鰱EST-SSR標記的開發及其與生長性狀關聯性分析

王 丹 鄒桂偉 羅相忠

(中國水產科學研究院長江水產研究所, 武漢 430223)

鰱(Hypophthalmichthys molitrix), 是我國“四大家魚”之一, 是老百姓重要的動物蛋白來源之一。近年來, 人工近親繁殖和親本選育等問題已導致鰱的主要經濟性狀退化、生長速度減慢、性成熟個體變小、抗逆性下降等問題, 環境污染導致鰱天然種群數量明顯下降和種質資源破壞較嚴重[1,2]。然而利用傳統的育種技術培育優良品種或品系需要進行多代選育, 費時費力。分子標記輔助育種技術可快速、準確地檢測到與性狀基因緊密連鎖的分子標記, 在親子鑒定、回交育種、雜種優勢預測和品種鑒定等各個育種階段發揮重要作用, 從而加速育種進程, 提高育種效率[3]。開展鰱功能基因組學研究, 篩選鑒定鰱生長相關的分子標記及QTL, 對鰱的分子標記輔助育種體系具有重要的理論意義和生產價值。

分子標記可按有無基因功能分為Type Ⅰ與Type Ⅱ標記兩大類。Type Ⅰ標記指來源于基因編碼區, 與功能基因相聯系的標記; Type Ⅱ標記則指與未知功能片段關聯的標記。Type Ⅰ標記在群體遺傳研究、比較基因組學研究、基因組進化研究、候選基因鑒定、數量性狀位點定位、分子標記輔助育種等方面比Type Ⅱ標記更具優勢[4]。

來自EST的SSR標記通常被稱作EST-SSR標記,屬于Type Ⅰ標記, 它結合了SSR和EST標記的優點:(1)如果發現某個EST-SSR標記與某個遺傳性狀相連鎖, 這個EST可能是直接影響這個性狀的基因片段。(2)EST來自基因編碼區, 具有一定的保守性,因此在近緣種中有良好的通用性。(3)利用ESTSSR標記進行種群遺傳多樣性分析時, 所揭示的是在不同群體中基因的功能多樣。

在遺傳連鎖圖譜構建和分子標記輔助育種研究中, Liu等[5]報道了15個二堿基重復的EST-SSR標記用于斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的圖譜構建。Wang等[6]用數據挖掘的方法得到25個鯉(Cyprinus carpioL.)的EST-SSR標記, 其中有23條ESTSSR序列與已知基因功能相關, 如編碼新陳代謝的酶、抗病因子、結構蛋白、以及轉錄因子等。Fuji等[7]得到牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗淋巴囊腫病的微衛星標記, 利用這個位點輔助培育的牙鲆品種在日本市場的占有率為35%。魯翠云等[8]找到4個QTL位點與鏡鯉的體質量、體長性狀具有相關性,可作為指導鏡鯉家系選配的首選標記用于新品系培育。郭薇等[9]研究篩選出與鯽(Carassius auratus)體重、體厚、生長相關的EST-SSRs標記及基因型,為鯽的分子標記輔助育種及目標性狀的遺傳改良提供依據。

在種質資源研究中, Vasemg等[10]將EST-SSR標記用于分析波羅的海五個大西洋鮭(Salmo salarL.)自然群體和四個人工養殖群體的遺傳多樣性和遺傳分化, 結果發現人工養殖群體中有一個等位基因丟失。魯翠云等[11]用鯉的EST-SSR引物分析了長江鯉和黑龍江鯉的種群結構, 找到2個位點在長江鯉的多態信息含量明顯高于黑龍江鯉, 可以作為兩個群體的鑒別。赫崇波等[12]用EST-SSR標記對我國斑點叉尾鮰種質資源進行評估, 認為斑點叉尾鮰的遺傳分化程度很弱。鄭國棟等[13]利用EST-SSR標記對不同地域草魚(Ctenopharyngodon idellus)群體進行鑒定和遺傳多樣性分析, 對草魚的種質資源保存、種群鑒定和良種選育具有重要意義。

迄今, 有關鰱在遺傳連鎖圖譜構建[14—16]和種質資源遺傳結構[1,2,17]的研究中已取得重要進展, 但是缺乏分子標記輔助育種的研究。本實驗通過鰱的卵組織轉錄組數據挖掘EST-SSR標記, 從中篩選出與生長性狀相關或連鎖的位點, 探討其用于分子標記輔助育種的應用潛力, 為鰱遺傳育種的親本選擇提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗

