肌間刺缺失對斑馬魚骨骼發(fā)育的影響

楊 建 佟廣香 鄭先虎 孫志鵬 呂偉華 孫效文 匡友誼

(1. 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所, 哈爾濱 150070; 2. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306)

與其他脊椎動物相同, 斑馬魚(Danio rerio)的骨骼也是由軟骨和硬骨兩種組織組成的, 其中軟骨是由軟骨細胞組成, 硬骨則是由成骨細胞和破骨細胞構成。軟骨細胞和成骨細胞均起源于間充質細胞, 破骨細胞起源于髓單核細胞系[1]。間充質細胞在接收到分子信號后, 遷移至特定的部位, 隨后這些間充質細胞緊密濃縮形成成骨、軟骨的原基。在骨骼發(fā)育過程中, 這些原基會分泌一些轉錄因子,如TGF-β家族的多肽等, 用于起始和調控早期骨骼發(fā)育相關因子的表達[2—4]。其中, 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)是TGF-β超家族的一類生長因子。bmp2a、bmp4是BMPs家族的成員,bmp2a可促進間充質細胞分化形成成骨骨細胞, 缺少bmp2a會抑制骨祖細胞向骨細胞的分化;bmp4是軟骨內骨化的早期因子, 在原始間充質細胞、軟骨細胞和骨膜形成層、骨髓腔等部位均有表達[5—7]。此外, SMADs蛋白家族(Mothers against decapentaplegic protein, SMADs)是TGF-β超家族的重要細胞因子。研究認為BMPs信號通路的調控主要是依賴SMAD基因家族來引發(fā)細胞應答[8—10]; 其中,smad1是BMPs的通路受體底物, 能被BMP-I型受體磷酸化而被激活, 磷酸化的R-SMADs與受體分離, 而與smad4結合形成復合物, 隨后這一蛋白異二聚體進入核內, 與相關的轉錄基因結合并調控下游基因的表達[11—13], 如runx2a(runt-related transcription factor 2a)。runx2a是一種成骨特異性轉錄因子,其表達是間充質細胞向成骨細胞分化的重要標志。研究認為, 成骨細胞分化初期, runx2a起始骨基質蛋白的生成, 從而使成骨細胞向骨細胞轉化[14,15]。sp7(也稱osterix)是成骨細胞分化和骨骼形成的標記基因,runx2a能夠促進sp7基因的表達[14]。

肌間刺是影響鯉科魚類品質的重要因素之一,是鯉科魚類遺傳育種的重要目標性狀, 但因肌間刺位于體內, 科學家認為其起到支撐肌肉和力量傳遞的作用, 對肌間刺是否能進行選育, 以及肌間刺缺失后是影響否生長、脂肪酸、肌纖維等其他性狀的形成仍存在疑問。為探討這些問題, 本實驗室采用基因敲除和遺傳篩選技術, 獲得了1個可穩(wěn)定遺傳的斑馬魚肌間刺完全缺失突變系, 本研究利用該突變系和野生型斑馬魚, 從胚胎發(fā)育5個發(fā)育時期(3、6、12、24和72hpf)和胚后5個生長階段(15、30、45、60和75dpf), 對比分析了6個骨骼發(fā)育相關基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)的表達差異; 并結合胚后發(fā)育兩種肌間刺表型骨骼發(fā)育的情況, 初步評估了肌間刺缺失對斑馬魚除肌間刺外, 其他骨骼發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗魚準備

為了去除遺傳背景不同帶來的影響, 將基因敲除后獲得的斑馬魚肌間刺完全缺失突變型個體與野生型AB系個體雜交, 構建F2代家系。F2代家系自交可分別獲得25%的野生型、25%的突變型純合個體和50%雜合個體。將野生型個體和純合突變個體分別按雌∶雄比例1∶1構建實驗家系, 分別獲得14個突變型家系和13個野生型家系。養(yǎng)殖3個月后達到性成熟, 按家系配對繁殖并將受精卵置于28℃培養(yǎng)箱中孵化。破膜4d(即8dpf)后的仔魚置于靜水中養(yǎng)殖, 用草履蟲飼喂至20dpf, 轉入斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 并用豐年蟲投喂, 養(yǎng)殖水溫(27±1)℃, 光周期14 L∶10 D。

1.2 骨骼染色觀察

選擇3個野生型家系和3個突變型家系, 用于骨骼染色試驗。自8dpf開始, 至56dpf截止, 每隔6d采樣一次, 各家系隨機選擇5尾試驗魚用多聚甲醛固定。其中, 8—26dpf仔稚魚用4%多聚甲醛固定,32—56dpf幼魚用2%多聚甲醛固定, 避光保存2d。

