遼寧地區稻谷糧堆真菌分布及演替規律的研究

王鵬杰 祁智慧 張海洋 田 琳 楊洪志 馬鵬飛 高瑀瓏 唐 芳

(南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心， 江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室1，南京 210023) (國家糧食和物資儲備局科學研究院，糧食儲運國家工程實驗室2，北京 100037) (中央儲備糧撫順直屬庫有限公司3，撫順 113004)

稻谷作為我國三大糧種之一，是我國重要的儲備糧種。稻谷儲藏期間，霉變是造成糧食損失的一個重要因素[1,2]。稻谷儲藏過程中，當儲藏條件適合真菌生長時，這些真菌就會分解和利用稻谷中的營養組分、破壞其質構，使其品質發生不同程度的劣變[3,4]，若不及時采取相應的控制措施就會導致糧堆發熱霉變。稻谷糧堆是一個復雜的生態環境，由于儲藏條件的限制，不同糧堆位置稻谷真菌生長及演替規律會存在差異，增加了稻谷的保質保鮮、儲存及倉儲管理的難度，因此研究稻谷糧堆不同位置霉菌生長演替規律及品質變化具有重要的現實意義。

為了探究稻谷儲藏過程中真菌的生長及其品質變化，國內外開展了一些相關研究工作。Christensen[5]將谷物攜帶真菌分為兩大類：田間真菌和儲藏真菌，并對儲藏稻谷的霉變進行了研究，結果表明儲藏期間生長的真菌主要為曲霉，尤其是灰綠曲霉屬，曲霉的生長會降低稻谷種子的萌發率并影響其食用品質風味等[6]。Magan等[7]研究確定了儲糧真菌的最低生長含水量及最適生長溫度，結果表明在不同溫度與濕度條件下，田間真菌和儲藏真菌之間存在競爭演替規律。唐芳等[8]研究了稻谷在30 ℃下不同含水量對儲藏真菌生長的影響，結果表明優勢危害真菌在灰綠曲霉和白曲霉，16%左右的儲糧含水量是這兩種曲霉優勢生長的轉折點，含水量高于16%后灰綠曲霉生長由強變弱，白曲霉生長由弱變強。周建新等[9]通過模擬儲藏，發現稻谷儲藏溫度越高、含水量越高，稻谷霉菌量增長越快，且曲霉是優勢菌；霉菌量低于104CFU/g時，稻谷處于安全儲存狀態。Genkawa等[10]研究了不同含水量的稻谷在儲藏過程中真菌生長情況、發芽率及脂肪酸值的變化，結果表明低含水量稻谷基本無真菌生長，發芽率在90%以上，脂肪酸值變化不大。由上述研究可知，儲藏溫度和含水量對稻谷儲藏過程中霉菌種類及生長有重要的影響。

上述研究結果多基于模擬儲藏實驗，儲藏條件相對穩定單一，而實際倉儲環境相對復雜，特別是我國糧食儲備體系，儲備倉型80%為高大平房倉，單倉體積均在千噸以上，大糧堆儲藏環境復雜多樣，而目前針對稻谷實倉大糧堆中不同空間位置的儲藏狀況的研究鮮有報道。本研究基于遼寧省撫順直屬庫，選擇我國普遍使用的高大平房倉，對糧堆中不同空間位置儲藏一年稻谷的霉菌區系分布、演替規律及其品質進行研究，旨在探明高大平房倉中不同空間位置對稻谷儲藏的影響，為我國東北地區稻谷優儲提供參考。

1 實驗材料及設備

1.1 實驗倉基本條件

本研究選用中央儲備糧遼寧省撫順直屬庫高大平房倉7號倉為實驗倉。糧堆體積的長、寬、高分別為59、23、6 m，倉容6 400 t，倉房配備有糧情檢測系統、機械通風和空調控溫等設施。所儲稻谷為當地2017年收獲的粳稻，2017年12月入庫，散糧儲藏。實驗倉采用空調控溫方式，2018年6月份啟動，倉溫超過22 ℃時自動啟動空調降溫。

