血管性認知功能障礙大鼠膽堿酯酶及膽堿乙酰化酶的表達

任家謀 高玉梅 吳昌學 李毅 王凡

(貴州醫科大學 1地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2貴州省醫學分子生物學重點實驗室；3貴陽市第四人民醫院；4貴州醫科大學附屬醫院神經外科)

血管性認知障礙(VCI)的定義最早由Hachinski和Bowler在1993年提出〔1〕。VCI是指由血管性危險因素相關的各種腦血管病引起的從輕度認知障礙到癡呆的臨床綜合征〔2〕。近年來，由血管性因素導致的癡呆及認知功能障礙的發病率逐年上升，嚴重影響了中老年人群的健康和生活質量，并且目前還未尋找到能有效治療VCI的藥物，所以研究 VCI 發生機制及人群易感因素對防治 VCI 及防止其發展為癡呆具有重要意義〔3〕。乙酰膽堿(Ach) 作為大腦組織中重要的一種神經遞質，是記憶形成的必需神經遞質和長期記憶的生理基礎，ACh 的作用機制是通過腦干網狀結構上行激動系統來維持大腦的覺醒狀態，Ach在大腦皮層及海馬的缺失將會引起空間認知和記憶障礙〔4〕，造成腦功能紊亂。VCI 時中樞膽堿能神經遞質受體及其功能可能受損，從而引起認知功能的損害。

為了更加明確地了解膽堿能系統及在VCI 發病機制中的作用，采用四血管閉塞法(4-VO) 建立實驗動物模型，以獲得輕度認知障礙的大鼠癡呆模型〔5〕，本文分析VCI大鼠大腦皮層膽堿能系統中乙酰膽堿酯酶(AChE)、膽堿乙酰化酶(ChAT)及其檢測相關mRNA的表達。

1 材料及方法

1.1材料 選用SD大鼠100只，8月齡，體重300～400 g，雌雄各半，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，EnVision二步法試劑盒購自Dako公司，二甲基聯苯胺(DAB)購自北京中杉金橋生物制劑有限公司，Trizol、鼠抗AChE、ChAT、β-actin單克隆抗體及普通化學試劑和辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠二抗購自美國Sigma公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學發光(ECL)試劑、高效顯影膠片購自Amersham公司，組織裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)試劑盒購于碧云天生物試劑公司，顯影液、定影液購于柯達公司，考馬斯亮藍蛋白定量測試盒購于南京建成公司。

1.2動物篩選 飼養1 w后的SD大鼠，將其進行Morris水迷宮定向航行實驗和空間探索實驗，根據實驗結果進行初步篩選，淘汰掉學習能力較強的(逃避潛伏期≤15 s)和學習能力極差的SD大鼠(逃避潛伏期≥60 s)，留下學習能力、記憶水平相當的SD大鼠72只，對其進行隨機分組：模型組與假手術組，在進一步對其進行細分為造模2 w組，1個月組和3個月組，每組12只。

1.3模型復制 將實驗大鼠用10%的水合氯醛，0.5 ml/100 g體重，腹腔麻醉。另在腹腔注射125 U肝素-生理鹽水/ml，100 U/100 g。將大鼠仰臥，頭頂部正中切開，將三棱針在中線旁和右冠狀縫后各1 mm處穿透至骨膜外，安不銹鋼電極接腦電地形圖儀負極。在背側頸部，正中切口，暴露雙側第一頸椎橫突翼小孔，用直徑為0.5 mm的電凝針，插入雙側翼小孔燒灼雙側椎動脈，造成永久性閉塞。翻轉動物成仰臥位，頸正中切開，氣管切開置管接小動物呼吸機控制呼吸。在鎖骨上緣附近，分離雙側頸總動脈，穿線備用放回籠中。24 h后用無創微動脈夾同時夾閉雙側頸總動脈5 min，造成持續的全腦缺血，松開動脈夾給予血液再灌注，間隔1 h，重復3次。然后縫合傷口，分籠飼養。假手術組只分離椎動脈和頸總動脈，不作凝閉和夾閉。

缺血模型的可靠性基于缺血動物體征表現，根據以下標準鑒定大鼠腦缺血模型：大鼠在缺血前完全清醒，生命體征正常，4-VO 法引起腦缺血后 30～60 s大鼠的知覺和活動能力即失去，痛覺消失，翻正反射消失，出現角弓反張，出現雙側瞳孔散大，眼球顏色由正常的鮮紅色變為灰白色，然后再灌注后大鼠眼球顏色即恢復為紅色，散大的瞳孔回縮，缺血5 min需再灌注約1 h后大鼠才能恢復自主活動。

1.4學習記憶能力測定 Morris水迷宮的行為測試在造模后2 w，1個月和3個月進行，以觀察游泳，定向導航和空間探索實驗的結果學習和記憶技能的變化。

1.5腦組織病理學檢查 取右側大腦半球正矢狀面(包括海馬)，10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋和切片，蘇木素-伊紅(HE)染色和尼氏染色(Olszwski焦油紫染色法)。

