清熱涼血解毒方對大鼠痔術后創面愈合及炎癥因子表達的影響?

劉 超 王振彪 王 垚 彭俊付 王 銳

（1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京100038；2.首都醫科大學附屬北京懷柔醫院，北京 101400；3.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

痔是肛腸外科常見多發疾病，主要以手術治療為主，術后創面修復機制復雜，手術創傷其鄰近組織的牽拉擠壓等導致肛門水腫、疼痛、創面感染等，嚴重影響患者的預后和生活質量。如何減少痔術后創面疼痛，加速創面愈合為臨床亟待解決的問題[1-3]。現代研究發現炎癥因子和炎癥細胞對炎癥過程具有決定作用，血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）等與脂多糖協同，刺激、激活更多炎癥介質的表達，從而放大和加重炎癥反應[4-5]。炎癥因子能對痔血管壁及血管內皮能造成氧化損傷，被氧化損傷的血管壁又不斷產生炎癥因子。血管內皮生長因子（VEGF）可增加血管的通透性，減輕受損的血管內皮細胞引起的功能障礙，加速受損的血管內皮細胞愈合，促進新生血管愈合。前列腺素E2（PGE2）是疼痛和炎癥的重要因子，在體內發揮著重要的調節功能，參與炎癥反應各階段[6-7]。

中醫認為，痔瘡病因主要為先天不足，臟腑本虛，飲食不節，過食辛辣之物等導致血管弛緩、經脈瘀滯，痔術后創面多為濕邪所困，氣血運行不暢，虛實夾雜，使得創面愈合更加緩慢，治宜清利濕熱，祛瘀活血止痛，消水腫促生肌[8-9]。清熱涼血解毒方為北京世紀壇醫院肛腸科經驗方，對痔術后創面具有較好的治療作用，但其作用機制尚不明確。因此，本研究通過干預大鼠痔術后創面感染模型，旨在探討清熱涼血解毒方對大鼠痔術后創面愈合的作用及對相關炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，雌雄各半，8周齡，體質量（200±20）g，購于浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。動物室溫飼養，自然采光，自由飲水，適應性飼養7 d后進行實驗研究。

1.2 試藥與儀器 清熱涼血解毒方，組成：黃連12 g，黃柏20 g，梔子10 g，生大黃15 g，苦參15 g，地榆10 g，白芍 20 g，秦皮 15 g，白頭翁 10 g，延胡索 20 g，茵陳10 g，紫草10 g。上述中藥飲片由北京世紀壇醫院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，分別濃縮至1 mL含0.5、1、1.5 g原藥材的藥液，作為清熱涼血解毒方低、中、高劑量。冰醋酸、水合氯醛，購于國藥集團化學試劑有限公司；HE染色試劑盒購于武漢阿斯本生物技術有限公司（批號分別為：AS1055A、AS1055B），TNF-α、IL-6和IL-8試劑盒購于碧云天生物科技有限公司（批號分別為：J190064、J190127和J190376），PGE2和VEGF單抗購于武漢阿斯本生物技術有限公司（批號分別為bs-7402R和bs-0167R）；二抗（河北博海生物工程開發有限公司，批號：20190424）。手術器械，蘇州六六視覺醫療設備公司生產；BX60顯微鏡，日本Olympus Optical公司生產；切片機，德國萊卡公司；ELx800酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 模型制備 將50只雄性SD大鼠分為空白對照組、模型組及清熱涼血解毒方低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組外，其余大鼠采用肛周局部注射冰醋酸法建立痔術后創面感染模型[10]。碘伏棉球消毒大鼠肛周皮膚，75%冰醋酸扇形注射于大鼠肛門外周皮下，注射后局部按摩肛周，使藥液充分彌散。注射后24 h觀察肛門局部潰瘍、紅腫、炎性滲出等。造模成功標準為肛門局部紅腫隆起≥1mm，超過潰瘍面，炎癥滲出多，潰瘍面＞0.3 cm2。

1.4 給藥方法 于造模成功后第2天進行藥物治療。空白對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，清熱涼血解毒方低、中、高劑量組分給予0.5、1、1.5 g/mL的清熱涼血解毒方灌胃，劑量均為10 mL/kg，每日1次，連續給藥7 d。