1.2 實驗試劑

高鹽察氏瓊脂、察氏瓊脂、氯霉素、無水乙醇、氫氧化鉀。

1.3 主要儀器與設備

糧情監測系統；Panasonic MLS-3781L高壓蒸汽滅菌鍋；BMJ-250C霉菌培養箱；KS-2康氏振蕩器；HERAsafeKS12生物安全柜；DJSFM-1糧食水分測試磨；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱。

2 實驗方法

2.1 稻谷糧堆檢溫電纜布點方法

本研究選用中央儲備糧遼寧省撫順直屬庫高大平房7號倉儲藏一年的糧堆稻谷為研究對象，糧堆內共設置72個檢溫點，其中南北方向每組6個，兩點間隔4.4 m，兩端距墻0.5 m；東西方向每組12個，兩點間隔5 m，兩端距墻2 m；每點設置4層，糧堆檢測溫度布點層數及分布情況見圖1。

2.2 稻谷樣品采集方法

遼寧撫順直屬庫高大平房7號倉稻谷儲存一年后，基于糧情檢測系統溫度傳感器布點位置，選擇倉房的東南、東北、西南、西北四個角(1、6、67、72)和中心點(33)五個位點，分三層取樣，取樣深度與檢溫電纜分別在1、2、4層的位置重合，分別定義為上層、中層、下層，見圖1。遼寧撫順直屬庫高大平房7號倉全倉五點三層共15個取樣點，每點取樣200 g，采樣于無菌密封袋，并置于4 ℃冰箱低溫保存。

2.3 糧堆稻谷溫度檢測方法

糧堆稻谷溫度檢測方法，參考糧庫中測溫電纜檢測數據。

2.4 糧堆稻谷水分測定方法

糧堆稻谷水分檢測方法，參考GB/T 5497—85糧食、油料檢驗水分測定法105 ℃烘干法[11]。

2.5 糧堆稻谷菌落總數檢測方法

糧堆稻谷菌落總數檢測方法，參考GB/T4789.15—2003食品衛生微生物學檢驗 霉菌和酵母計數[12]。

2.6 糧堆稻谷霉菌分離純化鑒定方法

根據平板培養的結果，挑選平板中分布較多的菌株，標記，采用平板劃線分離法、三點法在察氏培養基上反復進行霉菌的分離純化，得到純化菌株。然后采用形態特征[13,14]與分子生物學技術[15]相結合進行菌種鑒定。

圖1 糧堆糧情檢測系統溫度傳感器分布及取樣分布圖

2.7 糧堆稻谷發芽率的測定

參考GB/T 5520—2011糧油檢驗籽粒發芽實驗[16]方法，發芽率用4組試樣結果的平均值來表示。

2.8 糧堆稻谷脂肪酸值的測定

糧堆稻谷脂肪酸值的測定參考GB/T 15684—2015谷物研磨制品脂肪酸值的測定[17]方法。

2.9 數據處理和分析方法

實驗數據處理通過SPSS軟件(version 22.0，SPSS Inc.)，實驗結果以(x±SD來表示，數據間的多重比較采用Duncan新復極差法(SSR)，P<0.05表示差異顯著。糧情布點分布圖由Microsoft Visio軟件處理獲得。

