基于固相微萃取-氣相色譜-質譜與電子鼻技術分析發酵乳中的揮發性風味物質

李婷，田佳樂，劉洋，李嘉雯，喬少婷，丹彤，孫天松*

1(乳品生物技術與工程教育部重點實驗室(內蒙古農業大學)，內蒙古 呼和浩特，010018) 2(農業農村部奶制品加工重點實驗室(內蒙古農業大學)，內蒙古 呼和浩特，010018)

發酵乳指牛乳或復原乳經殺菌、冷卻、接菌發酵而制成的乳制品。德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)是常用發酵劑菌種，發酵過程中產生乙醛、雙乙酰等風味化合物，賦予產品良好風味。

產香特性是篩選發酵劑菌株的重要指標。揮發性化合物的種類、含量及感覺閾值之間的相互作用決定著風味[1]。一般采用氣味活度值(odor activity value，OAV)評價揮發性物質對風味的貢獻程度，OAV越大對總體氣味貢獻越大。OAV≥1的關鍵性風味物質，對發酵乳風味有重要貢獻作用； 0.1≤OAV<1的物質對總體風味有重要修飾作用[2-3]。

固相微萃取-氣相色譜-質譜(solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)聯用技術與電子鼻技術2種手段的配合有利于從宏觀和微觀上全面研究食品風味，是檢測食品風味物質的主要手段[4]。目前，該方法被廣泛用于各種食品風味的檢測。例如榮建華等[5]采用SPME-GC-MS與電子鼻技術對脆肉鯇魚肉揮發性風味成分進行檢測，發現脆肉鯇魚肉主體風味成分是壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇等化合物。范霞等[6]利用這種技術測定茶葉中香氣成分，發現主要成分肉豆蔻酸異丙酯、β-紫羅蘭酮、(E,E)-3，5辛二烯-2-酮的相對含量高，香氣成分含量的差異造成了不同茶葉品種的風味特征。

風味是決定發酵乳品質的重要因素，然而采用SPME-GC-MS和電子鼻等技術聯合分析發酵乳中風味物質的報道較少。本研究采用SPME-GC-MS結合電子鼻技術檢測分析復配發酵乳中的揮發性風味物質，通過主成分分析、線性判別分析等不同統計學方法，揭示不同復配發酵劑在發酵過程中產生的風味間存在的差異，篩選出風味優良的菌株，以期為發酵劑的篩選及應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株來源

實驗所用菌株信息如表1和表2所示，由乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種資源庫提供；商業對照菌株JD，科漢森(中國)有限公司。

表1 試驗菌株來源信息Table 1 The information of experimental strains

表2 復配菌株編號Table 2 The numbers of compound strains

1.1.2 主要試劑

C3-C9正構烷烴混標(AccuStandard，USA)，C10-C25正構烷烴混標(AccuStandard，USA)、1，2-二氯苯(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；脫脂奶粉，新西蘭恒天然公司；M17液體培養基，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；MRS液體培養基，賽默飛世爾科技(北京)有限公司；實驗氣體為高純氦(純度>99.999%)。

1.1.3 儀器與設備

ZHJH-C1214C型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；CP2202C型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；DHP-9272型生化培養箱，上海一恒科技有限公司；SRH 60-70型高壓均質機，上海申鹿均質機有限公司；7890B GC-5977A MSD型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；PEN3型電子鼻，德國AIRSENSE公司，電子鼻各傳感器的名稱及性能描述如表3所示。

表3 PEN3電子鼻傳感器名稱及性能描述Table 3 Description of the sensors and their performance of electronic nose

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化及菌懸液制備

真空冷凍干燥保藏的德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌分別接種于MRS和M17液體培養基，37 ℃培養24 h，連續傳3代，使菌株活力達最大。在50 mL和500 mL MRS液體培養基中擴大培養(37 ℃，24 h)，離心(4 000 r/min，10 min)收菌體，重懸于PBS保護劑制備菌懸液，4 ℃備用。

1.2.2 發酵乳制備

適量蒸餾水加熱至50 ℃，加11.5%(質量分數)脫脂乳粉攪拌溶解，水溫升至60 ℃加6.5%(質量分數)蔗糖，水合30 min且溫度保持在60 ℃，連續均質2次(65 ℃，15 MPa和35 MPa)，巴氏殺菌(95 ℃，5 min)，急冷，4 ℃備用。以嗜熱鏈球菌添加量5×107CFU/mL為基準，德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌以1∶1 000復配，接種于脫脂乳中，分裝至15 mL樣品瓶在42 ℃發酵。待pH達發酵終點4.5左右且酸度(total acidity，TA)達70～90 °T，冷卻樣品，-20 ℃保存。測定揮發性風味化合物。

