北方儲藏稻谷真菌多樣性分析

祁智慧 張海洋 田 琳 王鵬杰 唐 芳 丁 軻

(北京農學院1，北京 102206) (國家糧食和物資儲備局科學研究院2，北京 100037 )

我國稻谷的產量約占糧食總產量的三分之一[1]，作為主要糧食作物，稻谷的儲藏安全與人們的生活息息相關[1]。北方地區因其獨特的生態氣候條件，是我國優質粳稻的主產區和主要儲存區。稻谷儲藏時糧堆是一個復雜的生態系統，而北方地區糧庫冬夏兩季的環境溫差極大，會導致糧堆內外溫差加大，局部糧堆易出現霉變發熱的問題[2]，影響稻谷的儲存安全。因此，針對北方糧倉儲藏稻谷研究真菌的多樣性，分析儲藏環境對真菌分布的影響，通過監測分析真菌變化情況，用以指導北方稻谷儲藏。

儲藏稻谷的真菌種類數量與其產區地理位置、收獲季節、氣候條件或儲藏方式有關[3]。早在20世紀80年代初，研究者曾對我國主要糧食，包括小麥、稻谷、玉米等的微生物多樣性做了初步的調查[4-6]，后來也有學者針對個別省份的稻谷真菌區系或多樣性進行研究[7-8]。隨著研究的不斷深入，研究重點逐漸轉向儲藏條件對真菌的影響。田國軍等[9]發現在不同儲藏條件下由于上層稻谷受環境影響較大，其霉菌總數波動大于中、下層稻谷。周建新等[10]證實了稻谷儲藏過程中的微生物區系演替與儲藏溫度和水分有關，并指出稻谷發生霉變的優勢菌大多是曲霉，如白曲霉、米曲霉和黃曲霉。這些真菌區系及多樣性的研究中，真菌的分離鑒定多以形態特征鑒定為主，部分菌種的鑒定可能存在不準確或不確定性，有必要采用現代分子生物學技術輔以形態學對稻谷儲藏真菌多樣性進行深入研究。

本研究選擇北方地區有代表性的高大平房倉儲藏的稻谷為研究對象，通過傳統的真菌形態特征鑒定與現代分子生物學技術相結合將儲藏稻谷中分離出的真菌基本鑒定到種。基于準確的真菌鑒定結果，結合實際倉儲儲藏條件的變化，對真菌多樣性、真菌類型以及儲藏條件進行分析，試圖找出指示北方稻谷儲藏條件變化的主要優勢菌群及倉房重點關注位置，為北方倉儲過程監控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

參考2017年中國農業年鑒，依據糧食產量在北方地區采集稻谷樣品。東北地區選擇黑龍江、吉林、遼寧，華北地區選擇北京，西北地區選擇寧夏。每個省選擇1個稻谷產量較高地區的糧庫，抽取1～2個具有代表性的高大平方倉，選擇儲存一年的稻谷倉進行取樣。

每倉5點3層取樣，每點取200 g樣品，取樣點為糧倉的四個角加中間。3層的垂直分布為：上層(距離糧堆表面0.5 m左右)、中層(距糧面2～3 m左右)、底層(距離糧倉地面0.5 m左右)，取樣后將上、中、下層3層樣品按層分別混合。

1.2 方法

1.2.1 菌落計數、分離及純化

采用高鹽察氏(High-salt CA)和察氏(CA)2種培養基同時對樣品進行平板菌落計數和純化，具體操作步驟參考GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》，每份樣品3個平行。計數時將不同表觀形態特征的菌落分別標號，不同編號的菌株單獨進行計數，挑取單菌落邊緣菌絲轉接3～4次，純化不同編號真菌獲得純種菌株。樣品前處理過程為稱取25 g稻谷樣品至盛有225 mL無菌水的錐形瓶中，在振蕩器上振蕩30 min，充分洗滌后，制備10倍系列稀釋的樣品勻液，選擇2個適宜的稀釋梯度進行接種。