3 結果與討論

3.1 稻谷糧堆度夏期間溫度變化情況

依據2.2中樣品采集方法，提取遼寧撫順直屬庫高大平房7號倉稻谷對應五點三層的糧溫數據，五點三層8—9月單點平均溫度分布情況見圖2。

圖2 糧堆各采樣點8—9月平均糧溫情況

由圖2可知，8—9月，在倉內空調控溫低于22 ℃的情況下，糧堆上層(距離糧堆表面0.5 m處)五個點的溫度均能達到20 ℃左右；糧堆中層(距離糧堆表面2.2 m處)5個點的溫度差異較大，因糧倉的四角溫度受外界環境熱輻射影響，所以明顯高于中心點溫度(P<0.05)，特別是西南角(67號點)8月平均溫度達到24 ℃，而33號中心點溫度保持在5 ℃以下，下層溫度也有類似中層溫度的規律。由此可見，倉房墻壁的保溫隔熱效果對四壁邊緣稻谷溫度影響非常大，至少可影響到距離墻壁2 m位置，是大糧堆出現冷心熱皮的原因之一。以糧堆采樣點作變異源，對糧溫作方差分析。因素“糧堆采樣點”F=71.4，由于實得F > F0.01(14，120)=2.4，表明糧堆各采樣點糧溫差異極顯著，說明糧堆采樣位置對糧堆溫度有顯著影響。

從糧堆5月至10月整個度夏期間糧溫變化情況分析，糧堆的上層溫度均高于中層和下層，7月中旬前糧堆下層溫度高于中層，7月中旬后中層溫度高于下層。北方高大平房倉冬季時通常要進行通風均溫，使整倉平均溫度降至-10～-5 ℃，此時糧堆溫度上層<中層<下層。春季隨著外界環境溫度的逐步升高，上層稻谷糧溫受倉溫影響升溫速度較快，所以上層溫度變為最高。由于稻谷糧粒導熱性較差[18]和冬季蓄冷作用，中層溫度一直處于較低水平，仍低于糧堆下層溫度。進入夏季后，上層糧堆熱量緩慢向下傳導，使得中層(2.2 m)糧溫逐漸升高，因此7月中旬之后糧堆中層溫度逐漸高于下層，即倉溫的熱量經過長時間的傳導作用，至少可影響到糧面以下2 m位置。本研究的糧堆不同深度溫度變化規律與李志民等[19]報道的高大平房倉糧堆溫度變化規律基本一致。

3.2 糧堆各采樣點稻谷含水量分布情況

按照2.3方法測定遼寧撫順直屬庫高大平房7號倉初入庫稻谷含水量及儲存一年后各采樣點稻谷樣品含水量。初入庫稻谷經過通風處理后，含水量基本均衡在14.5%。儲藏一年后糧堆五點三層每個位點的平均含水量分布規律基本為上層>中層>下層。從平面位置分析，中心點33號點含水量最高，糧倉靠近東面墻的兩點(1點、6點)含水量居中，靠近西面墻兩點(67點、72點)最低。以糧堆采樣點作變異源，對糧堆含水量作方差分析。因素“糧堆采樣點”F=362.0，由于實得F>F0.01(14，15)=3.7，表明糧堆各采樣點含水量差異極顯著，說明糧堆不同采樣位置對稻谷含水量有顯著影響。如3.1所指，北方糧倉冬季會選擇合適時機進行壓入式通風以達到糧倉均溫的目的，通風過程中會帶走糧食的部分水分，特別是糧堆下層由于持續受上行空氣的影響，最終導致下層糧食含水量較低[20]。同時，由于受夕曬影響，糧倉西面墻夏季溫度最高，糧堆存在霉變風險，靠近西面墻位置稻谷含水量通常要低于整倉稻谷的平均含水量，這可以在稻谷入倉時通過控制其含水量，或通過優化風道布置加強通風，以降低西面墻附近糧食含水量，以確保稻谷儲藏安全。

3.3 稻谷糧堆真菌分布及演替規律

3.3.1 糧堆不同深度真菌分布及演替規律

按照2.5和2.6方法，對遼寧撫順直屬庫高大平房7號倉初入庫稻谷樣品及儲存一年后五點三層的稻谷樣品進行了真菌分離、純化與鑒定，并記錄不同真菌的數量。本研究共分離出15種真菌，其中4種真菌數量極少，總數占比不到1%，對稻谷儲藏影響較小，其余11種真菌，單個種類占比均大于3%，作為后續分析的重點。樣品分離的主要優勢菌有層出鐮刀鐮孢霉(Fusariumproliferatum)、鏈格孢霉(Alternariaalternara)、芽枝狀枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)、灰綠曲霉(Aspergullusglaucus)和多育曲霉(Aspergullusproliferans)，對優勢菌按照文獻[21]進行分類，層出鐮刀鐮孢霉和鏈格孢霉為田間真菌，芽枝狀枝孢霉為過渡真菌，灰綠曲霉和多育曲霉為儲藏真菌，此分類結果為后續真菌演替規律分析提供依據。

