改良單疊氮丙啶-熒光定量PCR法的建立及其檢測抗結核藥物活性的價值

張靜 陳曦 王彬 付雷 陸宇 陳效友

結核病是一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，2019年WHO[1]報告估算2018年全球約1000萬例新發結核病患者，全球平均結核病發病率為130/10萬，因結核病而死亡患者約為145.1萬例，耐多藥結核病(MDR-TB)的治愈率約為56%。面對嚴重的結核病疫情，亟需發現新的有效抗結核藥物。體外抗結核藥物活性測定是新藥藥效學評價的重要環節，傳統平板計數法[2]，耗時長，現已較少應用；而目前國內外常用快速檢測最低抑菌濃度(MIC)的方法包括微孔板Alarmar blue(MABA)法[3]、刃天青微孔板稀釋(REMA)法和四唑染料 (tetrazolium dye)法等；因結核分枝桿菌生長緩慢，上述檢測方法需要7～9 d才能獲得結果。因此，需要建立一種快速、有效的藥物活性檢測方法，以滿足抗結核新藥開發的需要。

單疊氮乙醚(ethidium monoazide, EMA)或單疊氮丙啶(propidium monoazide, PMA；本研究使用PMA改良類似物PMAxx)[4]是一種核酸染料，它可以通過受損的細胞膜，在暴露于強可見光后共價插入細菌基因組，形成不可逆結合而干擾DNA擴增；利用EMA/PMA對受損與未受損的細菌進行預處理并聯合熒光定量PCR(qPCR)檢測，根據被降低或完全抑制的PCR信號來有效鑒別活菌和死菌。盡管PMA特異性滲透及抑制DNA擴增的機制尚不明確，但該方法已廣泛應用于檢測食品或復雜環境條件下的活菌[4]、寄生蟲[5]，以及相關的水質鑒定[6]。但是，該方法針對結核分枝桿菌的研究相對較少，尚未見到直接應用于抗結核藥物活性檢測的報道。

本研究首先通過未經處理和熱滅活的結核分枝桿菌來建立PMAxx-qPCR的檢測方法，并將該方法直接應用于一線抗結核藥物異煙肼(INH)和利福平(RFP)體外活性測定，并且與傳統檢測方法相比較，以有效評估PMAxx-qPCR方法的適用性。

資料和方法

一、結核分枝桿菌標準株

結核分枝桿菌標準菌株H37Rv(ATCC27294)為北京市結核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存菌。

二、主要試劑和儀器

1.試劑：PMAxx(40069，美國Biotium公司)；Middle brook 7H9培養基(271310，美國BD公司)；Middle brook 7H10培養基(262710，美國BD公司)；Middle brook OADC增菌液(由氯化鈉、牛血清白蛋白、葡萄糖、過氧化氫酶、油酸組成)(212351，美國BD公司)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(P1022，北京索萊寶科技有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(219605580，美國Mp Bio公司)；Flash Hot Start Master Mix (SJ22e06351081，北京康為世紀生物科技有限公司)；Eva-Green qPCR Master Mix(31000，美國Biotium 公司)；吐溫80(9005-65-6，北京索萊寶科技有限公司)；西班牙瓊脂糖(9012-36-6，北京索萊寶科技有限公司)。

2.儀器：多功能酶標儀(型號：Infinite M200pro, 瑞士迪肯公司)；電熱水浴鍋(型號：WBK-3B，上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；PMA-Lite LED光解儀(型號：E90002，美國Biotium公司)；熒光定量PCR儀(StepOnePlus, 美國應用生物系統公司); PCR儀(型號：Genepro，杭州博日科技有限公司)；高速離心機(型號：1730R，中國香港基因有限公司)。

三、實驗方法

(一)菌液制備

1.標準株培養：結核分枝桿菌H37Rv標準菌株接種于含10% OADC和0.05% 吐溫 80的7H9 液體培養基，置37 ℃恒溫箱內培養至對數生長期，于酶標儀中在570 nm處測定吸光度值(A值)[7]，以A值0.1=1×108菌落形成單位(CFU)/ml為標準，配制成終濃度為1×108CFU/ml的活菌懸液，備用。