1.2.3 揮發性風味物質的測定

7890B氣相色譜儀和5977A質譜儀測定發酵乳的揮發性風味化合物。萃取頭(50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷)在氣相色譜儀進樣口(250 ℃)老化5 min，插入氣相瓶萃取樣品的風味化合物。萃取條件為溫度50 ℃，磁力攪拌器轉速300 r/min，萃取時間60 min。柱溫采用程序升溫，初始溫度35 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升至140 ℃，保持2 min以10 ℃/min速率升至250 ℃。實驗使用載氣高純氦氣，載氣流速1.0 mL/min，不分流進樣。汽化室溫度250 ℃。電離方式EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍m/z35～500，發射電流100 μA，檢測電壓1.4 kV，無溶劑延遲。

1.2.4 定性與定量分析

利用隨機攜帶Masshunter工作站NIST 11標準庫自動檢索各組分質譜結果，根據保留時間計算保留指數(retention index，RI)，參考相關文獻報道的RI值鑒定發酵乳樣品中的揮發性風味物質。保留指數計算如公式(1)所示：

(1)

式中：RT，保留時間，min；正構烷烴碳原子數保留時間遵循RTz

內標1，2-二氯苯溶液加入發酵樣品。采用峰面積歸一化法計算所有組分的相對峰面積比。樣品中各組分風味物質濃度計算如公式(2)所示：

(2)

式中：ci，樣品中各揮發性風味化合物濃度，μg/L；cs，1，2-二氯苯濃度，μg/L；Ai，樣品中待測物質對應色譜峰面積；As，內標色譜峰面積。

1.2.5 電子鼻對發酵乳揮發性物質的分析

稱10 g發酵乳于50 mL頂空瓶密封，42 ℃水浴30 min，插入電子鼻探頭，用10個金屬傳感器進行測定。電子鼻測定條件為傳感器清洗時間60 s；樣品準備時間5 s；測定時間90 s，內部流量300 mL/min，進樣流量200 mL/min。

1.3 數據統計分析

使用Microsoft Excel、電子鼻設備自帶Win Muster和Origin 7.5處理與分析數據，繪制主成分分析(principal component analysis，PCA)圖、線性判別分析(Linear discriminant analysis，LDA)圖、雷達圖。

2 結果與分析

2.1 復配發酵乳中揮發性風味物質SPME-GC-MS檢測結果

采用SPME-GC-MS技術檢測分析對照菌株JD和6組復配發酵乳中的風味物質，共檢測到116種揮發性風味物質(表4)，主要包括酸類、醛類、酮類、醇類、酯類、烷烴及含氮等化合物。

酸類化合物來源脂肪分解和微生物發酵等代謝途徑[7]。由表4可知，對照菌株JD和6組復配發酵乳共檢測到17種酸類化合物，主要有3-甲基丁酸、乙酸、己酸和辛酸。其中，A3、A4、A5和A6發酵乳酸類化合物的種類和含量明顯高于對照菌株JD，特別是A6發酵乳總含量最高，質量濃度為280.11 μg/L。辛酸具有水果和焦糖香味[8]，對照菌株JD和6組復配發酵乳均檢測到辛酸，其中，A6發酵乳辛酸質量濃度最高，為89.01 μg/L。3-甲基丁酸具有辛辣氣味和酸味[9]，在所有樣品中，僅A1發酵乳檢測到3-甲基丁酸，質量濃度為13.48 μg/L。高濃度乙酸具有尖酸、辛辣、刺激性氣味[10]，對發酵乳口感影響較大。A3、A4、A5和A6發酵乳均檢測到乙酸，質量濃度分別為20.57、2.44、3.65和8.73 μg/L。己酸是發酵乳重要的酸類化合物，具有香甜的干酪香氣[11-12]。A4、A5和A6發酵乳中檢測到己酸含量相對較高，質量濃度分別為66.84、51.36和107.50 μg/L。類似結果在牛婕等[13]的研究中也有發現。