1.6AChE及ChAT活性測定 分別于造模2 w、1個月、3個月后股動脈取血，乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝，離心取血漿檢測；動物斷頭處死，冰盤上快速剖取海馬組織，按組織重量體積比為1∶9加預冷的生理鹽水制成10% 的組織勻漿；ChAT的測定以乙酰輔酶A和膽堿為底物，在ChAT的作用下，反應的生成物和顯色劑結合，在324 nm處測定吸光度，計算ChAT的活力。按試劑盒說明書進行血漿酶活力測定。設定在pH7.2條件下，37℃時每毫升血清每分鐘轉移1 μmol乙酰基給膽堿的能力定義為一個酶活力單位。AChE 酶活性測定：血液中 AChE 能使ACh水解成膽酸和乙酸，未被分解的剩余ACh與羥胺作用生成乙酰羥胺，再與鐵離子在酸性溶液中形成棕色復合物，在 520 nm處測定吸光度，按公式計算出酶的活力。實驗按試劑盒說明書進行。將每毫升血清在37℃和底物作用20 min，分解1 μmol乙酰膽堿為1個活力單位。

1.7AChE，ChAT的蛋白表達 采用Western印跡法檢測，將海馬組織在玻璃勻漿器中勻漿并加入預冰冷的5 ml緩沖液A(50 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、pH7.40，10% trixton-100)及苯甲基磺酰氟(PMSF)和復合蛋白酶抑制劑，在冰上制成腦組織勻漿并置于冰上1 h以充分裂解腦組織細胞，用含有蛋白酶抑制劑的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)制備細胞勻漿，并在4℃、12 000 r/min，離心40 min，棄去沉淀物，用考馬斯亮藍法對提取的上清液進行蛋白定量。用Western印跡法檢測假手術組和模型組AChE、ChAT蛋白表達，然后使用掃描儀掃描曝光膠片并用Bandscan軟件分析結果進一步探索VCI中膽堿能受體系統的兩種酶的變化趨勢，確定變化在臨床診斷和治療中的作用。

1.8統計學分析 運用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD對方差齊性做進一步的兩兩比較，DunnettT3對方差不齊做兩兩比較。

2 結 果

2.1行為學改變 造模后2 w,與假手術組比較，模型組毛色發黃、粗糙，活動及飲食減少。Morris水迷宮實驗平均逃避潛伏期稍有延長但無統計學差異(P>0.05)，空間探索試驗也無明顯差異。造模1個月后，與假手術組比較，模型組平均逃避潛伏期顯著延長(P<0.01)；平臺撤去后，將在原第Ⅳ象限平臺的活動時間作為指標，與假手術組比較，模型組首次穿越平臺所需時間明顯延長(P<0.01)，穿越站臺次數明顯減少(P<0.05)。假手術組游泳方式以繞平臺游泳和穿梭游泳為主，模型組以環池游泳和穿梭游泳為主，通過結果說明模型組明顯出現學習、記憶障礙。造模3個月后與假手術組比較，模型組平均逃避潛伏期仍顯著延長(P<0.01)；首次穿越平臺所需時間明顯延長及次數明顯減少(P<0.01，P<0.05)。模型組學習、記憶障礙持續發生，且無恢復的趨勢。見表1、表2。

組別造模2 w第1天第2天第3天第4天假手術組56.52±3.7441.73±15.1121.67±13.6117.58±10.23模型組55.55±6.3145.56±15.9331.84±18.2924.28±15.04組別造模1個月第1天第2天第3天第4天假手術組16.05±13.0211.65±11.939.73±4.958.50±5.45 模型組51.05±17.201)34.00±22.141)16.04±12.341)13.87±11.261)組別造模3個月第1天第2天第3天第4天假手術組39.29±22.8419.74±17.1717.86±14.9816.55±16.07模型組50.36±17.851)49.00±17.281)49.90±17.451)43.43±20.931)

與假手術組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；下表同

組別造模2 w大鼠第1次穿越平臺所需時間(s)平臺穿越次數(次)造模1個月大鼠第1次穿越平臺所需時間(s)平臺穿越次數(次)造模3個月大鼠第1次穿越平臺所需時間(s)平臺穿越次數(次)假手術組19.33±13.282.75±1.598.05±6.453.50±2.1214.58±13.793.18±2.11模型組21.47±6.482.58±0.5822.93±17.901)2.08±1.462)32.97±19.911)1.17±1.071)

