溫度對斑玉蕈后熟階段生理活性影響*

程泳春 ，李佳歡 ，蘇財自 ，張紫華 ，胡開輝 **

（1.福建福泉鑫生物科技有限公司，福建 寧德 352200；2.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；3.福建農林大學（古田） 菌業研究院，福建 寧德 352200）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreous） 又名真姬菇、海鮮菇、白玉菇等，是福建省食用菌工廠化生產的重要品種之一。目前國內外對斑玉蕈的栽培研究主要集中在栽培技術優化[1]、栽培特性[2]、出菇管理[3]、子實體營養物質等方面[4-5]，缺乏對栽培菌包的培養關鍵因子——溫度的精準研究。在栽培過程僅憑生產經驗來設置培養溫度，致使一年四季菌包成熟度差異大，菌包培養精準化程度低，造成產品產量、品質不穩定。

斑玉蕈是一種喜低溫食用菌，菌絲滿袋時間一般為50 d左右，滿袋后還需要后熟階段60 d～70 d的培養。已有研究指出，在斑玉蕈栽培技術中，溫度是影響菌絲生長與菌包酶活力的重要因素，溫度對菌絲生長速度、子實體產量等均有影響[6]。斑玉蕈菌絲生長最適溫度為23℃，但對栽培基質的降解主要依靠菌絲分泌的如纖維素降解酶等酶系。魏巍等[7]在靈芝出芝溫度對其基質物酶活影響的研究中指出，隨著溫度升高，木質素酶系和纖維素酶系酶活力增加，且較高的溫度更利于纖維素酶的分泌，但溫度超過35℃時，靈芝將無法出芝。在一定范圍內，培養溫度越高，酶活力越高，酶解速度快，菌包易積累營養物質，有效促進生理成熟，但過高的溫度會影響食用菌子實體的形成。因此，如何確定后熟階段斑玉蕈菌包培養的最適溫度，在保證菌絲生長的同時提高胞外酶活力，縮短斑玉蕈后熟時間，成為了目前斑玉蕈生產過程中亟待解決的問題之一。

對此，通過開展不同溫度對斑玉蕈后熟階段理化性質、酶活變化以及出菇產量的影響研究，以期揭示溫度影響斑玉蕈后熟階段的原因，為工廠化生產過程中后熟階段溫度的設置提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試斑玉蕈菌株，由福建福泉鑫生物科技有限公司提供。

棉籽殼48%、麩皮20%、木屑10%、甘蔗10%、豆粕5%、玉米粉5%、石灰2%，栽培料含水量63%。機械自動打包，打包重量（1 250±20） g（濕重），121℃滅菌120 min，冷卻后接種，置于25℃發菌房中黑暗培養。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 菌包外觀及重量

接種后60 d，菌絲長滿袋標志著菌包進入后熟階段；選取相同重量的斑玉蕈菌包分別放入23℃、26℃、29℃、32℃、35℃的培養箱中培養，每隔10 d取樣1次，稱量菌包重量，觀察菌絲顏色變化，設置3個重復，至120 d結束取樣。

1.2.2 生理生化指標測定

1） 樣品處理

將每個菌包培養基質充分攪碎混勻，稱取20 g于250 mL燒杯中，加蒸餾水80 mL，25℃、150 r·min-1振蕩，過濾后取濾液于50 mL離心管，9 000 r·min-1離心15 min，上清液即為提取液。

2） 菌包 pH

采用pH計測定菌包提取液的pH。

3） 還原糖含量

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法測定還原糖含量。

4）可溶性蛋白含量

采用考馬斯亮藍法[8]測定可溶性蛋白含量。

5）關鍵基質降解酶活性

纖維素酶參考姜性堅等[9]方法測定，酶活力單位定義為在50℃、pH 4.6條件下，每分鐘水解底物生成1 μg葡萄糖，定義為1個酶活力單位“U”。

木聚糖酶參考王孟蘭[10]等方法測定，酶活力單位定義為在50℃、pH 5.2條件下，每分鐘水解底物生成1 μg的D-木糖，定義為1個酶活力單位“U”。

中性蛋白酶采用福林-酚試劑法測定，酶活力單位定義為在40℃、pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg的L-酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位“U”。