2.熱滅活菌：取500 μl活菌(濃度：1×108CFU/ml)懸液于水浴鍋進行熱處理(100 ℃，30 min)，冷卻至室溫，制成熱滅活菌，備用。

(二)PMAxx處理條件優化

1.條件設置：曝光時間為10、15、20和30 min；暗孵育時間為10、30和60 min；PMAxx終濃度為5、10、20、40、80和100 μmol/L。

2.處理流程：將PMAxx(濃度分別為：5、10、20、40、80和100 μmol/L)分別加入含500 μl活菌或熱滅活菌(終濃度：107CFU/ml)的透光離心管中，37 ℃恒溫箱內避光孵育(時間分別為：10、30和60 min)，室溫下于PMA-Lite LED光解儀(波長λ=465～475 nm，60 W)中進行曝光(時間分別為：10、15、20和30 min)，混懸液經25 000×g離心5 min，后經PBS洗滌2次，棄去上清液，取沉淀重懸于200 μl 雙蒸水(ddH2O)中。

3.DNA模板制備：將重懸液于沸水中水浴加熱30 min，15 520×g離心3 min，取上清液作DNA模板，備用。

4.qPCR檢測：反應體系為10 μl 2×Eva-Green qPCR Master Mix、2 μl ROX校正染料(10 mg/ml)、0.5 μl 40×模板緩沖體系、rrs4正反向引物各0.3 μl(表1)、1 μl DNA模板和5.9 μl ddH2O。反應程序(2步法qPCR[8])為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火及延伸30 s(采集熒光信號)；每次PCR反應重復40個循環進行。記錄循環閾值(quantification cycle, Cq值)。

(三)PMAxx處理的相關影響因素

1.標識靶基因片段長度的影響: 基于NCBI中提供的結核分枝桿菌16S rRNA基因序列，利用Primer Express 3.0.1軟件自行設計PCR的引物(rrs1～3和rrs5～7)，其中rrs4引物序列引自相關的參考文獻[9]。并對基因庫中的序列進行BLAST搜索，以評估所有引物的特異性，引物具體信息見表1，引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

常規PCR反應體系：5 μl DNA模板、25 μl的2×Flash Hot Start Master Mix和正反向引物各2.5 μl，并使用 ddH2O配平終體系至50 μl。反應條件為95 ℃持續3 min預變性，95 ℃ 30 s變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 10 s延伸，共30個循環，最后一次循環72 ℃延伸 10 min。經瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增產物，比較進行和未進行PMAxx預處理的細菌樣本PCR擴增產物的差異。

2. 結核分枝桿菌生長周期：取同株等濃度的H37Rv活菌懸液分別培養2、3和4周。PMAxx處理組設為實驗組，以未進行PMAxx預處理的細菌樣本為對照組。兩組分別進行qPCR檢測，比較實驗組和對照組間Cq值差異。

(四)抗結核藥物活性檢測

1.抗菌藥物：選用常見的一線抗結核藥物INH(批號：#MKBV9475V)和RFP(批號：#BCBP4553V)，均購自美國Sigma公司；INH使用ddH2O溶解(儲備液濃度：1 mg/ml)，RFP使用DMSO溶解(儲備液濃度：1 mg/ml)，-20 ℃保存，備用。

表1 不同長度標識靶基因片段引物設計

注F=forward(正向)；R=reverse(反向)