1.2.2 真菌的表觀及顯微形態特征鑒定

表觀形態特征鑒定采用三點接種法(或單點接種法)在高鹽察氏培養(或察氏培養基)上接種，并置于(28±1)℃恒溫培養箱中培養7 d，觀察菌落特征并拍照，將相同特征的真菌歸為一類進行保藏。微觀形態特征鑒定采用斜插蓋玻片培養的方法，使菌絲沿著蓋玻片一側往上生長，培養5 d后取出蓋玻片，滴加乳酸—甘油固定液，在10×63倍的顯微鏡下觀察拍照。菌種表觀及顯微形態特征的鑒定參照 GB/T 4789.16—2003《食品衛生微生物學檢驗常見產毒霉菌的鑒定》、GB/T 26628.1—2011《糧油檢驗儲糧真菌標準圖譜》、《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》等資料。

1.2.3 真菌的分子生物學鑒定

采用液氮研磨和DNA提取試劑盒提取真菌DNA, 提取DNA后進行PCR擴增，擴增所用引物為 ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)以及bT2a (5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′)和bT2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)[11,12]。用PCR提純試劑盒對 PCR 產物進行純化，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測有正確條帶后進行測序。測序成功后用 BioEdit 軟件去除多余序列，保留波峰較整齊部分的序列，進行拼接后得到ITS和β-微管蛋白基因序列，將得到的序列分別與GeneBank數據庫中的序列進行BLAST同源序列比對，確定分離菌株的菌種信息。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定、系統發育樹構建及真菌分類

對高鹽察氏和察氏培養基分離出的所有表觀形態特征略有差異的322株分離菌株進行分子生物學鑒定。結合ITS和β-微管蛋白基因序列比對的同源序列結果以及真菌的形態特征，將分離出的菌株初步確定種屬名稱?；贗TS序列，采用最大似然法(Maximum likelihood)將所有分離菌種構建系統發育樹，對分離菌種的種屬進一步確認，并對所有真菌進行分類分析。

由圖1可知，北方地區儲藏期稻谷共分離出真菌58種，分布在2門，4綱，6目，13科，16屬。屬水平分別為鏈格孢屬Alternaria、彎孢屬Curvularia、毛霉屬Mucor、橫梗霉屬Lichtheimia、共頭霉屬Syncephalastrum、根毛霉屬Rhizomucor、附球菌屬Epicoccum、亞隔孢殼屬Didymella、枝孢屬Cladosporium、Gibellulopsis屬、帚枝霉屬Sarocladium、 木霉屬Trichoderma、鐮刀菌屬Fusarium、 藍狀菌屬Talaromyces、青霉屬Penicillium和曲霉屬Aspergillus，其中曲霉屬真菌種類最多為24種，青霉屬和鐮刀菌屬次之，分別為9種和7種。分離獲得的菌種以散囊菌目Eurotiales成員為最多，共計34種，分布在藍狀菌屬Talaromyces、青霉屬Penicillium和曲霉屬Aspergillus。非散囊菌目的其他菌種在系統樹上排布較為分散，分屬于5目，11科， 13屬。

通過系統發育樹可以看出，北方地區儲藏稻谷分離出的真菌種類較多。部分類群的ITS序列存在著極高的相似性，在種的劃分上很多分支自展支持率小于50%，特別是鏈格孢屬Alternaria、曲霉屬Aspergillus和青霉屬Penicillium真菌，表明ITS序列對真菌種水平上的鑒別能力不足，通過ITS測序僅可以將北方儲藏稻谷分離出的大部分真菌鑒定到屬，很少部分鑒定到種。因此對稻谷真菌多樣性進行深入分析時，應結合形態學特征并補充其他特征引物條碼進行分析。本研究對于ITS未確定到種的菌株，補測了β-微管蛋白基因的序列。β-微管蛋白是真核生物細胞內細胞器微管的成分之一，構成細胞內骨架結構，通過β-微管蛋白編碼基因序列分析，大部分情況下可進一步將屬水平或屬內復合群水平的真菌進一步的鑒定到種[13]。綜合分析ITS和β-微管蛋白基因序列比對的同源序列結果及真菌形態特征，將322株分離菌株，確認為58種真菌，55種真菌鑒定到種水平，有3株真菌未確定到種，但可以確認分別為附球菌屬Epicoccum、鐮刀菌屬Fusarium和曲霉屬Aspergillus的物種。