采用阿爾新藍—茜素紅雙染色法進行骨骼染色。操作步驟如下: (1)8—26dpf 仔稚魚: a)脫水: 去除固定液, 用50%乙醇脫水, 輕微搖勻10min; b)染色: 將浸泡過的樣本用阿爾新藍-茜素紅混合液 (10 μL 0.5%的茜素紅溶液加入到1 mL 0.4%的阿爾新藍工作液混合) 染色過夜; c)漂白: 去除染液, 用蒸餾水洗去浮色, 加入漂白液(3%雙氧水, 2%氫氧化鉀溶液等體積混合配制), 室溫放置20min; d)透明: 去除漂白液, 用硬毛筆輕輕剝離魚體表面鱗片, 用透明劑Ⅰ(40%甘油與0.5%氫氧化鉀溶液等體積混勻配制)處理至魚體透明, 用透明劑Ⅱ(甘油與0.5%氫氧化鉀溶液等體積混勻配制)透明至透明劑不再變色;e)保存: 透明后的樣本于50%甘油和0.1%氫氧化鉀混合液中4℃長期保存。(2)32—56dpf 幼魚: a)脫水: 與仔稚魚相同; b)阿爾新藍染色: 去除50%乙醇, 用0.4%阿爾新藍染色1d; c)復水: 用50%和30%乙醇分別復水10min, 用去離子水清洗2h; d)消化: 用50 mg/mL的胰蛋白酶溶液消化過夜, 至日光燈下可見脊椎骨為宜; e)漂白: 同仔稚魚; f)透明與保存: 同仔稚魚。

用Olympus SZX2-TR30顯微成像系統(tǒng)觀察斑馬魚在不同生長階段骨骼發(fā)育情況。

1.3 基因表達檢測

胚胎發(fā)育階段: 按照斑馬魚胚胎發(fā)育分期[16],并結合鏡檢結果, 在受精后3(囊胚期)、6(原腸胚期)、12(體節(jié)期)、24(咽囊期)和72hpf(孵化期)5個發(fā)育時期采集胚胎樣本。隨機選擇3個突變型家系與3個野生型家系, 每個家系隨機選取發(fā)育正常的受精卵50粒, 用于總RNA的提取。胚后生長階段:隨機選擇3個野生型家系和3個突變型家系分5個生長階段(15、30、45、60和75dpf)進行骨骼樣品采集, 各家系子代隨機選擇3尾試驗魚, 冰凍處死后于冰上去除內臟、皮膚和肌肉等組織, 每個家系做1個混樣, 用于總RNA提取。采用Trizol法提取(Invitrogen, USA)總RNA, 采用High Capacity cDNA Reverse Transcription kits(Roache, USA)合成cDNA。

采用qRT-PCR方法檢測6個基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)的表達水平,擴增引物采用Primer3 plus設計(表1)。采用10 μL反應體系進行qRT-PCR實驗, 包括: 5 μL 2×Luna Universal qPCR Master Mix(NEB, USA), 0.25 μL 10 μmol/L的正向、反向引物, 1 μL 50 ng/μL cDNA,3.5 μL nuclease-free水。擴增條件為: 95℃預變性60s; 之后, 95℃變性15s, 60℃延伸30s, 循環(huán)40次。以gapdh為內參基因。

1.4 數據分析

采用2-ΔΔCt法[17]評估6個骨骼發(fā)育相關基因的表達水平, 采用T檢驗評估肌間刺缺失突變型個體和野生型個體間6個基因在胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育每個時期中的表達水平和時序表達差異(P＜0.05)。