1.5 標本采集與檢測 1）肛周水腫程度和創面面積檢測。末次給藥后，測量肛周創面的潰瘍面積大小及水腫的程度，并進行標準評分。無水腫為0分，勉強可見為1分，邊緣高于皮膚為2分，明顯腫脹為3分。2）炎癥因子檢測。10%水合氯醛1 mL/100 g麻醉處死各組大鼠前，眼球取血，離心，取上清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清TNF-α、IL-6和IL-8水平，嚴格按照說明書操作。3）肛周組織HE染色。于末次給藥24 h后，10%水合氯醛1 mL/100 g水合氯醛麻醉處死各組大鼠，取肛周組織，生理鹽水清洗后，固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，乙醇水化，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇溶液分化，自來水沖洗返藍，浸入伊紅染液，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠進行封片，顯微鏡下觀察。4）免疫組化檢測VEGF和PGE2。取上述病理切片，充分脫蠟，1%甲醇雙氧水處理、抗原修復液修復、封閉、添加VEGF和PGE2一抗，二抗；鏈霉卵白素工作液處理，DAB顯色，蘇木素復染，封片，光學顯微鏡下選5個視野觀察。陽性表達為棕黃色，蛋白表達量積分光密度（IOD）表示。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用t檢驗比較組內和組間差異；計數資料以百分率（%）表示，應用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肛周水腫程度評分和創面面積比較見表1。與空白對照組比較，模型組肛周水腫程度評分和創面面積顯著高于空白對照組，清熱涼血解毒方各劑量組水腫程度評分和創面面積顯著低于模型組，且中、高劑量組低于低劑量組（P＜0.05），但清熱涼血解毒方中劑量組和高劑量組比較無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肛周水腫程度評分和創面面積比較（±s）

表1 各組大鼠肛周水腫程度評分和創面面積比較（±s）

與空白對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與清熱涼血解毒方低劑量組比較，△P＜0.05。下同

組別空白對照組模型組清熱涼血解毒方低劑量組清熱涼血解毒方中劑量組清熱涼血解毒方高劑量組n 10 10 10 10 10水腫程度評分（分）0.15±0.03 2.31±0.37*1.86±0.34*#1.02±0.27*#△0.93±0.31*#△創面面積（cm2）0.11±0.02 3.12±0.43*2.11±0.38*#1.32±0.29*#△1.17±0.33*#△

2.2 各組大鼠肛周組織HE染色比較 見圖1。空白對照組肛周組織正常，細胞排列有序，細胞輪廓清晰、結構完整，無水。與空白對照組比較，模型組肛周組織間隙疏松水腫，鱗狀上皮大片狀壞死，固有層大量淤血，可見大量中性粒細胞浸潤，黏膜下層局部纖維斷裂，小靜脈擴張，有毛細血管增生。清熱涼血解毒方各劑量組間隙疏松水腫不明顯，少量鱗狀上皮壞死，少量中性粒細胞，毛細血管增生不明顯。

圖1 各組大鼠肛周組織病理學觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比較見表2。與空白對照組比較，模型組外周血TNF-α、IL-6和IL-8水平顯著升高，清熱涼血解毒方低、中、高劑量組外周血各指標顯著低于模型組，且清熱涼血解毒方中、高劑量組顯著低于清熱涼血解毒方低劑量組（P＜0.05）。但清熱涼血解毒方中劑量組和高劑量組比較無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比較（±s）

組別空白對照組模型組清熱涼血解毒方低劑量組清熱涼血解毒方中劑量組清熱涼血解毒方高劑量組n 10 10 10 10 10 TNF-α（ng/mL）28.17±3.91 211.41±14.62*153.47±12.67*#101.19±10.39*#△95.76±11.1*#△IL-6（pg/mL）13.65±1.86 99.65±10.07*72.34±8.12*#50.37±6.54*#△57.59±7.26*#△IL-8（pg/mL）11.47±2.12 123.51±9.67*80.62±8.35*#58.14±7.75*#△55.63±8.03*#△

2.4 各組大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比較 見表3，圖2。與空白對照組比較，模型組VEGF和PGE2水平顯著升高，清熱涼血解毒方各劑量組VEGF和PGE2水平顯著低于模型組，且清熱涼血解毒方中、高劑量組VEGF和PGE2顯著低于清熱涼血解毒方低劑量組（P＜0.05）。但清熱涼血解毒方中劑量組和高劑量組比較無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比較（IOD，±s）

