高效液相色譜結合DA方法對3種蟲草的分類研究*

于興軍，許明光，李東興，吳 杰

（1.北華大學 林學院，吉林 吉林 132013；2.吉林省樺甸市樺樹林場，吉林 吉林 132414；3.北京首誠農業發展有限公司，北京 102402；4.北京航天農業生物科技有限公司，北京102447）

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis） 隸屬于線中草科（Ophiocordicipitaceae）為冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體[1]，是我國傳統名貴中藥，始載于《本草從新》，謂其能保肺，益腎止血，化痰止勞嗽[2]。現代藥理和臨床研究結果表明，冬蟲夏草具有強心、降血脂、降低膽固醇、調節機體免疫力、抗腫瘤等多種藥理活性，對高血壓、冠心病、慢性肝炎、慢性腎炎、支氣管炎以及食道癌、肝癌、自身免疫性疾病等均有較好療效[3]。野生冬蟲夏草因其獨特的生長環境和近年來的過量采集，使得其產量降低、價格昂貴。據報道，蛹蟲草（Cordyceps militaris） 與冬蟲夏草的化學成分與藥理作用相似[4-5]，因而人工培育蛹蟲草在近年來被廣泛研究。目前人工培養的蛹蟲草主要有柞蠶蛹蟲草和蛹蟲草子實體2種類型。柞蠶蛹蟲草是人工將蛹蟲草菌接種到活的柞蠶蛹上培養而成，是蛹蟲草子座與菌核兩部分組成的復合體[6]；蛹蟲草子實體是將蛹蟲草菌接種到代料培養基上而培養出的真菌子實體[7]。

據報道，蟲草中的主要活性成分為核苷類物質[8]，包括蟲草素（3’-脫氧腺苷）、腺苷、尿苷、鳥苷、胸苷等，具有廣泛的生理活性，是蟲草品質的主要參考指標[9-10]。但目前有關冬蟲夏草及人工蟲草品質控制和監管的統一標準方法尚未建立，市場上的各類蟲草及其制品的品質參差不齊，甚至有不良廠家在各類蟲草制品中以次充好、以假亂真。因此，通過對冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實體利用高效液相色譜對比分析其活性成分差異，結合判別分析法建立區分冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實體的方法，為蟲草的品質控制及蟲草資源的進一步開發利用提供依據。文獻檢索顯示檢測蟲草中主要核苷類活性物質的方法以高效液相色譜法最為普遍[11]，但未見有用該方法對比分析3種蟲草的蟲草素、腺苷、尿苷、鳥苷、胸苷的報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

12個柞蠶蛹蟲草樣品分別來自于10個蛹蟲草生產廠家，其中吉林2個（YC1～YC2）、遼寧3個（YC3～YC5）、山東 1個 （YC6）、上海 1個 （YC7）、杭州1個（YC8），北京2個廠家各提供2個批次共4個樣品 （YC9～YC12）。

8個蛹蟲草子實體樣品分別來自于8個蛹蟲草子實體生產廠家，其中遼寧2個（ZST1～ZST2）、內蒙 2個 （ZST3～ZST4）、河北 2個 （ZST5～ZST6）、山東1個（ZST7）、廣東1個（ZST8）。

4個冬蟲夏草樣品來自于青海省玉樹市稱多縣和西藏的巴青縣、索縣的農戶（DCXC1～DCXC4）。

1.1.2 試劑

蟲草素，純度≥99.0%，購自北京百靈威科技有限公司；腺苷、胸苷、鳥苷、尿苷，純度≥99.0%，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；甲醇，色譜純，購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Mliil-Q型超純水儀，美國MILLI-PORE公司；KQ-500DE超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A高速離心機，上海安亭科學儀器廠；高效液相色譜儀，配DAD檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準備

分別將經過預冷凍的蟲草樣品放入冷凍干燥機內處理12 h，取出后粉碎并過60目篩，然后精確稱取過篩后的樣品0.50 g，置于50 mL離心管中，加入20%甲醇25 mL，于30℃、80 kHz條件下超聲提取30 min，提取結束后將離心管置于20℃、5 000 r·min-1的離心機中離心10 min，吸取上清液2 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾后得到樣品溶液，備用。

1.3.2 標準溶液配制

分別準確稱取蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷標準品各0.010 0 g，置于10 mL容量瓶中，用20%甲醇溶解后定容，搖勻，作為標準品儲備液。吸取適量上述各標準品溶液，分別用20%甲醇準確稀釋成 2.00 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、75.00 μg·mL-1的標準溶液[12]。

1.3.3 色譜分析條件

色譜柱 （Agilent C18，250.0 mm × 4.6 mm，5.0 μm）；流速 1.0 mL·min-1；檢測波長 260 nm；進樣體積20 μL；柱溫30℃。流動相A為超純水，流動相B為甲醇。梯度洗脫順序：0（5%B） →5 min（5%B） →15 min （20%B） →25 min （35%B） →30 min（35%B）。