用于檢測引物多態的鰱采自石首老河野生群體共16尾。轉錄組測序材料和構建全同胞家系的實驗魚由中國水產科學研究院長江水產研究所窯灣試驗場提供。轉錄組測序材料取自鰱的卵組織。TaKaRa試劑盒提取總RNA, 反轉錄得到cDNA,對cDNA片段進行末端修復并連接測序接頭, 進行Illumina HighSeq 2000高通量測序。本實驗構建鰱的全同胞家系, 隨機挑選子代共計144尾。采集的鰭條置于95%的酒精中。基因組DNA的提取參照鹽析法[18]。對144尾鰱的外觀性狀體長和體重進行測量, 并計算肥滿度(K=100W/L3,W為體重,L為體長)。

1.2 實驗方法

轉錄組測序和微衛星的查找將測序原始數據進行初步拼接, 去除低質量和短序列, 獲得高質量的序列, 然后進行參考序列組裝和de novo組裝。基于轉錄組SSR檢測是以組裝出來Unigene作為參考序列, 用SSR軟件MicroSatellite (MISA)來找出所有的SSR。Primer 6設計鰱EST-SSR引物。

PCR反應條件94℃預變性5min; 94℃變性35s, 退火溫度為35s, 72℃延伸50s, 循環35次; 最后72℃終延伸10min。PCR反應體系: 總體積25 μL,包括大約20 ng總DNA, 上、下游引物各1 μL(5 μmol/L), 1 μL dNTP(10 mmol/L), 0.6UTaq聚合酶(TIANGEN), 2.5 μL緩沖液(含Mg2+1.5 mmol/L)。本實驗參照Schuelke[19]發明的單管巢式PCR擴增方法進行基因型分型研究, GeneMapper4.0分析基因型數據。

數據處理與分析多態位點和生長性狀指標的關聯性分析用SPSS軟件中的廣義線性模型(General linear model)處理。顯著性檢驗用新復極差法(Duncan’s new multiple range test)[20]。

2 結果

2.1 鰱轉錄組序列特征

通過Illumina Hiseq2000平臺測序, 總計產出28691557200nt數據。組裝結果總Unigene77129個,總長98834445nt, 平均長度1281nt, N50達到2228nt。Unigene功能注釋, 注釋到NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO庫的Unigene分別是46540個、64879個、41522個、35574個、16426個、30224個,所有注釋上的Unigene是66985個。預測編碼蛋白框(CDS), 比對到蛋白庫的CDS有46113個, 預測出的CDS有1512個, 共47625個。SSR共24458個, 占所測EST數據的31.7%。

鰱轉錄組微衛星類型特征如圖1所示。鰱包含SSR的EST序列主要有二堿基、三堿基、四堿基和五堿基組成。二堿基中, AC/GT含量最豐富, CG含量最少。三堿基重復的序列最多類型是ATC和ATG。

2.2 鰱EST-SSR多態篩選

我們從所測序列挑選175條鰱的EST進行SSR引物設計。PCR檢測結果顯示, 共有148對引物有擴增產物, 其中單態有60對, 雜帶有52對, 多態有36對。36對多態引物的核心重復類型、退火溫度、引物序列和Blast結果見表1。

2.3 與生長性狀相關的關聯性分析

我們一共測量了144尾鰱。體長最大值為17.0 cm,最小值為11.2 cm, 平均值為14.1 cm;體重最大值是82.3 g, 最小值為25.8 g, 平均值為49.4 g; 肥滿度最大值為2.07, 最小值為1.41, 平均值為1.7(表2)。

本研究共篩選得到兩個與鰱生長性狀有關的SCE位點, SCE26和SCE65。如表3所示, 2個SCE位點按基因型分類, SCE26位點有3種基因型, A148-148、A148-154和A154-154。其中A148-154為優勢基因型, 基因頻率為0.68。基因型A148-154和A154-154與體長和體重性狀差異顯著, 而與肥滿度性狀無相關性。

SCE65有四種基因型, A149-157、A157-159、A149-159和A159-159, 與體長和體重性狀均無顯著相關性, 但基因型A149-159和A159-159與肥滿度性狀差異顯著。

圖1 鰱轉錄組數據微衛星類型特征Fig. 1 Characterization of SSR from silver carp transcriptome data