醛類化合物閾值低，對發酵乳風味貢獻較大[14]。對照菌株JD和6組復配發酵乳共檢測到11種醛類化合物。其中，3-甲基丁醛、苯甲醛和正壬醛OAV>1。3-甲基丁醛具有麥芽香味[15]。A1、A3和A5發酵乳中檢測到3-甲基丁醛，質量濃度分別為1.14、0.68和4.19 μg/L。苯甲醛是發酵乳常檢測到的重要化合物。低濃度苯甲醛賦予發酵乳杏仁香味，高濃度則具有水果香氣[16]。除對照菌株JD和A4外，其余菌株發酵乳中均檢測到苯甲醛，特別是A2和A5發酵乳苯甲醛顯著高于其他菌株，質量濃度分別為3.20和3.39 μg/L。正壬醛閾值較低，賦予發酵乳柑橘香與脂肪香[17]。A2、A5和A6發酵乳中檢測到正壬醛質量濃度相對較高，分別為2.27、1.42和1.13 μg/L。OAV>0.1的醛類物質有4種，分別為乙醛、3-羥基丁醛、庚醛和癸醛。乙醛是重要的風味化合物，對發酵乳風味影響較大[18]。所有發酵乳樣品中，僅A1發酵乳檢測到乙醛。庚醛主要來源于脂肪酸的自動氧化與乳酸菌代謝，賦予發酵乳脂肪香味[19]。A3和A5發酵乳檢測到庚醛，質量濃度分別為1.25和0.72 μg/L。3-羥基丁醛化學性質不穩定，易被還原成酸類和醇類化合物[20]。在對照菌株JD、A1和A4發酵乳中均檢測到3-羥基丁醛，質量濃度分別為4.88、0.48和0.98 μg/L。所有樣品中，僅A2發酵乳檢測到癸醛，其質量濃度為0.90 μg/L。

酮類化合物指不飽和脂肪酸經過氧化、熱降解及氨基酸降解等一系列化學反應形成的化合物[21-22]。由表4可知，酮類化合物共17種。其中，關鍵性酮類化合物(OAV>1)有3種，分別為雙乙酰，乙偶姻和2-壬酮。雙乙酰被認為是發酵乳風味形成的關鍵性風味物質，賦予發酵乳奶油與堅果仁風味[23]。除A3發酵乳外，其他菌株發酵乳中均檢測到雙乙酰，其中，A6發酵乳雙乙酰質量濃度最高，達110.03 μg/L。乙偶姻主要由2,3-丁二酮降解和α-乙酰乳酸經脫羧生成[24]。所有菌株發酵乳中均檢測到乙偶姻，其中，A4和A6發酵乳中乙偶姻質量濃度明顯高于對照菌株JD，分別為179.37和134.55 μg/L。2-庚酮和2-壬酮均是發酵乳風味中的重要風味物質，賦予發酵乳奶油香味和果香。對照菌株JD和6組復配發酵乳中均檢測到2-庚酮和2-壬酮，其中，A6發酵乳中2-庚酮和2-壬酮質量濃度最高，分別為18.24和17.53 μg/L。

醇類化合物生成可能與乳糖代謝、甲基酮還原、氨基酸代謝、亞油酸和亞麻酸降解有關[25]。在對照菌株JD和所有發酵乳中共檢測到15種醇類物質。本實驗檢測到一些含量較高的醇類物質，如1-己醇、1-庚醇、2-乙基-1-己醇和1-辛醇等，但風味閾值高，對發酵乳風味貢獻較低。

酯類物質由脂肪酸和醇酯化產生。本實驗中共檢測到11種化合物，其中，A6發酵乳中檢測到的乙酸壬酯質量濃度最高為12.41 μg/L。

烷烴類化合物和含氮類化合物風味閾值高，對發酵乳風味的形成影響不明顯，但一定濃度的這些物質可使發酵乳口感更加飽滿[26]。

一些主要風味化合物OAV值如表5所示。發酵乳風味由揮發性物質的含量和閾值共同決定。OAV指香氣濃度與其閾值的比值。通常認為OAV≥1的化合物對發酵乳風味貢獻較大，0.1≤OAV<1的化合物對發酵乳風味起重要修飾作用。

表4 發酵終點時發酵乳中揮發性風味化合物SPME-GC-MS鑒定結果Table 4 Volatile compounds of the fermented milk at the end of fermentation identified by SPME-GC-MS