3.3.1.1 初入庫糧堆真菌分布

初入庫稻谷樣品經平板菌落分離純化培養后，真菌總量為5.3×103CFU/g，其中田間真菌鏈格孢霉占比40.2%，過渡真菌芽枝狀枝孢霉占57.9%。此時稻谷攜帶的主要是田間真菌和過渡真菌，未檢出儲藏真菌。

3.3.1.2 儲藏一年糧堆上層真菌分布

對稻谷糧堆上層各點樣品中分離出的主要真菌種類及比例分布情況進行了分析，結果見圖3。

圖3 稻谷糧堆上層真菌種類分布及比例情況

由圖3可知，上層五點除33號點外，優勢菌均為田間真菌，主要為層出鐮刀鐮孢霉，而33號點優勢菌為儲藏真菌，占比高達83.0%，主要為灰綠曲霉。結合各點溫度和含水量分析優勢菌的差異。糧食收獲期間主要攜帶田間真菌，進入倉儲環節后，所攜帶的田間真菌會隨著倉儲條件和糧食含水量的變化而變化。上層五點夏季平均糧溫均在20 ℃左右，33號點含水量最高15.5%，灰綠曲霉所占比例最多，此點滿足儲藏真菌的生長條件，而一旦儲藏真菌生長，就會破壞原有田間真菌的平衡，導致田間真菌數量和比例降低。其余各點含水量在14.2%～14.9%之間，除72號點(含水量14.2%)未檢測出灰綠曲霉，其它四點均檢出，且含水量越高，灰綠曲霉比例越高，原始攜帶的田間真菌比例越低，含水量是灰綠曲霉孢子萌發生長的一個誘因。

稻谷儲藏過程中，生長和收獲期間攜帶的田間真菌，在未受到其他菌屬競爭生長抑制的情況下，會以孢子形式處于休眠狀態以保留活性。當糧食含水量或溫度升高，一旦儲藏真菌生長，會破壞原有的微生物種群平衡，田間真菌數量和比例會降低。

3.3.1.3 儲藏一年糧堆中層真菌分布

對稻谷糧堆中層各點樣品中分離出的主要真菌種類及比例分布情況進行了分析，結果見圖4。

圖4 稻谷糧堆中層真菌種類分布及比例情況

由圖4可知，糧堆中層五個點優勢菌基本為田間真菌，主要為層出鐮刀鐮孢霉和鏈格孢霉，占比在49.7% ～ 75.6%。各點均不同程度檢出過渡真菌，33號點過渡真菌的芽枝狀枝孢霉占比達50.3%。西南角的67號點檢測出一定比例灰綠曲霉生長，該點在8月份持續24.5 ～ 27.5 ℃的高溫，平均溫度達26 ℃，夏季持續高溫是糧堆稻谷中灰綠曲霉孢子萌發生長的誘因，不過數量處于8×102CFU/g的數量級，不會對糧食造成危害。由此可見，溫度是誘發儲藏真菌孢子萌發的另一重要因素。

3.3.1.4 儲藏一年糧堆下層真菌分布

本研究對稻谷糧堆下層各點樣品中分離出的主要真菌種類及比例分布情況進行了分析，結果見圖5所示。

圖5 稻谷糧倉糧堆稻谷下層不同真菌種類及比例情況

由圖5可知，糧堆下層五個點優勢菌均為田間真菌，除6號點外，各點田間真菌占比基本在80%以上。糧堆下層在度夏期間，除西面墻附近溫度達到10 ℃以上，其它位點平均溫度均在10 ℃以下，中心點位置的平均溫度甚至低于5 ℃。糧堆下層總體處于低溫、低含水量狀況，儲藏條件較好，儲藏真菌生長極少，對下層儲藏微環境破壞小，有利于田間真菌孢子活性的保存[22]，這是該層有較高比例的田間真菌的主要原因。