注：分支下面數據表示該分支以bootstrap進行檢驗，1 000次重復獲得50%以上的自展支持率。圖1 北方儲藏稻谷真菌基于ITS構建的ML系統發育樹及真菌分類

不同種類的真菌對于環境的適應性不同，對于倉儲稻谷的潛在危害性也不同。針對這一點，國外學者通過系統研究，結合糧食收獲和儲藏環節，根據真菌生長適宜的水活度范圍對糧食真菌進行了劃分[14]，如圖2所示。

圖2 基于真菌生長適宜水活度范圍的真菌分類[14]

由圖2可看出，糧食真菌主要分為3種類型：1)田間真菌，親水型植物病原真菌，糧食作物生長或收獲期侵染糧食籽粒；2)過渡真菌，對水活度要求相對寬泛，以腐生和嗜熱真菌為主，收獲前后污染谷穗和破碎顆?；蚴軅闹仓辏?)儲藏真菌，嗜旱真菌，對水活度要求相對低，主要在糧食儲藏期間侵染糧粒[15]。本研究根據Mannaa等[14]和Fleurat-Lessard[15]對糧食真菌3種類型的總結，初步將北方地區儲藏稻谷分離到的全部真菌進行劃分。因基于ITS序列構建的系統發育樹可以表征不同菌株之間親緣關系的遠近[16]，這里對文獻中未提及的部分真菌物種，根據其在系統發育樹上親緣關系相近的物種進行聚類劃分，并對3種類型進行標注，具體分類標注情況見圖1。同一類型真菌在系統發育樹上基本聚在一起，這是由于糧食真菌對于水分和溫度的要求由其特征基因編碼決定的[17]。通過本研究將我國北方倉儲稻谷中分離出的真菌進行全面準確的鑒定，并進行了分類，為北方稻谷儲藏狀況分析提供借鑒。

2.2 北方儲藏稻谷真菌菌落數及菌種豐度

糧食儲藏期間，侵染糧食的真菌以耐旱的儲藏真菌為主，從系統發育樹上看，大部分真菌屬于曲霉屬。曲霉菌屬的部分成員(在之前的命名法中屬于散囊屬Eurotium的真菌)極易污染各種低水活度的生物基質，特別是谷物及其制品[18-20]?！吨袊婢尽分薪榻B散囊屬Eurotium真菌都是嗜高滲透壓的，在一般的培養基上生長不良或不能生長，在低水活度培養基上才能生長正常[21]。因此，選取高鹽察氏培養基分離計數結果對后續儲藏稻谷的真菌菌落數、菌種豐度和優勢菌群等進行分析。真菌菌落總數和菌種豐度結果見表1。

表1 北方各省儲藏稻谷真菌菌落總數及菌種豐度

由表1可知，東北三省和華北地區北京真菌菌落數和菌種豐度相差不大，真菌菌落數基本處于1.0×103～ 2.2×103CFU/g的水平上，菌種豐度在16 ～ 21種。四個省區的稻谷在儲藏過程中基本實現了準低溫儲藏，黑龍江和吉林因其外界自然低溫環境優越，倉內主要采用內環流控溫或夜間開窗自然通風降溫，遼寧和北京主要采用空調控溫。這4個省區糧庫，度夏期間，整倉平均溫度在10 ℃左右，上層溫度均控制在20 ℃左右，個別地區出現過25 ℃，但持續時間不長。因此，這些地區儲藏稻谷的真菌菌落數基本維持在初始帶菌量的水平，真菌豐度也沒有明顯變化。而西北寧夏糧庫稻谷真菌菌落數明顯增加，達到104CFU/g水平，表層菌種豐度明顯下降。寧夏該糧庫夏季高溫持續一段時間，但糧庫未采取控溫措施，追溯糧堆溫度數據，整倉平均溫度在15 ℃左右，上層曾出現過局部32 ℃ 高溫現象。綜合分析，寧夏上層稻谷水分和溫度偏高，為儲藏真菌生長提供了充足條件，致使真菌菌落數增加，高于正常儲藏時菌落數一個數量級，并成為優勢菌群，使菌種豐度降為3種。