續表4

序號中文名稱分子式保留時間/min計算RIa參考RIb鑒定方法c質量濃度/(μg·L-1)JDA1A2A3A4A5A671-庚醇C7H16O13.43984.08975MS,RI1.730.50.91.082.21.823.5682-乙基-1-己醇C8H18O16.181064.9nfMS2.760.962.31.622.963.455.2791-辛醇C8H18O16.891086.21087MS,RI1.530.520.840.721.71.942.78102-壬醇C9H20O17.2410971098MS,RI-0.88-2.08---112,6-二甲基-1,7-辛二烯-3-醇C10H18O18.471136.651095(Equity-5)MS,RI-----1.755.46122-丁基辛醇C12H26O18.471136.75nfMS0.31-0.770.9-0.941.1513環丁醇C4H8O19.831181.18nfMS---1---142-丙基-1-庚醇C10H22O20.031187.78nfMS-0.33-1.26---155,8-二乙基-6-十二烷醇C16H34O31.791641.17nfMS---0.7--- 酯類化合物 1甲酸乙烯酯C3H4O22.45611.08nfMS-----91.27-2sec-亞硝酸丁酯C4H9NO22.7630.25542(OV-101)MS,RI---30.16---32-丙烯酸丁酯C7H12O211.42929.73902MS,RI--1.96--0.91-4乙酸辛酯C10H20O220.3411981200MS,RI-----0.85-5乙酸壬酯C11H22O220.651208.68nfMS11.952.26---9.5612.416戊酸辛酯C13H26O221.661244.41nfMS---0.73---7戊酸,2,2,4-三甲基-3-羥基-異丁酯C12H24O326.351415.79nfMS--1.51----8草酸,十二烷基2-乙基己基酯C22H42O431.831643.6nfMS--0.71-0.331.011.19戊酸,2,2,4-三甲基-3-羧基異丙基,異丁基酯C16H30O431.991653.11581(DB-5)MS,RI0.550.451.980.882.091.912.8610癸酸癸酯C20H40O232.761698.87nfMS0.42-----1.2811鄰苯二甲酸,丁基十一烷基酯C23H36O436.82035.72nfMS--0.77---- 烷烴化合物 12,3-環氧丁烷C4H8O1.99--MS-33.37-----2正己烷C6H142.59621.5nfMS-15.93-26.65---3庚烷C7H164.21720.5nfMS---0.56---46,7-二氧雜雙環[3.2.2]8-壬烯C7H10O25.49764.52nfMS-----2.75-5甲苯C7H86.47798.4787.7MS,RI-0.6---1.320.4561,3,5-環庚三烯C7H86.61802.47800(SE-30)MS,RI--0.620.7--1.1272-甲氧基丁烷C5H12O7.62829.03nfMS--12.23-2.9241.02-81-乙丁基過氧化氫C6H14O27.89836.27965(CPSil8CB)MS,RI-0.3-----9乙苯C8H1010.01891.92871MS,RI-0.66-1.56---10鄰二甲苯C8H1010.36901.13902MS,RI-2.96-----11對二甲苯C8H1010.42902.9899MS,RI-2.59-1.74-1.31.2512正十二烷C12H2617.111092.93nfMS0.34------132,4,6-三甲基癸烷C13H2817.9111181121MS,RI--1.60.62-0.81-14正十一烷C11H2418.451136.19nfMS0.53-0.77-0.32--156-甲基庚基乙烯基醚C10H20O18.491137.53nfMS-----1.17-164,6-二甲基十二烷C14H3023.841322.611325(DB-5MS)MS,RI0.45------173-乙酰氧基十二烷C14H28O224.121333.41nfMS------0.4418正十四碳烷C14H3027.051439.74nfMS0.39------194,6-二-叔丁基間甲酚C15H24O29.291521.14nfMS2.171.013.531.833.161.644.93202,6,11-三甲基十一烷C15H32301551.91nfMS---0.76---212,4-雙(1,1-二甲基乙基)-苯酚C14H22O30.251563.031525MS,RI0.860.273.451.11-0.792.6222丁基羥基甲苯C15H24O30.331566.611533.3MS,RI113.9232.72106.4124.89117.5710.9397.32233-[(乙烯基氧基)甲基]-庚烷C10H20O31.941649.76nfMS---0.58---246-甲基十八烷C19H4033.331739.251842(Squalane)MS,RI0.590.39-----

續表4

注：a,C6～C25一系列正構烷烴計算所得保留指數；b,保留指數數據庫(http://webbook.nist.gov/chemistry)查找到的參考保留指數;nf,未在數據庫查到參考保留指數；c,MS指通過NIST 11譜庫定性該物質，RI指通過比對參考保留指數定性該物質；-,未檢測出物質

