電項針干預對腦出血大鼠急性期腦組織中血紅素加氧酶-1表達及神經損傷的影響?

柳依江 沈詩彥 杜若桑 張曉輝 邵文娜 崔 海△

（1.首都醫科大學，北京 100069；2.浙江省杭州市杭州種福堂中醫醫院，浙江 杭州 310011）

腦出血是一種嚴重的，有著高死亡率和不良預后的卒中類型[1-4]。在我國，相比30年前的同類調查，腦出血流行狀況十分嚴峻，其患病率、發病率大幅上升，為患者及社會帶來沉重負擔[5]，其病理過程主要為血液在腦實質中快速蓄積，導致顱內壓增高、腦組織損傷[6]。腦出血致死的患者中，近半數出現在出血后2 d內[7]，其中，血腫源性毒性產物、氧化應激反應和促炎性反應在繼發性損傷過程中起到重要作用[8-11]。

血紅素加氧酶-1（HO-1）及其代謝產物的活性能對氧化損傷、細胞凋亡、細胞增殖等生物過程起關鍵作用[12-13]。已有研究表明，藥物激活HO-1活性能夠調節氧化應激反應，抑制水腫進展，減輕早期腦損傷，給予抑制劑組則損傷加重[14]。本實驗以HO-1表達為關注點，通過觀察腦出血急性期腦組織中含量變化，探討電項針干預對腦出血大鼠繼發性損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只SPF級雄性SD大鼠購自首都醫科大學實驗動物部，體質量（300±20）g。分籠飼養于首都醫科大學動物房屏障環境，光照周期為12 h模擬晝夜交替，溫度為（23±2）℃，自由飲水，SPF級飼料喂養，合格證號：SCXK（京）2016-0011。

1.2 試藥與儀器

鋅原卟啉-9（ZPP-Ⅸ）（美國 Frontier Scientific），qPCR試劑盒（美國KAPA Biosystems），逆轉錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。桌面數顯腦立體定位儀（深圳RWD Life Science），華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司），分析天平（德國Sartorius），高速冷凍離心機（Beckman公司），實時定量PCR儀（美國ABI），分光光度計（上海菁華科技有限公司），電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.3 分組與造模

實驗動物隨機分成5組，假手術組、模型組、電項針組、ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項針組。實驗采用自體血注入尾狀核形成血腫，制備自體血腦出血模型[15]。操作步驟：使用20%烏拉坦（7 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀上，頭部備皮，常規消毒后沿正中線切開約1 cm，確定前囟位置，根據大鼠腦定位圖譜確定右側尾狀核位置（前囟右3 mm，后0.2 mm）[16]，使用牙科鉆打孔（d=1 mm），深度至硬腦膜且不傷及腦實質。用1 mL注射器尾靜脈抽取約100 μL，轉移到100 μL微量注射器后固定在定位儀上。微量注射器垂直方向緩慢進針，深度為5.5 mm，以5 μL/min速度勻速泵入50 μL血液，注射后留針10 min，緩慢退針。骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚并消毒。ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項針組在造模后30 min腹腔注射ZPP-Ⅸ（質量濃度10 mg/mL，劑量10 mg/kg）。假手術組除不注入自體血外，其余操作同模型組。造模1 d后，使用Longa評分[17]對大鼠神經功能進行評價，評分大于1分可認為造模成功，則納入實驗，否則剔除。數量不足則根據隨機分配補齊并造模。

1.4 干預方法

根據《實驗針灸學》選擇供血（頸4夾脊穴）、風池給予電項針干預[18]。常規消毒后使用毫針進針3 mm，華佗電子針療儀正極接風池，負極接供血。選擇疏波，頻率1 Hz，留針30 min。電項針組和ZPP-Ⅸ電項針組造模后連續3 d給予干預，其他組不干預。

1.5 檢測指標

1.5.1 腦組織HO-1 mRNA測定 造模后第3天給予麻醉并斷頭取腦，保存于-80℃。選擇血腫周圍組織，取100 mg使用試劑盒提取樣本總RNA。檢索HO-1核苷酸序列設計引物。引物合成反轉錄成cDNA并進行擴增，進行 Real-time PCR 檢測，采用 2（-ΔΔCt）值進行數據統計。引物序列信息見表1。

表1 目的基因引物序列

1.5.2 神經功能缺損程度評分 使用Longa評分[17]對大鼠神經功能進行評價。0分：未見任何神經損傷癥狀。1分：病灶對側前肢或后肢不能伸直。2分：行走時偏向患側偏轉。3分：行走過程向患側傾倒不能站立。4分：不能行走且有意識障礙。

1.5.3 腦組織含水量測定 在相應時間點取材，將用于測量含水量的腦組織用分析天平秤質量，得到濕質量；置于烘箱內用60℃烘干48 h以上，多次稱量至質量不再減少，得到干質量。腦含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.6 統計學處理

應用GraphPad Prism7進行統計。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD分析，方差不齊時采用Dunnettt檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA含量比較

見表2。相較于假手術組，其他各組HO-1 mRNA表達均顯著增加，并且電項針組HO-1表達高于模型組（P＜0.01）。給予抑制劑后，ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項針組較假手術組HO-1均有增高，但組間差異不具有統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA的表達比較（2-ΔΔCt，±s）