2.3 優勢菌群分析

由于儲藏條件發生變化，真菌菌落數會明顯增加，具體哪些真菌會生長成為優勢菌群值得關注。明確優勢菌群的種類有助于監控倉儲過程中主要危害真菌變化情況，為糧堆霉變防控提供技術指導。

對高鹽察氏培養基分離到的菌種進行優勢菌群分析，首先確定北方儲藏稻谷真菌的優勢屬，再將優勢屬中真菌放在一起進行分析，占比小于1%的真菌種類歸為其他，優勢屬和優勢種比例關系如圖3所示。

由圖3可知，用高鹽察氏培養基分離時，北方儲藏稻谷優勢屬主要為曲霉屬Aspergillus、枝孢屬Cladosporium和鏈格孢屬Alternaria，優勢種為曲霉屬Aspergillus中的阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans，枝孢屬Cladosporium中的芽枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides和Cladosporiumanthropophilum，鏈格孢屬Alternaria中的細極鏈格孢Alternariatenuissima和鏈格孢Alternariaalternata。

由2.1分析可以確定，鏈格孢屬Alternaria的細極鏈格孢Alternariatenuissima和鏈格孢Alternariaalternata屬于田間真菌，在收獲前期侵染稻谷，其生長對水活度要求較高。枝孢屬Cladosporium的芽枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides和Cladosporiumanthropophilum屬于過渡真菌，在收獲前后污染稻谷，其生長特性與田間真菌相似。這兩類真菌通常不會在儲藏期間大規模生長繁殖，主要分布在各省高大平方倉糧堆的中層和下層。本研究團隊曾對北方新收獲入庫稻谷的真菌多樣性進行調查，結果表明大部分北方稻谷入庫時就攜帶大量的枝孢屬真菌，這可能與北方稻谷收獲期間環境溫度有關。當倉儲環境一直處于低溫、條件良好時(如糧堆中層和下層)，這些田間和過渡真菌仍保持收獲入庫時的優勢比例。曲霉屬Aspergillus的阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans屬于儲藏真菌。這2種真菌有嗜高滲透壓的特性(耐旱性)[21]，能在低水活度的糧食中生長和繁殖，主要出現在寧夏糧庫糧堆上層。這類真菌是北方稻谷儲存過程中主要監控的危害真菌種類。

圖3 儲藏稻谷優勢屬和優勢種分布情況

本研究分離出的優勢菌阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans與擬灰綠曲霉Aspergilluspseudoglaucus、赤曲霉Aspergillusruber、篩曲霉Aspergilluscibarius、謝瓦曲霉Aspergilluschevalieri、Aspergillusmontevidensis5種真菌的形態特征和ITS序列很相近(見系統發育樹)，由于阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami、赤曲霉Aspergillusruber和謝瓦曲霉Aspergilluschevalieri歸屬于灰綠曲霉群[22]，故將這7種真菌統一歸為灰綠曲霉群及其近緣類群進行分析，這個類群所有真菌均具有嗜高滲透壓的特性(耐旱性)[21]，屬于典型的儲藏真菌，其生長需要較低的水活度。由此可知，在稻谷儲存過程中，儲存條件不佳時，灰綠曲霉群及其近緣類群最先生長繁殖，數量快速增加逐漸取代其他真菌成為優勢菌群，使真菌種群豐度下降。