表1 骨骼發(fā)育相關基因引物設計Tab. 1 Skeletal development related gene primers for qRT-PCR

2 結果

2.1 骨骼染色

染色結果顯示, 斑馬魚野生型與突變型個體除肌間刺外, 其他骨骼的發(fā)育基本保持一致。

(1)8dpf: 耳石已經骨化; 頭部骨骼、脊椎仍為軟骨狀態(tài), 脊椎四周有規(guī)則的凹凸, 髓弓、脈弓和尾椎以軟骨形式出現, 并由頭部向尾部發(fā)展(圖版Ⅰ-1、2)。(2)14dpf: 部分脊椎硬骨化, 并由頭部向尾部發(fā)展, 硬骨化的椎體約5—8個; 頭部骨骼如下咽骨開始出現部分硬骨化(圖版Ⅰ-3、4)。(3)20dpf:硬骨化的脊椎向尾部增加至20個左右, 頭部下咽骨硬骨化范圍增大, 前上頜骨和鰓蓋邊緣開始硬骨化(圖版Ⅰ-5、6)。(4)26dpf: 脊椎硬骨化的范圍擴大至約30個椎體, 前部骨節(jié)肋骨開始骨化, 尾鰭的鰭條基骨和鰭條骨也逐步開始硬骨化; 頭部鰓弓, 眼眶骨, 開始硬骨化(圖版Ⅰ-7、8)。(5)32dpf: 椎骨基本完成硬骨化, 肋骨、髓棘和脈棘骨化長度變大,尾鰭鰭條骨骨化完成, 背鰭和臀鰭的鰭條骨也開始逐步骨化, 棘和支鰭骨仍呈軟骨狀態(tài), 頭部上頜弓、前鰓蓋骨、鰓蓋骨和方骨等基本完成骨化(圖版Ⅰ-9、10)。(6)38dpf: 尾鰭骨化基本完成, 背鰭和臀鰭的鰭條和深入肌肉的棘硬骨化變長, 胸鰭開始骨化, 突變型腹鰭骨化早于野生型; 頭部前上頜骨、下咽骨、上眶骨、淚骨、眶骨、方骨、鰓蓋骨、下腮蓋骨、鰓條骨、前鰓骨等均已骨化, 頂部額骨、顱頂骨、外枕骨等仍未完全骨化(圖版Ⅰ-11、12)。(7)44dpf: 背鰭、臀鰭和腹鰭鰭條骨骨化基本完成, 僅余鰭條骨與支鰭骨連接的部位未骨化;野生型個體頭部僅剩顱頂骨未完全骨化, 突變型頭部骨化基本完成; 野生型個體肌間刺由尾部向魚體前部逐步骨化, 腹部骨化快于背部, 突變型斑馬魚無肌間刺骨化現象(圖版Ⅰ-13、14)。(8)50dpf: 野生型個體顱頂骨完全硬骨化, 腹部肌間刺基本骨化完成, 背部肌間刺骨化至背鰭前, 突變型斑馬魚肌間刺未出現骨化現象(圖版Ⅰ-15、16)。(9)56dpf:全身骨骼基本骨化完成, 僅剩背鰭、臀鰭、尾鰭少數支鰭骨未骨化, 野生型斑馬魚的肌間刺骨化也基本完成(圖版Ⅰ-17), 而突變型斑馬魚未有肌間刺形成(圖版Ⅰ-18)。

2.2 胚胎發(fā)育時期骨骼發(fā)育相關基因的表達

結果顯示,bmp2a、bmp4、smad1、smad4a在野生型和突變性個體中的表達, 及sp7基因在突變型個體中的表達均呈現先升后降的變化趨勢, 且在體節(jié)期(12hpf)達到最高表達水平; 而runx2a基因在野生型和突變型個體中的表達, 以及sp7基因在野生型個體中的表達則表現為逐漸上升的趨勢。對6個基因在野生型和突變型胚胎發(fā)育時期的表達水平進行對比分析發(fā)現, 在囊胚期(3hpf)和原腸胚期(6hpf)6個基因在兩種肌間刺表型間表達量無明顯差異, 在體節(jié)期(12hpf)、咽囊期(24hpf)和孵化期(72hpf)bmp2a的表達水平在兩種肌間刺表型間無明顯差異, 野生型個體bmp4、smad1、smad4a、runx2a基因在體節(jié)期(12hpf)、咽囊期(24hpf)和孵化期(72hpf)的表達水平明顯高于突變型, 而sp7基因則表現為突變型明顯高于野生型(圖1)。

2.3 胚后發(fā)育階段骨骼發(fā)育相關基因的表達

結果顯示,bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7基因在野生型和突變型斑馬魚個體5個胚后生長階段(15、30、45、60和75dpf)的表達均基本呈現出逐漸下降的的趨勢。兩種肌間刺表型間6個基因的表達在個別時期存在差異, 其中,bmp2a在45dpf時野生型個體表達量明顯高于突變型, 而bmp4則與之相反;smad1和smad4a則分別在30和15dpf表達量表現為野生型低于突變型; 此外,runx2a在15dpf時, 野生型個體在15和60dpf時的表達量表現為野生型高于突變型, 而sp7在15、30和45dpf 3個生長階段亦表現為野生型個體表達量顯著高于突變型(圖2)。