2.抗結核藥物活性測定：具體介紹如下。

1)采用PMAxx-qPCR法測算MIC：分別取INH、RFP藥物儲備液經2倍系列稀釋至合適濃度(0.003125、0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4 μg/ml)，分別加入200 μl標準株菌液(終濃度為107CFU/ml)，在含5% CO237 ℃恒溫箱內培養，分別與INH、RFP作用3、5、7和10 d后取混懸液樣本應用優化后的PMAxx-qPCR方法檢測。計算抑菌活性公式：抑菌活性=(1-2-ΔCq)×100%，ΔCq=Cq含藥-Cq不含藥(每次計算對應3個獨立樣本的DNA提取和qPCR擴增)。繪制量效曲線[藥物濃度(μg/ml)/抑菌活性(%)]，加權法計算藥物MIC。

2) MABA法檢測藥物MIC：(1)將96孔酶標板首行的1～6孔設置為7H9培養基對照(200 μl/孔)，7～12孔設為菌對照孔[(100 μl 7H9液體培養基+100 μl菌液)/孔]。(2)在其他行的首孔分別加入200 μl含有單藥的7H9培養基混合液(INH、RFP)，均經2倍梯度稀釋至如下濃度：0.019、0.039、0.078、0.1562、0.3125、0.625、1.25、2.5、5和 10 μg/ml，在除對照孔之外的各孔中加入100 μl H37Rv標準株菌液(濃度：106CFU/ml)。(3)在含5% CO237 ℃恒溫箱中孵育，7 d后向各孔加入20 μl Alamar blue和12.5 μl 20%吐溫80的混合液，再置回37 ℃恒溫箱內孵育。(4)24 h后將酶標板置于酶標儀于激發波長為530 nm且發射波長為590 nm條件下，測定各孔的相對熒光強度值，并計算MIC。

3) PMAxx-qPCR法測算藥物抗菌計數：將500 μl 標準株菌液(終濃度為107CFU/ml)與一定量的INH、RFP混合，各藥物終濃度設定：16×MIC，8×MIC，4×MIC，2×MIC，1×MIC(MIC單位為μg/ml)，以不含藥空白孔為陰性對照孔，于含5% CO237 ℃恒溫箱內培養10 d，PMAxx-qPCR檢測方法同前。取1×108CFU/ml結核分枝桿菌培養液進行連續10倍稀釋，獲得108CFU/ml至102CFU/ml 7個濃度梯度，經PMAxx預處理后提取DNA，進行qPCR檢測，以ddH2O為陰性對照，確定PMAxx-qPCR方法檢測敏感度。經線性回歸獲得標準曲線方程式[Cq值/(lg CFU/ml)]，藥物抗菌計數為含或不含藥條件下lg CFU/ml差值，并將該結果與同條件下CFU計數方法結果相比較。

4)CFU計數：菌液藥物濃度設置同前，吸取200 μl藥物作用10 d后混懸液用生理鹽水進行連續10倍稀釋，均勻涂抹在7H10固態培養基上，在37 ℃恒溫箱內孵育3～4周后進行菌落計數。

四、統計學處理

結 果

一、 PMAxx處理的優化條件

1. PMAxx曝光時間：使用PMAxx對活菌進行預處理時，與對照組(未經PMAxx處理)比較，曝光10、15和20 min時Cq值無明顯變化，而曝光30 min 時Cq值明顯升高(q=8.975，P<0.05)(表2)，提示曝光時間過長可抑制活菌的擴增；使用PMAxx對等量熱滅活菌預處理時，各處理組較對照組間差異均有統計學意義，提示使用PMAxx處理可抑制熱滅活菌的擴增，但曝光10 min時，熱滅活菌Cq值小于其他時間組(P值均<0.05)，提示曝光10 min混懸液中仍存在未與PMAxx結合的游離DNA引起擴增，而曝光15、20和30 min時，各組間Cq值不再隨著曝光時間的延長而發生變化(P值均>0.05)(表2)。綜合死菌和活菌的結果，以不影響活菌擴增且充分反映死菌的差異為原則，選擇15 min作為最佳曝光時間。

