DAX－1基因突變導致先天性腎上腺發育不良的臨床分析

樊大貝，李志臻，張好好

（鄭州大學第一附屬醫院內分泌科，河南鄭州 450052）

X連鎖的先天性腎上腺發育不良（adrenal hypo plasia congenital，AHC）是一種罕見的X染色體隱性遺傳病，主要是由腎上腺功能不全引起，大多數為男性病例，只有極少數的女性病例，發病率在1∶140 000至1∶2 000 000，但是目前國內沒有確切的關于該疾病發病率的數據報道［1－2］。此類疾病患者通常會在嬰兒早期或者整個兒童時期表現出腎上腺功能不全的癥狀。一般情況下，該疾病的治療方法包括終身使用糖皮質激素和鹽皮質激素替代療法［3－4］。

許多AHC病例是由遺傳因素引起的，主要包括常染色體隱性遺傳或者X連鎖隱性遺傳。劑量敏感－性逆轉－腎上腺增生不良基因1（dosage sensitive sex－reversal，adrenal hypoplasia locus on the X－chro mosome，gene 1，DAX－1）位于X染色體上，含有兩個外顯子。DAX－1基因的特定突變，包括點突變和缺失突變會引發腎上腺發育不良，因此，DAX－1被認為是腎上腺發育的重要角色。DAX－1也是非典型孤兒核受體超家族的一員，與此同時，DAX－1作為主要的負調節劑與其他核受體相互作用［5］。目前已有超過200種DAX－1突變位點被報道，突變方式多樣，以片段缺失、移碼突變、無義突變和錯義突變為主。相關研究表明，DAX－1序列突變可以引起男女之間的性別反轉表型，也可以導致性腺機能減退，這凸顯了DAX－1基因在性別決定和性腺發育方面的關鍵作用［6－7］。目前對于AHC發病機制的相關科學認知上仍然表現不足，因此仍然無法實現有效的AHC藥物治療體系。本文主要通過搜集到鄭州大學第一附屬醫院就診的5歲男性AHC先證患者的家系，分析患者及家系成員臨床特征、基因型及二者之前的關系，以增加對AHC的認知，提高對AHC的診斷和治療水平。

1 資料與方法

1.1 研究對象2018年鄭州大學第一附屬醫院診斷為X連鎖先天性AHC的5歲先證者及家系成員。本研究經過鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會的批準并征得患兒父母的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1病歷資料收集 收集先證者及家系成員的發病年齡、臨床表現、體格檢查（包括皮膚和外生殖器）、家族史及既往病史、生長發育及治療情況。

1.2.2激素測定 采用化學免疫發光法檢測先證者促腎上腺皮質激素、腎素、皮質醇、醛固酮、睪酮、黃體生成素、卵泡刺激素。采用放射免疫法檢測患者17－羥孕酮。此外，通過超聲影像對先證者的腎上腺及性腺進行相關檢查。

1.2.3基因檢測 首先，采集先證者、父母及其家系成員的外周血約4 mL（管中預先已加入EDTA抗凝血），通過 QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，Germa ny）對血液基因組DNA進行提取，將提取后的DNA放于－20℃保存備用。

采用Premier Primer 5 0軟件設計DAX－1基因引物，送由上海生工生物進行合成。PCR反應體系為20 L，具體體系如下：基因組DNA 2 L、10反應緩沖液2 L、DNA聚合酶 0 3 L、dNTP 2 L、上游引物 0 5 L、下游引物0 5 L，其余用ddH2O補齊。PCR反應條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，共28個循環，最后一次循環后，72℃終延伸5 min，8℃冷卻保存。經過擴增后的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

進一步將DNA進行片段化并進行DNA建庫，通過對目標DNA序列進行捕獲后經過Illumina Hiseq高通量測序儀進行測序，其中測序讀長為2 150 bp。測序原始數據根據SamTool和Pindel軟件進行分析，并且與UCSC Genomics數據庫提供的人類基因組hg19參考序列進行比對，嚴格評估目標區域的覆蓋度及對應的測序質量。根據篩選標準對DAX－1序列變異進行過濾并且篩選出潛在的突變位點，通過Sanger測序驗證這些潛在的突變位點。

2 結果

2.1 先證者臨床資料先證者，男，5歲，因“自幼精神萎靡”為代訴于2018年5月27日就診于鄭州大學第一附屬醫院。該患者自出生被發現全身皮膚呈暗黑色，無明顯其他異常表現，系第一胎第一產，40周剖宮產，出生體質量為3 65 kg，患兒父母否認近親結婚及家族存在類似疾病史，患兒母親否認孕期有特殊用藥史及毒物接觸史。隨后在3個月大時出現體質量不增、嘔吐等現象，曾于鄭州市兒童醫院就診，經治療電解質正常后出院。入院前父母自述患者出現惡心、嘔吐現象。入院后查體：身長90 cm，體質量26 kg，體溫37 1℃，脈搏每分鐘153次，呼吸每分鐘38次，血壓75／36 mm Hg。患者意識清晰，精神萎靡，全身皮膚色素沉著，心、肺、腹及神經系統查體均未見明顯異常。外生殖器未見明顯畸形，陰囊皮膚色素沉著。電解質：鉀為 6 42 mmol· L－1，鈉為 116 5 mmol·L－1，氯為75 3 mmol·L－1。血氣分析：pH為 7 22，二氧化碳分壓值為 7 9 kPa，氧分壓值為 10 3 kPa，HCO3－值為17 8 mmol·L－1。激素水平檢測：促腎上腺皮質激素為759 3 ng·L－1，腎素活性為每小時 0 97 ng·mL－1，皮質醇為 25 6 g·L－1，醛固酮為 35 3 ng·L－1，硫酸脫氫表雄酮為 14 2 mg·L－1，睪酮為 3 39 g·L－1，孕酮為 0 31 g·L－1，17－羥孕酮為6 7 g·L－1。肝腎功能正常，甲狀腺功能正常，尿、便常規正常。彩超結果顯示：肝臟、胰腺、脾臟、腎臟、睪丸均未見異常。