表3 各組大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比較（IOD，±s）

組別空白對照組模型組清熱涼血解毒方低劑量組清熱涼血解毒方中劑量組清熱涼血解毒方高劑量組n 10 10 10 10 10 VEGF 0.25±0.04 1.73±0.14*1.01±0.12*#0.68±0.11*#△0.65±0.13*#△PGE2 0.31±0.07 1.96±0.16*1.12±0.13*#0.81±0.12*#△0.79±0.11*#△

圖2 各組大鼠肛周VEGF、PGE2蛋白免疫組化表達（DAB，40倍）

3 討 論

痔的發病主要有直腸海綿體學說、肛墊移位學說、竇狀靜脈擴張學說等，與飲食、生活、孕產、工作、年齡等因素密切相關[11-12]。痔易反復發作，藥物治療效果欠佳，嚴重影響生活質量，手術治療為最終選擇，但因肛周內外括約肌分布著豐富的神經，痛覺非常敏感，手術創傷、術后排便用力等會刺激肛門神經感受器，導致括約肌痙攣、收縮，局部循環障礙，肛緣血管滲透壓增加，引起肛門疼痛水腫，術后創面難以愈合[13]。痔術后局部組織損傷，升高的巨噬細胞參與炎癥反應，引起白細胞、淋巴細胞及TNF-α、IL-6和IL-8水平升高，激活更多炎癥介質的表達，加重癥反應，導致術后創面難以愈合[14]。術后創面愈合須經過創面滲出期、肉芽生長期和上皮細胞生長期，炎性滲出階段產生各種機體修復因子，加速肉芽生長。最強促血管生長因子VEGF，可通過內皮細胞有絲分裂原調控內皮細胞增殖，使肉芽組織加速生長，改善局部血流量，促進細胞增生和血管再生[15]。PGE2主要參與發熱、炎癥反應、疼痛感知等生理及病理生理過程，在炎癥反應各階段進行炎癥調控，對痔大鼠模型肛周潰瘍炎癥有明顯的抑制作用[16]。因此，本研究從VEGF和PGE2水平變化探討清熱涼血解毒方對大鼠痔術后創面愈合的作用機制。

痔病是中醫學中最早記載的疾病之一。濕熱蘊結，臟腑本虛，加之外感六淫、七情內傷等引起的臟腑失調是導致痔病的主要原因。患者局部受損，氣血阻滯，經絡不暢，感染邪毒，加之濕邪困阻，氣血瘀滯更甚，導致術后創面愈合緩慢[17]。中醫藥既可以促進創傷后組織修復，減輕組織炎癥反應，又可以減少毛細血管的通透性，從多環節、多靶點來發揮作用[18]。清熱涼血解毒方中黃連、黃柏、梔子清熱燥濕、瀉火解毒；生大黃瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒；苦參清熱燥濕、祛風殺蟲、瀉火解毒；地榆清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血、逐瘀斂瘡；白芍行氣止痛消腫；秦皮清熱燥濕、收澀止痢；白頭翁清熱解毒、涼血止痢；延胡索活血散瘀、理氣止痛；茵陳清熱利濕；紫草清熱解毒，涼血消腫。全方諸藥配合，共奏清熱涼血、燥濕解毒功效。清熱涼血解毒方對痔術后創面具有較好的治療作用，但其作用機制尚不明確。

本研究發現，清熱涼血解毒方各劑量組水腫程度評分和創面面積顯著低于模型組，說明本方可改善肛周組織病理結構。清熱涼血解毒方各劑量組TNF-α、IL-6、IL-8水平和VEGF、PGE2水平顯著低于模型組，且清熱涼血解毒方中、高劑量組明顯優于低劑量組。這些效果可能與以下作用有關：方中黃連抑制體內多種細菌，抵抗體內內毒素釋放；黃柏有抗真菌和病毒的作用，還可抑制中樞神經系統和細胞免疫反應；梔子內環烯醚萜類化合物可抗炎、抗氧化、利尿、解熱、鎮痛等，大黃酸、大黃素等通過游離蒽醌及其苷類調節TNF-α、血清淀粉酶等達到抗炎、抗菌抗病毒作用；苦參堿、槐果堿等發揮抗炎、抗病原微生物、降低毛細血管通透性等作用，并可促進血管新生，改善創面微循環；地榆有抗菌、免疫調節、抗炎消腫、修護受損皮膚等作用[19-22]。

綜上所述，清熱涼血解毒方可有效促進大鼠痔術后創面愈合，改善肛周組織，降低炎癥反應，其機制可能與降低VEGF和PGE2水平有關。