BRAFV600E基因突變與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理關(guān)系

李林平 柴芳 王俊 曲路 王宏志 林本瑞 劉克毅 霍建平 朱占勝 柴東奇 程鳴鳴

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院甲狀腺外科，遼寧 錦州 121001)

甲狀腺癌作為最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，而甲狀腺乳頭狀癌(PTC)已占甲狀腺癌85%～90%，成為主要病理類型〔1,2〕。甲狀腺癌的病因至今仍不明確，目前研究認為可能與遺傳〔3,4〕、放射線損傷〔5〕及碘攝入異常〔6,7〕等多因素有關(guān)。BRAFV600E基因突變證實與PTC的發(fā)生有關(guān)，突變率占25%～90%，已成為PTC良、惡性判斷的重要指標〔8～10〕。國內(nèi)外對于BRAFV600E基因突變是否與臨床病理學有聯(lián)系存在爭議〔11,12〕。本研究通過檢測PTC患者BRAFV600E基因突變情況，進一步探討其與臨床病理學的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年6月至2019年6月錦州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院115例PTC患者，術(shù)后均采用實時熒光PCR技術(shù)檢測組織BRAFV600E基因突變情況。患者年齡17～79〔平均(47.60±11.31)〕歲，根據(jù)2017年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)第8 版TNM分期對年齡以55歲作為分界，<55歲81例(70.43%)，≥55歲34例(29.57%)；男15例(13.04%)，女100例(86.96%)。納入標準：① 術(shù)后病理明確PTC；② 術(shù)后接受實時熒光PCR技術(shù)檢測組織BRAFV600E基因；③為初治病例，術(shù)前未行射頻消融、外照射、131I 治療、化療等其他輔助治療；④可追蹤到術(shù)后病理結(jié)果。排除標準：①臨床病理資料不完整者。②雙盲法復(fù)閱病理切片結(jié)果有爭議者或非PTC。

1.2研究方法 收集PTC患者資料：性別、年齡、癌灶直徑(多個癌灶取最大直徑)、癌灶個數(shù)、是否侵襲被膜、頸部淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、 TNM分期。術(shù)后病理石蠟切片明確診斷，石蠟切片厚度為4 μm，檢測BRAFV600E基因突變。研究中BRAFV600E基因突變陽性為實驗組，陰性為對照組。

1.3BRAF基因檢測 將收集到的原發(fā)灶及淋巴結(jié)石蠟切片先后進行脫蠟、脫苯、提純、DNA裂解及修復(fù);取45 μl 反應(yīng)混合液與0.6 μl Taq酶(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)混勻，滴入盛有DNA的EP管中，將EP管放入實時熒光定量基因擴增儀(PCR儀)中檢測。若突變檢測管的FAM信號擴增曲線呈S形曲線且Ct值<30，則為突變陽性。若擴增曲線不呈S形曲線或Ct值≥30，則為未突變。檢測過程及結(jié)果的判讀由同一經(jīng)驗豐富的醫(yī)師執(zhí)行。同時設(shè)立陽性及陰性對照。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗及χ2檢驗、多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1單因素分析 115例PTC 93例(80.87%，實驗組)組織發(fā)生BRAFV600E基因突變，有22例(19.13%，對照組)組織未發(fā)生BRAFV600E基因突變。BRAFV600E基因突變與性別、癌灶直徑、侵襲被膜、頸部淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P<0.05)。而年齡和癌灶個數(shù)與BRAFV600E基因突變無相關(guān)性。見表1。

2.2多因素分析 將患者性別、癌灶直徑、侵襲被膜、頸部淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及TNM 分期納入多因素Logistic回歸分析顯示，性別、癌灶直徑、侵襲被膜、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期是BRAFV600E基因突變的獨立危險因素。見表2。

表1 患者一般資料及病理資料比較(n)

表2 多因素Logistic回歸分析BRAFV600E基因突變的危險因素

3 討 論

BRAF已被證實是一種位于7p34的原癌基因，是RAF基因家族成員之一〔13〕。近些年隨著基因研究的深入，研究證實BRAF基因突變多發(fā)于甲狀腺癌組織，最多見的突變位點是7p34的原癌基因15外顯子1 799位點，該處的T被替代成A，導(dǎo)致編碼的蛋白產(chǎn)物發(fā)生改變，第600位本應(yīng)該是纈氨酸基因突變表達成了谷氨酸，致使基因介導(dǎo)的MAPK信號通路發(fā)生了異常，該突變多見于PTC〔11〕。BRAFV600E基因突變已被認為是導(dǎo)致PTC最重要的遺傳因素〔14〕和具有侵襲性的標志〔15〕。本研究女性PTC患者檢測出BRAFV600E基因突變率顯著高于男性PTC患者，與既往報道一致〔12,16〕。本研究結(jié)果與茹曉婷等〔17〕發(fā)現(xiàn) BRAFV600E基因突變與年齡無明顯相關(guān)性的研究結(jié)果一致。甲狀腺微小癌(直徑≤10 mm)占所有甲狀腺惡性腫瘤的6%～35%，本研究中BRAFV600E基因突變癌灶直徑>1 cm(非甲狀腺微小癌)的患者例數(shù)顯著高于未突變例數(shù)，BRAFV600E基因突變患者PTC腫瘤直徑平均值1.05 cm，而未突變腫瘤直徑平均值為0.61 cm，由此可見BRAFV600E基因突變腫瘤最大直徑較未突變明顯增大，與既往報道一致〔12,18〕。BRAFV600E基因發(fā)生突變后可通過提高下游激酶的活性進而使得MAPK信號通路被過度激活，從而促進PTC的發(fā)生發(fā)展過程〔19〕。本研究結(jié)果也提示BRAFV600E基因突變可能促進腫瘤的生長。

由Hu等〔20〕研究證實腫瘤抑制基因的異常甲基化導(dǎo)致甲狀腺腫瘤細胞的攻擊性增加，也與BRAF突變有關(guān)。Kurtulmus等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)BRAFV600E基因突變轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的直徑比BRAFV600E基因未突變增加了3 mm。Xing〔22〕研究報道BRAFV600E基因突變的PTC患者表現(xiàn)出更強的腺體外侵犯及更早的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，BRAFV600E基因突變與PTC患者癌癥相關(guān)性死亡率的顯著增加；與未突變組相比，每1 000人年的死亡數(shù)分別為11.80(95%CI,8.39～16.60) vs 2.25(95%CI,1.01～5.00)。本研究中發(fā)生BRAFV600E基因突變PTC患者侵襲被膜率、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及TNM分期均明顯高于未發(fā)生BRAFV600E基因突變，與既往研究一致〔23〕，考慮BRAFV600E基因突變參與了腫瘤的進展〔9,11〕及不良的預(yù)后〔24,25〕。

本研究存在一定的局限性：本研究是單中心回顧性研究，樣本量相對少，實驗結(jié)果仍需多中心前瞻性研究進一步證實；BRAFV600E基因突變具體致病分子機制需進一步探討。