表5 發酵乳中關鍵性風味物質及對應OAVTable 5 OAV of key volatile compounds in fermented milk

2.2 復配發酵乳中揮發性風味物質的主成分分析

主成分分析指通過少數幾個主分量來解釋多變量間的內部關系，使樣品中物質的種類及含量有較客觀的反映。本實驗將對照菌株JD和6組復配發酵乳的揮發性風味物質歸為七類進行主成分分析，菌株與揮發性風味物質越接近，表明兩者相關性越高。由圖1可知，根據菌株在發酵乳中產生風味物質的豐富度，對照菌株和6組復配發酵乳被分成左右2個區域，右半區菌株(對照菌株JD、A4、A6)與酸類化合物、酮類化合物、醇類化合物、含氮類化合物和烷烴類化合物之間有較強的正相關性。左半區菌株(A1、A2、A3、A5)與醛類化合物和酯類化合物之間有較強的正相關性。說明對照菌株JD、A4、A6菌株在發酵過程中產生的主要風味物質較豐富，和酸類化合物、酮類化合物、醇類化合物、含氮類化合物、烷烴類化合物呈正相關。其中，A6產生的雙乙酰，乙偶姻、2-庚酮和2-壬酮等關鍵性風味物質在樣品中的濃度較高(表5)，對樣品的風味貢獻較大，賦予發酵乳良好風味。

通過綜合分析對照菌株JD和6組復配發酵乳中揮發性風味物質的種類及含量。認為A6復配發酵菌株產生良好的揮發性風味物質，有良好產香特性。

圖1 風味物質主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile compounds

2.3 復配發酵乳電子鼻檢測結果

2.3.1 電子鼻傳感器響應值結果分析

利用PEN3型電子鼻系統，檢測分析復配發酵乳樣品的氣味成分。對照菌株和6組復配發酵乳響應值的雷達圖,發酵乳電子鼻10個傳感器的氣味檢測結果如圖2所示。

圖2 發酵乳的電子鼻傳感器響應強度雷達圖Fig.2 Radar of electronic nose sensor response intensity of fermented milk

其中，W5S、W2W、W1W、W2S、W1S、W6S六種傳感器發生變化，分別對氮氧類、芳香類、硫化物、醇類及醛酮類等化合物敏感。說明這6種傳感器在發酵乳香氣檢測過程中貢獻較大。

2.3.2 電子鼻主成分分析

對照菌株JD和6組復配發酵乳電子鼻PCA結果如圖3所示，PC1和PC2方差貢獻率分別為94.35%和2.86%，2個主成分累積總貢獻率達97.21%，有效反映原始數據絕大部分信息。由圖3可知，對照菌株和6組復配發酵乳樣品區分明顯，均分布于各自獨立的區域，說明發酵終點不同發酵乳樣品之間風味特征不同[27]，電子鼻可以較好地區分不同發酵乳樣品中的揮發性風味物質。發酵乳樣品LDA分析結果如圖4所示，LD1和LD2貢獻率分別為81.80%和9.74%，兩判別式總貢獻率91.54%。由圖4可知，橢圓區域內各樣品分布趨勢各不相同，不同樣品區分明顯，互不重疊。說明LDA法能很好地區分對照菌株和6組發酵乳中的風味物質。因此，通過PCA結合LDA分析發現，與對照菌株JD進行比較，相比于其他菌株，A6菌株與對照菌株距離較近，風味較相似，說明A6發酵風味良好。

圖3 發酵乳的PCA分析圖Fig.3 PCA analysis of fermented milk

圖4 發酵乳的LDA分析圖Fig.4 LDA analysis of fermented milk

3 結論

本實驗采用SPME-GC-MS結合電子鼻技術檢測分析復配發酵乳中揮發性風味物質。結果表明，復配發酵乳均以酸類、醛類、酮類、醇類、酯類、烷烴類及氮類等化合物組成。對照菌株JD和6組復配發酵乳揮發性風味物質比較分析、OAV、PCA及LDA分析，結果顯示不同復配發酵乳產生的風味不同。其中，A6產生的雙乙酰，乙偶姻、2-庚酮和2-壬酮等特征風味物質在樣品中的濃度較高，對樣品的風味貢獻較大，賦予發酵乳良好風味。相比于其他菌株，A6菌株與對照菌株JD距離較近，風味較相似。說明A6發酵風味良好，優于其他菌株。因此，本研究篩選得到的A6復配組產生的特征風味物質使發酵乳風味優良，具有良好產香特性，為發酵劑的開發與利用提供數據支持。