3.3.1.5 儲藏一年糧堆不同深度真菌分布及演替規律

將稻谷糧堆上、中、下三層，每層5點稻谷樣品分離的真菌進行合并，并以層為單位分析真菌類群及比例關系，結果見圖6。

圖6 稻谷糧堆的上層、中層和下層三層不同真菌種類及比例情況

由圖6可看出，稻谷糧堆儲藏真菌比例分布規律為上層>中層>下層，而田間真菌分布規律為下層>中層>上層，過渡真菌比例分布規律是中層>下層>上層。北方地區糧堆不同深度的儲藏環境條件對稻谷真菌分布及演替規律有重要影響。糧堆上層溫度高，含水量相對偏高，儲藏真菌生長成為優勢菌，替代了部分田間真菌；糧堆中層、下層溫度和含水量相對低，不適合儲藏真菌生長，而適合田間真菌孢子保持活性，因而田間真菌為優勢菌。

綜上所述，糧食儲藏過程中，糧食原有攜帶的田間真菌若演替為儲藏真菌，表明糧堆環境可能出現過高溫或高含水量的情況，優勢菌的演替在一定程度上返過來可以表征糧堆微環境的變化。

3.3.2 糧倉糧堆稻谷不同位點真菌總數分布情況

對稻谷糧堆不同位點分離出的真菌種類及數量進行了分析，結合稻谷糧堆不同位點的溫度和含水量條件，研究稻谷儲藏過程中的真菌分布情況，結果見圖7。

圖7 稻谷糧堆各位點真菌總數分布

由圖7可知，各位點真菌數量均在103CFU/g數量級以內，處于正常帶菌量水平，但各點之間真菌總數存在差異。以糧堆采樣點作變異源，對糧堆稻谷帶菌量作方差分析。因素“糧堆采樣點”F=30.2，由于實得F> F0.01(14，30)=2.7，表明糧堆各采樣點真菌量差異極顯著，說明糧堆采樣位置對稻谷帶菌量有顯著影響。33號中心點稻谷真菌量相對較高，中層真菌總量達到6.0×103CFU/g，該點含水量為14.7%，度夏時，該點平均溫度低于5 ℃，優勢菌為田間真菌和過渡真菌，沒有儲藏真菌的生長，高含水量和低溫環境是田間真菌和過渡真菌孢子保持活性的重要原因，而對于田間真菌和過渡真菌，糧食含水量低于18% ～ 20%時孢子不會萌發生長，不會對稻谷造成嚴重危害[21]，33號點上層由于儲藏真菌的生長，破壞了田間真菌保存活性的環境，原攜帶的田間真菌數量大幅降低，因此上層真菌總數大幅降低，有80%為儲藏真菌。西北角72號點和西南角67號點稻谷真菌量相對較少，結合這兩點的含水量、溫度和真菌種類綜合分析可知，一方面由于低含水量、高溫不利于田間真菌保持孢子活性，另一方面通過降低高溫區域糧食含水量可有效抑制儲藏真菌生長，降低了儲糧風險。從真菌總數分析，由于北方地區高溫季節相對較短，并且采用空調控溫，稻谷在儲藏過程中雖有儲藏真菌生長，但其總數處于103CFU/g數量級以內，不會對糧食造成危害。

3.4 稻谷糧堆各位點儲藏品質的變化

3.4.1 初入庫稻谷品質

發芽率和脂肪酸值是研究稻谷儲藏品質的兩個重要指標[17,23]。稻谷發芽率易受儲藏溫度、稻谷水分和微生物生長的影響[24]。發芽率越高，稻谷儲藏品質越好。稻谷的脂肪酸值受其品種影響較小，脂肪酸值是稻谷儲存品質判定的重要指標之一[25]。稻谷在儲藏過程中，脂肪酸值會發生變化，因為稻谷中的三酰甘油酯和磷脂中的脂肪酸在脂肪酶和磷脂酶的作用下釋放出來[26]。在本研究中，初入庫稻谷樣品發芽率為98%，脂肪酸值為13.4 mgKOH/100 g，處于較低水平。