2. PMAxx暗孵育時間： PMAxx預處理活菌暗孵育10和30 min與對照組比較差異均無統計學意義，而暗孵育60 min后Cq值出現輕度升高(q=3.991，P=0.006)；同時，經PMAxx處理的熱滅活菌各組檢測的Cq值較對照組結果明顯升高(P<0.001)，且各時間組間兩兩比較，Cq值不隨孵育時間的延長而發生變化(P值均>0.05)，提示10 min即可滿足PMAxx預處理孵育要求(表3)。

3. PMAxx最適濃度：PMAxx濃度對活菌和熱滅活菌qPCR檢測的影響如圖1所示，隨著PMAxx處理濃度的增加，活菌懸液Cq值總體上有升高趨勢，以未經PMAxx預處理菌樣本為陰性對照，當PMAxx濃度升高至80 μmol/L 及以上時，活菌擴增Cq值明顯增大(26.844±0.376 與 31.625±0.890，t=12.300，P<0.001)，說明高濃度的PMAxx將抑制活菌DNA擴增，且濃度越高抑制效果越明顯，因此，不影響活菌擴增的適宜濃度范圍為5～40 μmol/L。當PMAxx濃度為5 μmol/L時，PMAxx處理的熱滅活菌較陰性對照Cq值無明顯變化(27.767±0.244與26.830±0.123，t=2.410，P=0.387)，說明該濃度下無法抑制樣品中DNA的擴增；當PMAxx濃度≥10 μmol/L時，Cq值明顯升高且各組間差異均無統計學意義(圖1)。

表2 曝光時間對PMAxx-qPCR方法鑒定活菌和熱滅活菌的影響

注Cq值：循環閾值。各項數據間比較采用單因素方差分析的Tukey多重檢驗。a: 對照組與曝光10 min的比較；b: 對照組與曝光15 min的比較;c: 對照組與曝光20 min的比較；d：對照組與曝光30 min的比較;e: 曝光10 min與曝光15 min的比較;f: 曝光10 min與曝光20 min的比較;g: 曝光10 min 與曝光30 min的比較:h: 曝光15 min與曝光20 min的比較;i: 曝光15 min與曝光30 min的比較；j: 曝光20 min與曝光30 min的比較；“-”：空白

表3 暗孵育時間對PMAxx-qPCR方法鑒定活菌和熱滅活菌的影響

注Cq值：循環閾值。各項數據間比較采用單因素方差分析的Tukey多重檢驗。a: 對照組與暗孵育10 min的比較；b: 對照組與暗孵育30 min的比較;c: 對照組與暗孵育60 min的比較；d：暗孵育10 min與暗孵育30 min的比較;e：暗孵育10 min與暗孵育60 min的比較;f：暗孵育10 min 與暗孵育60 min的比較。“-”：空白

Cq值：循環閾值；“┰”表示標準差圖1 不同PMAxx濃度對活菌和熱滅活菌qPCR檢測的影響

“-”表示未經PMAxx預處理，“+”表示經PMAxx預處理。M：Marker(2000 bp)；標記編號1～7分別代表rrs1(81 bp)、rrs2(117 bp)、rrs3(143 bp)、rrs4(206 bp)、rrs5(279 bp)、rrs6(316 bp)、rrs7(433 bp)各擴增產物條帶圖2 不同擴增片段長度對PMAxx-qPCR方法檢測的影響

綜合比較各組間死活菌ΔCq，發現10 μmol/L 組ΔCq值明顯高于其他組(6.772±0.453)。故選擇10 μmol/L作為PMAxx鑒別結核分枝桿菌死活菌的處理濃度。

二、PMAxx-qPCR方法相關影響因素

1. 擴增片段長度：電泳圖譜顯示所有未進行PMAxx預處理的樣品均出現明亮單一條帶，而隨著靶標片段大小變化，PMAxx處理組電泳條帶出現明顯差異。當擴增片段長度為81～143 bp時，PMAxx處理組仍存在較明顯條帶；當擴增片段長度為206～433 bp時，處理組電泳條帶消失，表示經PMAxx處理的樣品DNA擴增被完全抑制(圖2)。