1.2.3 出菇試驗

取樣結束后（菌包培養120 d時），取5個溫度下菌包各24包，同時放入相同的環境中進行出菇實驗；記錄原基形成時間、采收時間、出菇產量及品質，進行比較分析，觀察溫度對菌包出菇的影響。

1.3 數據處理

取樣結束后，將不同溫度培養菌包試驗數據用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，并用EXCEL軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 后熟階段不同培養溫度菌包外觀及重量變化

菌包60 d至出菇之前，斑玉蕈菌包轉色情況，見圖 1，A、B、C、D、E分別代表 23℃、26℃、29℃、32℃、35℃條件下培養的菌包。

從圖1中可以看出，菌袋顏色隨著時間延長逐漸轉變。對比不同溫度對菌包外觀的影響可以發現，23℃～29℃菌袋顏色逐漸由淺白色變成淺黃色，顏色之間的差異較小；32℃菌包顏色較23℃～29℃時明顯加深，且菌絲濃密度較低；35℃、70 d菌包顏色相對其他溫度顏色較深，且在80 d時明顯觀察到綠霉感染，隨后綠霉蔓延。溫度對菌包重量的影響見圖2。

由圖2可以看出，菌包重量隨著培養時間的延長逐漸降低。23℃～32℃時菌包重量隨著培養時間的延長逐漸降低，32℃高溫使得菌包水分蒸發增多，菌包重量略低于23℃～29℃時菌包重量；35℃在整個培養階段重量均低于其他溫度，在100 d時菌包重量顯著下降。

2.2 后熟階段不同培養溫度菌包生理生化指標變化

2.2.1 pH 變化

斑玉蕈在生長過程中，利用大量的碳水化合物來維持菌體的生長和新陳代謝，同時會產生有機酸，使菌包pH下降[11]。菌包pH變化可一定程度反應菌絲消耗碳水化合物的情況。后熟階段不同培養溫度菌包pH變化見圖3。

從圖3可以看出，23℃～32℃時不同溫度菌包的pH隨著培養時間的延長逐漸下降，23℃、26℃、29℃時pH降低的速率相差不大，120 d時菌包pH均維持在5.7左右；32℃培養時，pH下降速度較為緩慢，120 d時菌包pH維持在6.26；35℃時pH先上升后在100 d時下降，120 d時pH為7.30，可能是由于霉菌感染導致斑玉蕈菌絲自溶，菌包pH上升，后期綠霉大量繁殖導致菌包pH下降。

2.2.2 還原糖含量變化

菌包中還原糖含量可以反應斑玉蕈菌絲對基質的營養利用情況，后熟階段不同培養溫度菌包還原糖含量變化見圖4。

從圖4中可以看出，23℃～29℃時菌包中還原糖含量逐漸上升后有所下降，且后熟期培養溫度越高，菌包內積累還原糖含量越高，其中29℃時，120 d菌包的包內還原糖含量達到了 1 770.56 mg·L-1；32℃時菌包還原糖含量隨培養時間延長逐漸積累，特別需注意的是100 d時還原糖含量顯著提升，在120 d達 2 070.56 mg·L-1；35℃時菌包還原糖含量在120 d時僅為395.00 mg·L-1，顯著低于其他試驗組。

2.2.3 可溶性蛋白含量變化

菌絲對培養基質的利用是通過分泌胞外酶來降解培養基質中的大分子物質，這些酶是菌包中可溶性蛋白的重要組成部分[12]。后熟階段不同培養溫度菌包可溶性蛋白含量變化見圖5。

由圖5可以看出，23℃～29℃時菌包培養溫度越高，可溶性蛋白含量越高，29℃時菌包可溶性蛋白含量 70 d 時達最高值 226.89 mg·mL-1；32℃培養時，可溶性蛋白含量先上升后下降，在100 d可溶性蛋白含量達到最大值 247.68 mg·mL-1；35℃時菌包可溶性蛋白含量隨培養時間延長逐漸升高，在110 d時達到 362.60 mg·mL-1。