3.4.2 儲藏一年后糧堆不同深度對發芽率的影響

本研究以稻谷的發芽率來分析糧倉各個位點對儲藏一年后稻谷儲藏品質的影響。糧堆不同位點稻谷儲藏一年后的發芽率結果見圖8。

圖8 糧堆各位點脂肪酸值情況

由圖8可知，實驗倉中稻谷儲藏一年后品質保持較好，發芽率基本在90%以上(P<0.05)，與初入庫時相比降低幅度較小。5個位點不同深度的稻谷發芽率均呈現同一趨勢，即上層<中層<下層，結合各位點不同深度的溫度和含水量條件，夏季稻谷糧堆平均溫度上層>中層>下層，糧堆含水量上層>中層>下層，糧倉稻谷的發芽率與溫度和含水量均呈負相關，溫度和含水量越高，發芽率越低。稻谷真菌檢出量不高，每個位點稻谷帶菌量均處于103CFU/g數量級，基本不會影響發芽率。

3.4.3 儲藏一年后稻谷糧堆不同深度對脂肪酸值的影響

本研究糧堆不同位點稻谷儲藏一年后的脂肪酸值結果見圖9。

圖9 糧堆各位點脂肪酸值情況

由圖9可知，實驗倉中稻谷儲藏一年后除幾個高溫點外，其余位點的脂肪酸值均低于25 mgKOH/100 g(P<0.05)，與初入庫時相比上升幅度較小，儲存品質保持較好。五個位點不同深度的稻谷脂肪酸值基本呈現同一趨勢，即上層>中層>下層，稻谷脂肪酸值會隨著儲藏溫度的升高而逐漸增高[27,28,29]。72號點和67號點靠近糧庫西面墻，在度夏期間，其受夕曬影響，溫度較高，因此脂肪酸值上升較高。當糧堆上層溫度高于22 ℃時，糧倉啟動空調控溫，防止糧溫在夏季期間過度升高，將稻谷脂肪酸值控制在25 mgKOH/100 g以下，有效保證了稻谷儲存品質。

3.5 結論

遼寧撫順直屬庫高大平房7號倉稻谷儲藏一年后，稻谷糧堆不同位置溫度和含水量的變化，對糧堆微生物區系及變化有較大的影響。初入庫稻谷真菌主要為田間真菌鏈格孢霉和過渡真菌芽枝狀枝孢霉。儲藏一年后，糧堆中層及下層優勢菌為田間真菌，主要為層出鐮刀鏈孢霉和鏈格孢霉，所占比例超過60%，因為稻谷含水量為14.5%、溫度為10 ℃以下的儲存條件有利于田間真菌孢子活性的保持，不會影響儲糧的安全；糧堆上層優勢菌為儲藏真菌，主要為灰綠曲霉，所占比例大于50%，因為上層稻谷夏季溫度達到20 ℃左右，有利于儲藏真菌的生長，儲藏真菌對原攜帶的田間真菌存在著競爭抑制作用，當儲藏真菌占優勢時，表明儲藏環境溫度發生了變化，持續高溫可能會對儲藏稻谷造成潛在危害。入庫含水量14.5%左右的稻谷，采用空調控制糧倉溫度在不高于22 ℃的情況下，經過1年儲存，稻谷儲存狀況良好，發芽率基本可以保持在90%左右，脂肪酸值基本低于25 mgKOH/100 g。

本研究對高大平房倉中儲藏稻谷糧堆不同位置真菌生長演替規律及其品質變化進行了探索，為儲藏稻谷的精準防霉和控霉提供了參考。