表2 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA的表達比較（2-ΔΔCt，±s）

與假手術組比較，?P ＜0.05，??P ＜ 0.01；與模型組比較，△P＜ 0.05，△△P＜0.01。下同

組別HO-1 mRNA n假手術組模型組電項針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項針組0.578±0.099 1.618±0.328**2.805±0.357**△△1.103±0.220**1.345±0.229**6 6 6 6 6

2.2 各組大鼠腦含水量比較

見表3。造模1 d后大鼠腦含水量增高，在第3日腦含水量增高明顯。相較同時段假手術組，各組均有顯著統計學意義（P＜0.01）。1 d時電項針組腦組織含水量低于模型組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；在3 d時電項針組含水量增高，但仍低于模型組（P＜0.05）。在抑制劑干預兩組中，兩時間點ZPP-Ⅸ模型組腦組織含水量均高于ZPP-Ⅸ電項針組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦含水量比較（%，±s）

表3 各組大鼠腦含水量比較（%，±s）

與ZPP-Ⅸ模型組比較，#P＜0.05。下同

組別假手術組模型組電項針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項針組3 d 72.96±0.387 81.57±0.815*78.62±0.520*△82.32±0.738*79.78±0.252*#n3 3 3 3 3 1 d 72.85±0.652 78.01±0.510*77.73±0.854*78.49±0.366*78.29±0.291*#

2.3 各組大鼠神經功能缺損評分比較 見表4。造模后1 d對比假手術組，各組神經功能評分均明顯增高（P＜0.05），第3天神經功能評分較第1天有升高。對比ZPP-Ⅸ模型組，ZPP-Ⅸ電項針組神經功能評分改善（P＜0.05）。模型組與電項針組比較仍可見神經功能損傷改善趨勢（P＞0.05）。

表4 各組大鼠神經功能缺損程度評分比較（分，±s）

表4 各組大鼠神經功能缺損程度評分比較（分，±s）

組別假手術組模型組電項針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項針組n6 6 6 6 6 1 d 0.167±0.408 1.667±0.211*1.000±0.408*△2.000±0.258*1.167±0.167*#3 d 0.333±0.516 2.500±0.224 1.667±0.334 2.833±0.167 1.500±0.342#

3 討 論

中醫理論認為頭為諸陽之會，六陽經交接于頭部，督脈和足太陽經直接絡于腦，其他陽經與督脈交會于大椎穴，故通過刺激頸部穴位，激發陽氣達到活血化瘀的目的。實驗中選取的供血（頸4夾脊穴）、風池兩穴位于椎動脈上方，通過疏波刺激調節椎基底動脈、Willis環的血流，進而改善出血后腦功能。臨床上，給予電項針干預能夠通過改善血流供應、降低血液黏稠度、減緩急性期腦水腫發展等來治療腦出血，并對認知功能和運動功能損傷癥狀有明顯改善[19-22]。

HO-1是血紅素分解成一氧化碳、鐵和膽綠素過程中的限速酶，可以在血紅素、重金屬、生長因子、細胞因子等多種刺激物作用下高度上調。腦出血后，高濃度游離的血紅素能夠誘導HO-1表達增高，加速血紅素分解，減少自由基產生，減輕繼發性損傷。HO-1還可以保護內皮細胞防止凋亡，也可以調節血管緊張度，使血管松弛，減輕血管壁炎癥反應，同時還能夠參與血管生成[23-24]。有研究表明腦出血后，紅細胞溶解釋放血紅素，會消耗細胞內能量儲備、激活補體系統[25]，進而導致腦水腫、氧化應激反應、神經元死亡[26]。腦出血后高濃度的游離血紅素則促使HO-1表達升高，使血紅素分解減輕繼發性損傷。

臨床研究表明，腦出血后3 d內HO-1表達達到高峰，且與急性期損傷同步[27]，該過程與大鼠腦出血模型研究相一致[28]。有實驗發現，腦出血后血腫周圍組織HO-1表達升高同時，與TNF-α、IL-1β的表達呈負相關，能夠發揮抗炎作用[29]。戴曉紅等研究表明，給予腦出血大鼠頭針干預能夠上調病灶周圍HO-1表達，發揮其抗氧化作用，減輕損傷[30]。

本實驗中，與假手術組對比，各組HO-1表達均增高且差異具有統計學意義，電項針干預后HO-1表達較模型組增高。在給予ZPP-Ⅸ抑制劑的兩組中未見差異，說明電項針能夠通過提高HO-1水平來改善出血后損傷。通過腦含水量的測定表明，給予電項針干預的兩組均能夠抑制腦水腫的發展，并且作用途徑不僅限于HO-1通路。神經功能缺損程度評分，表明電項針干預能夠改善神經功能缺損，電項針與模型組對比雖然差異未見統計學意義，但可見評分降低，需進一步研究論證。

綜上，本實驗表明電項針可以提高HO-1表達，抑制腦水腫進展，減輕腦出血后繼發性損傷，并且能夠改善神經功能損傷，其具體機制需要進一步探究。