2. 結核分枝桿菌的生長周期：隨著培養時間的延長，PMAxx處理組與未處理組間ΔCq值逐漸升高，從對數生長期(2周)的0.575個循環升至平臺抑制期(4周)的2.866個循環，且當培養時間為3周和4周時，PMAxx處理組較未處理組Cq值差異均有統計學意義，提示不同生長周期的結核分枝桿菌將導致PMAxx檢測活菌的背景值存在差異(表4)。

三、 PMAxx-qPCR方法檢測抗結核藥物的活性

1. 與MABA法比較測定藥物MIC：根據PMAxx-qPCR法檢測獲得的量效曲線(圖3，4)進行擇點加權測算，得到INH的MIC為0.06 μg/ml(0.049～0.076 μg/ml)，與MABA法(0.032～0.064 μg/ml，t=0.782，P=0.491)一致性良好；而RFP由PMAxx-qPCR方法測算的MIC為0.121 μg/ml(0.102～0.145 μg/ml)，與MABA法(0.051～0.079 μg/ml，t=2.828，P=0.066)一致性尚可；實驗結果0.5～2倍MIC值視為可接受范圍。同時，對比藥物作用5、7和10 d 的量效曲線，發現采用PMAxx-qPCR法在作用后第3天即可測算出藥物的MIC。

表4 PMAxx處理前后qPCR所測循環閾值(Cq值)在不同生長周期結核分枝桿菌中的比較

虛線表示抑菌率達到90%最低抑菌濃度；“┰”表示標準差 虛線表示抑菌率達到90%最低抑菌濃度；“┰”表示標準差圖3 INH量效曲線(PMAxx-qPCR法) 圖4 RFP量效曲線(PMAxx-qPCR法)

2. 與CFU計數法比較藥物抗菌活性：定量(終濃度為108CFU/ml)結核分枝桿菌懸液連續10倍梯度稀釋，經PMAxx處理后分別提取DNA，經qPCR檢測以獲得標準曲線[Cq值/(lg CFU/ml)]，其線性回歸方程為y=-2.566x+45.51，R2=0.9863(圖5)。最低檢測限為102CFU/ml(Cq=39.616±0.317)。

Cq值：循環閾值；CFU：菌落形成單位；“┰”表示標準差圖5 結核分枝桿菌PMAxx-qPCR標準曲線

根據方程分別計算各濃度(16×MIC，8×MIC，4×MIC，2×MIC，1×MIC)INH、RFP作用后10 d抗菌計數，CFU計數方法結果和PMAxx-qPCR方法測定結果對比分析見表5，兩種方法測算一致性良好(P>0.05)(表5)，說明PMAxx-qPCR方法可有效快速檢測抗菌藥物活性。

討 論

特異性膜滲透的核酸染料PMA與高敏感度的熒光定量qPCR檢測技術結合，可以選擇性檢測細胞膜完整的活性病原菌，具有特異性強、定量準確、快速檢測等優點，現已廣泛應用于食品、檢疫、農業、畜牧業等多領域微生物活性檢測。本研究使用PMA改良類似物PMAxx[10]區分結核分枝桿菌H37Rv活菌和熱滅活菌提供一個完整的方案，探討方法應用的重要影響因素，并應用于抗結核藥物的活性檢測。