3 討論

本研究發(fā)現, 斑馬魚的骨骼發(fā)育具有特定的時空順序, 頭骨、脊椎骨和魚鰭骨骼基本遵循由頭部向尾部依次骨化的規(guī)律, 而肌間刺的發(fā)育則是由尾部向頭部依次骨化, 且腹部肌間刺的骨化快于背部;鰭條骨骼順序為尾鰭、背鰭、臀鰭、腹鰭、胸鰭。斑馬魚骨骼的骨化方式與其他脊椎動物相同,有軟骨內骨化和膜內骨化兩種方式[18—20], 斑馬魚的大部分骨骼(頭骨、脊椎骨和魚鰭骨骼等)均為需要經過軟骨階段的軟骨內骨化, 肌間刺不經過軟骨階段而由骨膜直接骨化形成。對于斑馬魚骨骼發(fā)育的研究, 許多國內外研究人員已經做了大量的工作。Cubbage和Mabee[21]對斑馬魚幼魚和成魚頭蓋骨和側鱗的骨化進行過了報道, Du等[18]對斑馬魚23dpf內個體縱軸骨骼的鈣化進行了描述, Yao等[22]則對斑馬魚肌間刺的發(fā)育模式進行了觀察。本研究觀察分析了斑馬魚骨骼從8dpf到52dpf的連續(xù)發(fā)育過程, 結論與已有文獻一致。此外, 本研究通過比較兩種肌間刺表型骨骼的發(fā)育過程發(fā)現, 頭骨、脊椎骨和魚鰭骨骼的發(fā)育基本保持一致, 故初步推測肌間刺的缺失不影響斑馬魚其他骨骼的發(fā)育。

圖1 胚胎發(fā)育階段不同肌間刺表型斑馬魚6個骨骼發(fā)育相關基因的表達Fig. 1 Expression of 6 skeleton development related genes in different embryonic development stages

研究發(fā)現, 斑馬魚胚胎發(fā)育至48—52hpf的胚胎中就已存在未發(fā)育的由軟骨因子組成的骨架, 具有基舌骨等頭部骨骼, 脊索僅為軸向支撐結構[23,24]。這與本研究中野生型斑馬魚6個骨骼發(fā)育相關基因的表達變化相一致。胚胎發(fā)育時,bmp2a、bmp4、smad1和smad4a基因相繼激活并發(fā)揮作用[4,13]。骨骼發(fā)育的結果發(fā)現, 野生型和突變型斑馬魚bmp2a、bmp4基因在胚胎發(fā)育5個發(fā)育階段的變化趨勢分別與smad1、smad4a相一致; 胚后發(fā)育過程5個生長階段的變化趨勢也基本呈現一致的變化趨勢, 這一結果與已有文獻一致[8,25]。此外, 野生型斑馬魚個體中runx2a和sp7基因的表達也呈現持續(xù)上升的趨勢, 雖然bmp2a基因的表達水平在12hpf后有所下降, 但仍保持較高的表達水平; 胚后發(fā)育過程中,runx2a與sp7基因的表達水平則隨著BMPs家族基因和SMAD家族基因表達水平的降低而隨之下降, 與已有文獻報道一致[8,9]。

胚胎發(fā)育階段, 兩種肌間刺表型6個基因在在囊胚期(3hpf)和原腸胚期(6hpf)表達量無明顯差異,在體節(jié)期(12hpf)、咽囊期(24hpf)和孵化期(72hpf)bmp2a基因表達無明顯差異,bmp4、smad1、smad4a、runx2a基因表現為野生型明顯高于突變型, 而sp7基因則表現為突變型明顯高于野生型, 表明肌間刺的缺失對6個基因的表達存在一定程度的影響; 胚后生長階段, 6個基因的表達水平僅在個別生長階段差異顯著。綜合基因表達與骨骼染色情況發(fā)現, 雖然在胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育階段, 骨骼發(fā)育相關基因的表達在兩種肌間刺表型間存在一定的差異, 但是骨骼染色結果顯示兩種表型骨骼發(fā)育并無明顯差異, 推測肌間刺發(fā)育關鍵基因的突變對骨骼發(fā)育的影響主要在胚胎發(fā)育階段。此外, 在胚胎發(fā)育過程中,runx2a的表達趨勢為野生型個體高于突變型,而sp7則剛好與之相反; 在胚后生長階段個別時期(15dpf)則表現為表達趨勢相同, 推測在胚胎發(fā)育過程肌間刺關鍵基因的突變導致的runx2a基因的表達下調由sp7的高表達進行了補償; 而在胚后階段runx2a和sp7基因在突變型中的低水平表達并未影響骨骼發(fā)育過程, 可能是由于其他調控途徑激活了smad1和smad4a基因的上調, 補償了runx2a和sp7基因的表達下調。綜上, 肌間刺發(fā)育關鍵基因的突變對斑馬魚骨骼發(fā)育無顯著影響, 而對于肌間刺關鍵基因的缺失的影響及表達調控仍需進一步研究證實。

圖2 胚后生長階段不同肌間刺表型斑馬魚6個骨骼發(fā)育相關基因的表達Fig. 2 Expression of 6 skeleton development related genes in different postembryonic development stages

圖版 Ⅰ 野生型與突變型斑馬魚骨骼發(fā)育過程Plate Ⅰ Development of the wildtype and mutant zebrafish skeleton