2.2.4 關鍵基質降解酶活性變化情況

1）纖維素酶活力變化

羧甲基纖維素酶是一種誘導酶，分布于細胞外，通過降解培養基質中的纖維素，為菌絲生長提供能源[13]。不同溫度菌包的羧甲基纖維素酶隨著培養時間變化情況見圖6。

如圖6所示，23℃～29℃培養條件下羧甲基纖維素酶活力變化情況基本一致，隨培養時間的延長，各個溫度酶活力在一定范圍內上下波動，且培養溫度越高，羧甲基纖維素酶活力越強；培養溫度為32℃時，羧甲基纖維素酶活力明顯高于23℃～29℃的試驗組；35℃培養時，菌包中羧甲基纖維素酶持續升高且較其他培養溫度差異顯著。

2）木聚糖酶活力變化

木聚糖是木糖殘基以β-1，4木糖苷鍵連接構成，是植物細胞壁中半纖維素的主要成分，木聚糖酶通過分泌到胞外降解木聚糖，不同溫度對木聚糖酶活力影響見圖7。

如圖7所示，23℃～29℃培養條件下，木聚糖酶活力變化趨勢基本一致，隨培養時間的延長，木聚糖酶活力逐步增強；且隨培養溫度升高木聚糖酶活力同時也在增強；但與羧甲基纖維素酶不同的是，菌包培養溫度為32℃時，木聚糖酶活力明顯低于23℃～29℃試驗組；35℃培養時，菌包中木聚糖酶持續升高且較其他培養溫度差異顯著。

3）中性蛋白酶活力變化

中性蛋白酶是將蛋白質分解成小分子的短肽或氨基酸一類的代謝酶，其可以幫助菌絲有效利用氮源，在菌絲生長發育過程中發揮著重要的作用[14]。不同溫度對中性蛋白酶活力影響見圖8。

由圖8可知，23℃～29℃時中性蛋白酶活變化趨勢基本相同，隨培養時間延長酶活力逐漸降低，說明隨著培養時間的延長菌絲逐漸成熟，所需的氮源降低。培養溫度為32℃時，菌包中性蛋白酶呈逐漸下降趨勢，中性蛋白酶活力明顯低于23℃～29℃的試驗組。培養溫度35℃時，菌包中性蛋白酶活力于60 d～70 d時明顯下降，可能是由于高溫環境下，斑玉蕈菌絲迅速失活，蛋白酶活力下降；70 d～80 d時由于霉菌大量繁殖，分泌大量蛋白酶利用氮源，菌包蛋白酶上升，隨后菌包中氮源被大量消耗，中性蛋白酶活力下降。

2.3 后熟階段不同培養溫度對出菇及農藝性狀影響

斑玉蕈菌包培養過程中，不同培養溫度對出菇的影響見表1。

表1 不同培養溫度對斑玉蕈出菇的影響Tab.1 Effect of different culture temperature on fruiting of Hypsizygus marmoreous

從表1可看出，隨培養溫度提高，原基形成和采摘時間不斷延長。可能是由于斑玉蕈是一種低溫型變溫結實性食用菌，后熟階段培養溫度低，菌絲活力強，菌絲恢復速度快，出菇周期較短，故23℃～26℃時，出菇原基形成時間只需9 d，23℃時，采摘時間較對照可提前3 d，26℃時提前1 d。值得一提的是，產量與溫度在23℃～29℃時也呈現了極顯著的相關性（R=0.978），隨培養溫度升高，出菇產量和生物學效率也不斷提高。29℃時菌包單袋產量可達527.76 g，這是因為在一定范圍內，溫度越高，菌絲活力雖然較弱，出菇周期延長，但是菌絲分泌胞外酶活力較高，菌絲對營養成分的利用程度高，出菇產量高。但當溫度過高，達到32℃時，斑玉蕈菌絲生長緩慢甚至失活，出菇周期長，產量低，而35℃時因菌包中菌絲死亡，霉菌大量污染而無法進行出菇。

不同菌包培養溫度對斑玉蕈出菇外觀的影響見圖9，不同菌包培養溫度對斑玉蕈子實體農藝性狀的影響見表2。A、B、C、D分別表示23℃、26℃、29℃、32℃時菇體外觀情況。

表2 不同菌包培養溫度對斑玉蕈子實體農藝性狀的影響Tab.2 Effect of different culture temperature on quality of Hypsizygus marmoreous