表1 鰱36對EST-SSR引物特征Tab. 1 Characterization of 36 EST-SSR in silver carp

續表1

表2 144尾鰱測量指標Tab. 2 Measurements from 144 silver carp individuals

3 討論

3.1 鰱卵組織轉錄組的微衛星分布特點

Serapion等[21]的方法從斑點叉尾鮰開發TypeⅠ標記(EST-SSR), 首次報道魚類用此方法研究的先例。隨后, 在其他魚類[22—24]、蝦類[25,26]和貝類[27]中也有EST-SSR標記開發報道。本研究, 我們得到的結果有31.7%的鰱EST序列包含SSR, 這個比例遠遠高于斑節對蝦(13.7%)[26]、河豚(11.5%)[28]和斑點叉尾鮰(11.2%)[21]、中國對蝦(2.2%)[29]、海灣扇貝(4%)[27]和真鯛(4%)[24]。植物包含SSR的EST序列百分比在1%—5%[30,31]。可見, 水生生物包含SSR的EST序列是非常豐富的。本研究中SSR豐富度較高, 可能是因為測序方法、序列拼接方式和計算法則更優化, 去除了更多的冗余數據, 提高了SSR的百分比。也有可能是鰱卵組織EST序列的一個自身特點, 有待我們進一步研究。

3.2 鰱轉錄組微衛星分布類型和多態率

大多數動物的EST數據庫中SSR核心重復類型以二堿基居多數, 而植物則是三堿基重復最豐富[30,31]。在鯉科魚中, 包括非編碼區SSR和編碼區SSR中的研究[28,32], 二堿基CA重復的序列最多[6,33,34]。也有少數學者提出相反觀點, 認為AT二堿基重復次數最常見[22]。在本研究中, 鰱EST數據中二堿基CA重復次數最多, 與大部分鯉科魚類研究相同。

多態位點不僅僅依賴于核心重復次數, 有些二堿基重復五次檢測結果是多態, 而重復六次甚至更多卻是單態[35,36]。編碼區的突變概率要小于非編碼區, 源于基因受選擇壓力的影響[35]。與Type Ⅱ標記的SSR(來自非編碼區)相比, EST-SSR的多態比例略低[25,37]。本研究的結果, 共設計了175對ESTSSR引物, 有148對有擴增產物, 說明測序的EST質量是可靠的。多態有36對, 占總比例24.3%; 單態有60對, 占40.1%, 可能是源于基因的保守性。有27對無擴增產物, 可能是因為引物設計位點跨外顯子擴增[37]。

表3 鰱生長性狀有關的EST-SSR多態位點信息Tab. 3 Effects of EST-SSR polymorphisms on growth traits of silver carp

3.3 鰱生長性狀相關的功能基因標記

本研究共篩選得到兩個與鰱生長性狀有關的EST-SSR位點, SCE26和SCE65。如表3所示, 兩個位點按基因型分類, SCE26位點A148-154為優勢基因型, 基因型頻率為0.68。A148-154與A154-154的體長和體重差異顯著, 而肥滿度無相關性。SCE65的基因型A149-159和A159-159的肥滿度差異顯著, 體長和體重則無顯著相關。群體的等位基因頻率受人工選擇、親本數目及隨機遺傳漂變的影響較大[38]。本研究的實驗材料144尾鰱不受這些情況的影響。因此, 可以排除上述可能干擾等位基因頻率的因素。

候選基因的效應可能只存在某個群體或者特定世代, 即這種數量性狀的連鎖關系需要在該群體子代、同品種不同群體及不同品種中進行驗證[39]。因此本研究對鰱微衛星的多態位點與外觀性狀的關系將進一步驗證, 以期得到更準確的結果。這兩個標記有可能作為生長有關的候選基因, 進行鰱分子標記輔助育種研究。

有關鰱EST-SSR標記的報道比較少。Wang等[6]用鯉的EST-SSR引物對鰱進行跨種擴增研究, 得到的EST-SSR多態率偏低。Guo等[16]構建鰱的微衛星文庫, 篩選的大部分EST-SSR引物以GT二堿基核心重復為主。本研究直接從鰱的轉錄組測序產物中尋找SSR進行驗證, 屬于測序的副產品研究, 省時省力, 且涉及的引物核心重復序列覆蓋二堿基、三堿基、四堿基和五堿基。

Blast結果顯示, 36條鰱EST-SSR序列中有10條序列確定已知基因功能, 如轉運蛋白、蛋白激酶、去甲基化酶及白細胞介素等, 有助于已知功能基因的定位。在目前的研究中, 關于鰱生長、繁殖、抗病等分子標記的相關報道較少。可根據不同的生產目的選擇相應的基因型標記進行標記輔助育種研究, 重點研究生長速度快、耐低氧、抗病性強的基因, 全基因組測序工作的開展, 將加快研究進程。