表5 不同MIC倍增濃度的INH、RFP作用10 d后的PMAxx-qPCR法抗菌計數和CFU計數結果的比較

注MIC：最低抑菌濃度；CFU：菌落形成單位

根據多項研究報道,該方法的建立存在多種影響因素[10]，包括PMA濃度[9]、細胞死亡方式[11]、樣品的種類或濃度[12]等。在本研究中首先研究了曝光時間、暗孵育時間、試劑濃度等幾項關鍵因素。研究結果表明，使用濃度為10 μmol/L PMAxx預處理H37Rv，經暗孵育10 min后曝光15 min，可有效區分活死菌，并避免各項干預條件導致的假陽性反應。Lu等[12]利用該方法檢測痰中培養分離的結核分枝桿菌，發現延長暗孵育時間可有效提高PMA對死菌的檢出率，適用濃度范圍為100～800 μmol/L，Dorn-In 等[8]和Pholwat 等[9]研究得出適用濃度為50 μmol/L，均高于本研究中的10 μmol/L，導致以上差異的原因主要考慮以下兩個方面：(1)本研究采用的是純菌懸液，而Lu等[12]研究中目標是臨床痰樣本，Dorn-In等[8]研究目標為鹿肉和糞便樣本中的結核分枝桿菌復合體，復雜性樣本中非細胞物質可能影響PMA的滲透能力，因此需提高試劑濃度和延長預處理時間以提高其與死菌DNA的結合率；(2)本方法中應用的PMAxx已被證實滲透能力優于PMA[13], 所需量少且處理時間更短。另外，本研究發現PMAxx在檢出效率上不受孵育時間影響。

qPCR是本方法檢測的主要部分，因此標靶基因的識別和檢測是影響方法實施的關鍵。本研究發現使用較長的靶標片段(206～433 bp)區分死活結核分枝桿菌較短片段(81～143 bp)有效，該發現與多項研究結果一致；Contreras等[14]研究發現，應用PMA-qPCR方法鑒別非活性鰻弧菌和嗜冷黃桿菌時，729 bp的靶標產物檢出效率明顯優于140 bp，且死活菌檢測差異隨靶標片段的擴大逐漸升高；Alonso 等[15]研究也發現應用PMA-qPCR方法檢測熱滅活的十二指腸賈第蟲囊腫時，采用143 bp/133 bp靶標片段的檢出率分別為97.0%和98.2%，而采用77 bp/75 bp時檢出率明顯降低(89.9%和83.2%)。以下原因可能解釋該現象：據Opel等[16]報道，與DNA結合的PCR抑制劑主要通過影響DNA聚合酶的作用而影響延伸率，而長片段較短片段出現DNA聚合酶功能抑制的概率更高，因此使得長片段對該類抑制劑更為敏感。

本研究將優化后的PMAxx-qPCR方法直接應用于一線抗結核藥物INH、RFP的體外抗菌活性檢測，首先發現該方法在藥物作用后3 d即可獲得與國際通用的MABA法一致性良好的MIC結果，該發現與Pholwat等[9]研究結果一致。因此與需時較長的MABA法相比可有效提高檢測效率。其次，本研究還通過Cq值/lg CFU/ml標準曲線轉換獲得藥物作用后活菌計數，與傳統CFU計數方法結果一致性良好。Scariot等[17]研究證實PMA-qPCR方法檢測酸奶中副干酪乳桿菌和CFU計數法的結果具有極佳的符合率，Roussel等[18]也通過對大腸桿菌研究充分證實PMA-qPCR方法和CFU計數法結果的高度一致性。本研究證實PMAxx-qPCR方法對結核分枝桿菌菌落計數的測算同樣有效，且最低檢測限可至102CFU/ml，與Zi等[19]研究中的檢測限結果一致。總之，PMA-qPCR方法在保證有效、準確、高敏感度評價藥物抗菌活性的前提下，可大大節省時間成本，提高檢測效率，具備成為藥物抗菌活性研究及評價工具的潛力。

本研究的局限性在于應用PMAxx-qPCR方法僅評估INH、RFP兩種抗結核藥物，而抗結核藥物種類繁多且作用靶點各異，仍需要完善對其他抗結核藥物的活性檢測以評估方法的應用價值。

本研究結果表明，PMAxx在適宜的處理條件下，可有效抑制對死菌DNA的擴增，聯合qPCR時可作為一種快速、準確的分子藥敏檢測方法，敏感度高，可有效檢測藥物抗菌活性，與傳統檢測方法相比，一致性良好且需時更短。