2.4 儲藏環境對真菌分布的影響

從表1中真菌數量及豐度數據可以看出糧堆作為一個小生態環境，不同位置溫濕度不同，可能會影響到真菌分布情況。本研究根據糧堆環境差異特點，按照方法1.1進行分層取樣，對3種類型的真菌在糧堆不同深度的分布情況進行分析，結果如圖4所示。

圖4 北方儲藏稻谷不同深層位置真菌分布情況

由圖4可知，北方地區高大平房倉儲存稻谷時，糧堆不同深度，不同類型真菌分布存在一定差異。結合北方地區氣候特點，冬季干冷，糧庫通常會在冬季進行通風降溫蓄冷以備度夏。糧堆會保存自然冷心，糧堆中層和下層平均糧溫可控制在10 ℃或以下，夏季期間，上層稻谷易受外界環境影響，糧溫升高，平均溫度可達20～25 ℃，個別區域會出現30 ℃高溫，當上層和中層稻谷溫差過大時可能出現水分遷移現象導致上層稻谷水分升高[23]，溫度和水分的上升，易導致儲藏真菌的生長。因此，在糧堆上層儲藏真菌占絕對優勢，田間和過渡真菌的數量由于真菌之間的競爭抑制作用而降低。對于貼近糧倉墻面0.5 m左右的糧堆，當墻體保溫隔熱效果不佳時，受環境溫度影響明顯，也可能出現這種情況。中層和下層稻谷因糧食導熱性差，受外界環境影響相對較小，會保持良好的低溫環境，田間真菌和過渡真菌占主要優勢，基本維持在初始水平，大概范圍為1.0×103～3.3×103CFU/g，屬于正常環境真菌的檢出水平。

北方地區糧倉內，當儲藏真菌成為優勢菌群后，田間和過渡真菌數量會明顯下降，這一不同類型真菌的生長和演替，主要受儲存條件變化的影響。北方儲藏稻谷主要優勢菌為灰綠曲霉群及其近緣菌群，這類真菌生長一般不會導致糧堆發熱，但若不加以控制，可能會出現發熱現象，因此灰綠曲霉群及其近緣菌群可以作為糧堆發熱前預測預警的指示菌群[24]。

3 結論

北方地區儲藏期稻谷分離出的真菌種類較多，共分離純化出322株分離菌株，經鑒定為58種真菌，分布于2門，4綱，6目，13科，16屬。本研究綜合分析ITS和β-微管蛋白基因序列以及真菌形態特征，將我國北方儲藏稻谷分離出真菌基本鑒定到種。通過系統發育樹分析，結合國外文獻對糧食中真菌類型的劃分，首次將我國北方倉儲稻谷中分離出的真菌進行了分類，為北方稻谷儲藏狀況分析提供理論支撐。

通過對北方儲藏稻谷優勢菌群和真菌類型的分析，將阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans與其他5種近緣曲霉劃為灰綠曲霉群及其近緣類群，這類真菌對于倉儲環境的適應性較強，儲存溫濕度增加時，首先萌發生長，數量增加，成為優勢菌群。高大平房內，糧堆上層或鄰近墻壁等位置受環境溫度的影響，容易出現高溫和水分遷移的情況，為儲藏真菌生長提供條件，使優勢菌群由初始的田間和過渡真菌演替為儲藏真菌，若不加以處理可能導致糧堆發熱，引起儲存稻谷品質的劣變，嚴重影響儲糧安全。綜上所述，我國北方地區儲藏期稻谷分離出的真菌種類繁多，真菌菌落總數范圍在103～ 104CFU/g之間。優勢菌阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans被劃分為灰綠曲霉群及其近緣類群，可作為北方糧堆異常糧情早期監測預警的主要指示菌群，高大平方倉中糧堆上層和鄰近墻壁等位置是北方倉儲過程中主要關注的區域。