由圖9、表2可以直觀地看出，菌包后熟溫度對斑玉蕈出菇外觀及農藝性狀有影響，23℃～29℃培養條件下，斑玉蕈子實體朵型適中，菌蓋厚度、大小、菌柄長度差異不顯著，出菇較為整齊；后熟溫度為32℃時，斑玉蕈子實體朵型明顯變小而且長度短，大部分菇小于成品菇（最小8 cm） 的長度要求，子實體菌蓋偏小、菌柄長度偏短，出菇子實體整齊度差。

3 結論與討論

目前，斑玉蕈生產過程中后熟階段的溫度主要憑經驗設置，如何科學合理的設置菌包后熟溫度是促進菌包生理成熟的關鍵。通過探究不同溫度條件下，斑玉蕈菌包后熟階段外觀、生理生化指標以及生物學效率的的變化情況，探索溫度影響斑玉蕈后熟階段的原因，可為工廠及時調整后熟階段培養溫度提供理論依據。

從不同溫度對斑玉蕈后熟階段菌包外觀和重量影響可以看出，隨培養溫度升高，菌包顏色加深，且重量逐漸減輕。其中，32℃時菌袋顏色較23℃～29℃時明顯加深，且菌包重量較輕，可能是由于斑玉蕈菌包在后熟的過程中，菌絲老化并分泌了一些次級代謝產物導致菌包顏色變黃[15]，且溫度過高導致菌包失水量大，菌包重量降低；當后熟溫度為35℃時，菌包在80 d時被綠霉感染，隨后蔓延。

不同溫度對斑玉蕈后熟階段pH、還原糖及可溶性蛋白含量的影響表明，23℃～29℃范圍內，pH隨培養時間增加不斷降低，還原糖、可溶性蛋白含量先上升后下降；且隨溫度升高，菌包內積累的還原糖、可溶性蛋白含量越高。當后熟溫度達32℃時，菌包pH下降速度緩慢，說明高溫會降低食用菌對營養成分的利用速率，這與王慶武[16]的研究一致；還原糖含量在100 d時顯著提高，可能是由于斑玉蕈菌絲老化，對基質利用情況減弱，導致還原糖生成速率大于吸收速率，菌包中還原糖積累；可溶性蛋白隨培養時間出現先增加后下降趨勢，表明溫度會抑制斑玉蕈菌絲生長，可通過可溶性蛋白含量提升來增加生物體抗性[17]；35℃培養時，由于菌包中霉菌滋生繁殖，由于斑玉蕈菌絲大量裂解，胞內酶溶出，霉菌滋生菌包使其營養被大量消耗，故pH及可溶性蛋白上升、還原糖含量下降。

不同溫度對斑玉蕈后熟階段關鍵酶活力的影響表明，培養溫度在23℃～29℃時，菌包中木聚糖酶、漆酶、錳過氧化物酶隨溫度的升高酶活力增強；32℃培養條件下，菌包纖維素酶活力較高，而中性蛋白酶力下降。可能是由于過高的溫度導致斑玉蕈菌絲對營養吸收能力下降，降低了對氮源的吸收利用，該現象在莫氏馬尾藻中也有出現[18]；當培養溫度達35℃時，菌包中纖維素酶與木聚糖酶活力上升，這可能是溫度過高，綠色木霉大量滋生導致[19]。

出菇研究結果表明，后熟時期培養溫度在23℃～32℃時可以正常出菇；培養溫度35℃時菌包中霉菌大量滋生無法正常出菇。29℃時出菇時間較23℃、26℃時長，但產量高。而32℃時由于菌絲體老化速度過快，出菇時間較長且生物學效率低，使子實體朵型小、成品菇少，且子實體整齊度差，該結果與菌包外觀、理化性質及酶活特性保持一致。

綜上所述，培養溫度在23℃～29℃時，菌包生物學參數一致，出菇周期與對照相同，且當溫度達到29℃時，出菇產量顯著提高。當溫度設置32℃時，菌包各參數與低溫相比存在較大差異，且產量顯著降低，說明適當的提高培養溫度有利于菌包后熟期營養成分積累，提高出菇產量。斑玉蕈菌包后熟期培養的極限溫度介于29℃～32℃。該結果有利于斑玉蕈生產企業的控制后熟階段溫度，為工廠化生產過程中后熟階段溫度的設置提供理論依據。