2.2 基因結果該例先證者DAX－1基因檢測結果顯示，外顯子I存在突變：c 214G＞C，該突變未見文獻報道。其母親為該突變攜帶者，父親并未檢測到該突變，此突變為錯義突變，即導致DAX－1基因中編碼的第72位氨基酸發生改變，由天冬氨酸（D）突變成組氨酸（H）。使用PolyPhen－2進行蛋白質損傷分析以預測該突變位點對蛋白的影響，結果顯示該突變對蛋白功能會產生有害作用（圖1）。該基因突變最終導致編碼成無功能或者功能異常的DAX－1蛋白。

圖1 突變位點對蛋白質損傷預測

2.3 激素治療患者自入院后病情發展較不穩定，給予氫化可的松進行對癥治療，治療1個月后病情穩定，隨后進行復查檢測激素水平發現：促腎上腺皮質激素為368 3 ng·L－1，皮質醇為 16 7 g·L－1，醛固酮為35 3 ng·L－1，硫酸脫氫表雄酮為 103 2 g·L－1，睪酮為0 33 g·L－1，孕酮為 0 01 g·L－1，17－羥孕酮為0 6 g·L－1。電解質、血常規均正常，予以院外繼續口服氫化可的松（8 mg，每日3次）和氟氫可的松（早0 05 mg，晚0 05 mg）替代治療，3個月后復診，未再發現患者有復發的癥狀，生長發育良好。

3 討論

DAX－1基因主要在下丘腦－垂體－腎上腺－性腺中表達，因此其對于下丘腦、垂體、腎上腺和性腺的正常發育與功能起著十分重要的作用［8］。AHC臨床表現十分復雜，大多在嬰幼兒階段發病，且多伴有體質量變化、嘔吐、腹瀉、全身皮膚色素沉著等相關臨床表現。此外，也存在嚴重的高鉀、低鈉和酸中毒的現象。目前已經報道的DAX－1基因突變類型已經達到200多種，包括了移碼突變、片段缺失或重組、無義突變、錯義突變等，報道最多的是移碼突變或無義突變，導致DAX－1基因編碼區異常，影響蛋白編碼，但是DAX－1基因突變導致AHC引發的臨床表現機制尚不清楚［9－11］。因此，分子診斷技術的發展為通過基因檢測手段診斷AHC提供了新的可靠手段。通常情況下，患者早期臨床表現與醛固酮減少癥、21－羥化酶缺乏癥、Addison病臨床表現相似，因此容易被誤診。Wang等［12］報道發現8歲男孩因為腹瀉、嘔吐、皮膚色素沉著進行就診，經過檢測后發現高鉀、低鈉、促腎上腺皮質激素水平升高，17－羥孕酮正常，因此診斷為Addison病，直到12歲時因為患者性腺發育不良后重新就診，經過基因檢測診斷發現DAX－1基因突變，最終確診為AHC。本病例中的先證者為5歲男童，表現為全身皮膚色素沉著、惡心、嘔吐、體質量減輕等現象，而且促腎上腺皮質激素水平明顯提高，提示該患者存在腎上腺皮質功能不全，但是該臨床癥狀容易被誤診為其他疾病，因此需要采用嚴格的基因檢測。本研究中，該患兒DAX－1經過基因檢測后存在移碼突變，其父無此基因突變位點，其母為此基因突變攜帶者，因此綜合考慮判斷為X連鎖的AHC疾病。本研究提示，在臨床上，對于此類患者應當謹慎診斷，必要時需結合基因檢測確認疾病類型，避免誤診。該基因突變的發現可以進一步豐富人類基因突變數據庫，為AHC的分子診斷提供了新的基因突變位點。

AHC同樣也會表現為青春期前的腎上腺皮質功能不全現象，這會導致青春期過程的性腺發育不良和成年后的生精障礙［13］。本實驗的患者目前仍然處于青春期前，尚未合并性腺發育不良，因此不能夠準確評估未來生長發育過程中性腺發育情況。因此應提供后續的隨訪工作和干預治療，減輕患者及家庭由于疾病帶來的經濟、心理負擔。腎上腺皮質功能發育不全若不及時治療，會產生對應的并發癥，如低鈉、高鉀血癥、酸中毒等，嚴重時甚至會危及生命［14］。本實驗的患者就診后通過外源性的氫化可的松和氟氫可的松替代治療，病情得到逐步好轉。但是，眾所周知，糖皮質激素和鹽皮質激素替代療法是需要終身服用的。因此，后續的治療需要規律性的隨診復查并根據患者情況及時調整診療方案。

綜上，我們鑒定了1例由于DAX－1基因突變導致的AHC家系，并且利用外源性氫化可的松進行治療和干預。此外，DAX－1突變導致的臨床癥狀由于與其他疾病癥狀相似，容易被誤診。因此，當患者就診時，需要綜合考慮臨床癥狀，并且盡量盡早進行基因檢測以確定疾病類型。此外，要做到盡早治療、規律復查、合理調整治療方案等原則。