1.4 數據處理

定性分析：將蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷的混合標準液進行HPLC分析。通過將樣品與標準品圖譜保留時間的比對，確定蟲草樣品中的主要活性成分。并選取3類蟲草HPLC圖譜的共有峰作為蟲草的特征指紋峰。

定量分析：依據外標法計算3種蟲草中蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷的含量。SPSS軟件DA判別分析計算，首先選取21個樣品（3個冬蟲夏草、11個柞蠶蛹蟲草和7個蛹蟲草子實體） 的13個共有特征指紋峰數據作為判別分析樣本集建立判別模型，然后依據該模型對隨機3個預留樣品（1個冬蟲夏草、1個柞蠶蛹蟲草和1個蛹蟲草子實體）進行DA預測判斷試驗，以驗證該方法的準確性。混合標準品色譜圖見圖1。

2 結果與分析

2.1 流動相及梯度洗脫程序的優化

冬蟲夏草及柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實體所含化學成分復雜，且各種類型的化合物的極性差別較大[13]。進行等梯度甲醇-水系統、乙腈-水系統，以及不同梯度的甲醇-水系統、乙腈-水系統洗脫，結果表明選擇水（A）-甲醇（B）為流動相，洗脫程序為0（5%B） → 5 min （5%B） → 15 min （20%B） → 25 min（35%B） →30 min（35%B） 時，在30 min可以使色譜峰全部洗出，且分離較好，故選擇該流動相系統及洗脫方式作為色譜條件。

2.2 蟲草樣品的活性成分

冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實體中主要活性成分含量見表1。

表1 3種蟲草中主要活性成分含量Tab.1 Contents of main active components in three kinds of Cordyceps spp.

表1結果表明，柞蠶蛹蟲草中核苷類含量蟲草素＞腺苷＞鳥苷＞胸苷，尿苷含量低于其檢測限值；蛹蟲草子實體中核苷類含量蟲草素＞腺苷＞胸苷，尿苷和鳥苷含量均低于其檢測限值；冬蟲夏草只含有一定量的尿苷、鳥苷和腺苷，不含蟲草素。可以看出，柞蠶蛹蟲草中的核苷類成分組成及總含量均優于冬蟲夏草和蛹蟲草子實體，并且其中腺苷和蟲草素是3種蟲草中含量較高的核苷類成分，而無論是按腺苷還是按蟲草素含量排序，順序均為柞蠶蛹蟲草＞蛹蟲草子實體＞冬蟲夏草。

2.3 蟲草指紋圖譜分析

選取各個蟲草樣品HPLC圖譜中的13個共有峰作為3種蟲草的特征指紋峰，詳見表2。

隨機選取 3個預留樣品 （DCXC1、YC5和ZST7），其余21個樣品作為DA分析樣本庫，進行DA典型判別分析計算，得到3種蟲草的DA判別分析模型，結果見圖2。

由圖2可以看出，不同類別的蟲草所含的活性物質構成和含量有所差異，因此根據這種差異，可以將相同類別的蟲草樣品顯著地聚在一起，而將不同類別的蟲草區分開。此外，冬蟲夏草與其他兩類蟲草區分明顯，這可能是因為冬蟲夏草的活性成分構成及含量與柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實體均有較大差異。

2.4 模型驗證

用2.3建立的判別模型對預留的隨機選取的3個蟲草樣品（冬蟲夏草DCXC1、柞蠶蛹蟲草YC5和蛹蟲草子實體ZST7）進行DA預測判斷，結果見圖3，其交叉驗證結果見表3。

表2 3種蟲草24個樣品的特征峰值Tab.2 Characteristic peaks of 24 samples in three kinds of Cordyceps spp.

由圖3可以看出，預留的隨機選取的3個蟲草樣品判別分析結果分別都落在對應的本類別的判定區域中。從表3交叉驗證結果可以看出，該DA判別分析模型具有良好的分類性能和較高的預測精度，說明該方法可以有效的進行這三種蟲草的預測判別。

3 結論

通過高效液相色譜法分析冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實體中的主要核苷類活性成分和13個共有特征峰，并依據特征峰值，利用SPSS軟件對其進行DA判別分析。結果表明，該方法能有效地將這三類蟲草區分在不同區域，形成各自的聚集區，區分效果良好，并且對于預留的隨機抽取的冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草和蛹蟲草子實體樣品的預測判別準確性較高，該方法可以作為3種蟲草及其制品的鑒別和質量監測的有效方法。

表3 3個蟲草樣品判別結果Tab.3 Discriminating results of three Cordyceps spp.samples