1NaCl脅迫下白樺轉基因植株與對照NBT、DAB和Evans blue染色比較

圖7 150 mmol·L-1NaCl脅迫下白樺轉基因植株與對照的生理指標比較

3 討論

3.1 BpHSFA4基因的結構與逆境脅迫下的表達

從白樺轉錄組數據庫中篩選鑒定出1條HSFA4基因(BpHSFA4)，經過生物信息學分析，其編碼蛋白的N端有保守的HSF結構域。系統進化樹結果表明，BpHSFA4與杭白菊、栓皮櫧、土瓶草蛋白的同源性較高，聚在同一分支。栓皮櫧和土瓶草的HSFA4基因的研究尚未見報道。而杭白菊中，CmHSFA4通過結合HSE元件調控下游相關基因維持Na+/K+離子穩態平衡和減少ROS的積累從而賦予杭白菊耐鹽能力(Lietal., 2018)。因此，推測BpHSFA4基因可能也具有耐鹽脅迫功能。

進一步對BpHSFA4基因在不同的脅迫處理后白樺各組織中的表達研究結果顯示，在不同非生物脅迫下，白樺葉、莖和根中，BpHSFA4基因均能產生不同程度的改變。在鹽和干旱脅迫下，BpHSFA4基因能明顯被誘導表達，且在葉中表達趨勢基本一致，都是上調表達。可能是由于鹽和干旱脅迫都能對植物產生滲透脅迫(胡濤等， 2018)，從而誘導該基因的表達，但是由于鹽脅迫過程中會產生離子毒害等現象，故導致其在鹽和干旱脅迫下表達模式有所不同。在鹽脅迫下BpHSFA4基因與鎘脅迫下的表達趨勢基本一致，特別在葉和根組織中。這一現象表明BpHSFA4基因可能對鹽和鎘脅迫具有相同的調控機制。同時研究過程中發現BpHSFA4基因在ABA激素脅迫下也有明顯的應答，表明BpHSFA4基因可能參與了ABA介導的鹽和干旱脅迫應答。這些現象為下一步繼續挖掘BpHSFA4基因的功能提供了新的方向。

3.2 BpHSFA4 基因的抗逆功能

當植物遭受逆境脅迫(鹽脅迫)時可能破壞植物細胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)產生與清除之間的平衡，導致ROS濃度不斷增加，并對生物膜、蛋白質、DNA和RNA等造成氧化損傷，進而抑制植物生長和發育，嚴重時可導致死亡(Hossainetal., 2015; Jainetal., 2015)。在漫長的進化過程中植物為了適應環境變化，自身逐步形成了一個靈活高效的逆境脅迫響應和應答機制，使其能在逆境條件下生存。其中維持體內活性氧平衡是植物抵抗逆境脅迫的一個重要機制。

鹽脅迫下，植物必須及時清除體內多余的ROS，以維持植物體正常的生命活動。在植物體內存在2種活性氧清除機制，其一就是酶促清除系統，主要依靠酶促抗氧化劑來完成。主要有超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)等。一般會通過提高SOD和POD酶活性來清除體內多余的ROS。在前期的研究中，發現HSFA4基因能調控ROS水平，從而使胡楊達到脅迫馴化的目的(Zhangetal., 2016)。小麥HSFA4基因通過調控POD來減少ROS的積累，從而賦予小麥抗氧化和耐熱能力(Goswamietal., 2015)。TaHSFA4和OsHSFA4通過上調水稻中的金屬硫蛋白基因表達增強了水稻對鎘的耐受性(Perez-Salamoetal., 2014)。在向日葵(Helianthusannuus)中，HaHSFA4和HaHSFA9共表達激活了smHSP基因的表達從而導致小熱激蛋白的大量積累，因而增強了向日葵對脫水的耐受性(Personatetal., 2014)。

鹽脅迫后，植物體內產生高水平的活性氧，直接攻擊生物膜，對植物造成傷害甚至死亡(Hendryetal., 1992)。MDA是膜脂過氧化的最終分解產物，其含量可以反映植物在逆境脅迫下受傷害的程度。在本試驗中轉基因白樺株系和對照白樺中MDA含量都呈現隨著脅迫時間的延長而逐漸增加的趨勢，但是在整個脅迫過程中，過表達BpHSFA4株系MDA含量均明顯低于對照，抑制表達BpHSFA4株系MDA含量均明顯高于對照。Evans blue染色結果表明： 過表達BpHSFA4植株中細胞受損傷程度較輕、細胞死亡量較少，而抑制表達植株細胞受損程度高、細胞死亡量較多。相對電導率的測定結果也與此一致，表明過表達BpHSFA4株系細胞膜受損程度低、電解質外滲少，細胞膜結構的完整性較高； 抑制表達BpHSFA4白樺株系則與之相反。

4 結論

從白樺中克隆獲得了BpHSFA4基因，其cDNA長度為1 170 bp，具有完整的開放讀碼框，編碼389個氨基酸，編碼蛋白的相對分子量為44.15 kDa，理論等電點為5.14。白樺BpHSFA4蛋白具有典型HSF結構域。該基因能對非生物脅迫和激素脅迫做出應答。特別是鹽脅迫下，該基因表達變化明顯，表明其可能參與了鹽脅迫應答。150 mmol·L-1NaCl脅迫后，過表達BpHSFA4轉基因白樺株系可通過提高SOD和POD活性，降低MDA和H2O2含量來增強細胞清除活性氧能力、降低膜脂氧化程度從而減少細胞受損或死亡，進而提高轉基因白樺的耐鹽能力。后續研究中，將進一步對該基因的耐鹽機制和調控網絡進行分析。