2.2病理形態學改變 HE染色可見各時間段假手術組海馬各區細胞層次清楚，細胞排列整齊，形態清晰完整，CA2區錐體細胞排列規則、緊湊，形態完整，膠質細胞呈散在分布，未發現明顯神經元損傷；造模2 w模型組僅見神經元丟失；造模1個月模型組海馬CA2區錐體細胞帶不完整、排列紊亂，結構模糊，少數神經元呈片狀或點狀，嗜伊紅染色增強，似紅色神經元，細胞數目較假手術組無明顯減少；造模3個月模型組海馬CA2區錐體細胞排列紊亂，結構模糊，部分數神經元呈片狀或點狀，嗜伊紅染色增強，似紅色神經元(圖1)。尼氏染色顯示假手術組海馬各區錐體細胞胞質中布滿著深紫色呈顆粒狀的尼氏小體，著色較深而均勻一致；與假手術組相比，造模2 w模型組未見明顯變化，造模1個月與3個月模型組腦海馬錐體細胞胞質內尼氏體減少，染色減弱，部分錐體細胞胞質內尼氏體溶解，輪廓模糊、著色淺淡，造模3個月模型組較1個月改變更為明顯。見圖2。

2.3海馬組織 AChE、ChAT 蛋白表達 免疫組化檢測結果顯示，隨著造模時間的延長，AChE的表達逐漸增加，以海馬神經元胞質及突起為主要表達部位，強陽性表達的部位為CA4、CA3、CA2，CA1區陽性表達較弱，模型組與假手術組之間差異有統計學意義。隨著造模時間的延長，ChAT的表達逐漸降低，造模3個月模型組海馬神經元呈陰性，模型組與假手術組之間差異有統計學意義(圖3、表3、圖4)。

圖1 各組海馬CA2區病理變化(HE，×100)

圖2 各組海馬CA1區尼氏染色(×100)

圖3 各組腦海馬組織CA3區AChE表達(免疫組化，×100)

表3 各組海馬CA3區AChE、ChAT的積分光密度值

2.4海馬組織及血漿AChE及ChAT酶活性測定 造模2 w模型組血漿AChE活性出現降低趨勢，但與假手術組差異無顯著性，但隨著造模時間延長，降低程度更明顯；海馬組織中造模2 w模型組AChE活性升高，升高程度與造模時間呈正比。造模2 w模型組血漿ChAT活性即明顯升高，隨著造模時間延長，血漿ChAT活性升高，且隨著造模時間延長，升高程度更加明顯；而在海馬組織中ChAT活性的下降，下降程度與造模時間呈正比。見表4。

圖4 各組腦海馬組織CA3區ChAT表達(免疫組化，×100)

組別血漿AChE海馬AChE海馬ChAT血漿ChAT2 w假手術組30.21±2.9172.21±3.7129.13±1.8181.23±2.732 w模型組28.14±2.3278.31±3.811)27.21±3.711)95.23±2.832)1個月假手術組31.23±2.4075.21±5.7126.14±4.5180.24±3.421個月模型組21.34±1.801)88.23±7.611)20.32±2.911)96.03±5.621)3個月假手術組30.13±3.9080.12±8.3126.18±2.9185.12±6.423個月模型組19.21±1.501)91.13±9.411)19.29±2.911)97.13±7.821)

2.5AChE及ChAT蛋白表達水平 模型組海馬組織 AChE 蛋白水平顯著升高，且隨時間延長升高更為明顯。ChAT 蛋白水平明顯下降，且其下降趨勢隨時間的延長表現更加顯著，與假手術組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖5，表5。

圖5 各組海馬中AChE 及 ChAT 蛋白表達

表5 各組海馬組織AchE和ChAT蛋白表達

3 討 論

ACh是腦組織中重要的神經遞質，是由膽堿和乙酰輔酶A在ChAT的催化下生成，ACh在體內能夠迅速地被AChE降解，ACh是記憶形成的必需神經遞質和長期記憶的生理基礎，ACh 經突觸間隙與突觸后膜的膽堿能受體結合，發揮其生物學作用〔6〕。認知功能障礙患者的腦組織中 ChAT 及 AChE 活性的損害最終引起Ach合成、釋放、攝取等功能降低，引起大腦功能紊亂〔7〕。

VCI鼠在出現學習、記憶障礙，且出現相應的神經細胞損傷及尼氏小體的丟失，說明造模成功〔8，9〕。VCI患者血漿AChE 和ChAT活性的變化主要與梗死部位和容積有關。

VCI鼠海馬組織中的AChE 表達升高增加了Ach的降解，ChAT 表達下降導致其合成減少，從而影響了大鼠的學習和記憶能力；通過免疫組化檢測結果顯示，隨造模時間的延長AChE表達逐漸升高，海馬神經元胞質及突起為陽性表達的主要部位，其中陽性表達較強的部位為CA4、CA3、CA2區，CA1區陽性表達較弱，隨造模時間的延長ChAT表達逐漸降低。綜上，AChE 與 ChAT 的變化是血管因素引起的認知功能障礙中較早出現的特異性改變，與認知功能障礙的程度密切相關。