發菜鹽脅迫響應蛋白TrkA-N的克隆及在大腸桿菌中表達

孟廣燕，陳雪峰,2*，劉歡，蔡國強，趙圓圓，黨玥，朱蓉靜，桑聰

1(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710021)2(陜西科技大學，陜西省農產品加工技術研究院，陜西 西安，710021) 3(西安培華學院，陜西 西安，710021)4(中國人民解放軍94162部隊79分隊，陜西 西安，710021)

發菜，學名發狀念珠藻(Nostocflagelliforme)，屬藍細菌門(Cyanopyhta)、藍細菌綱(Cyanophyceae)、斷殖藻目(Hormogonales)、念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻屬(Nostoc)[1]。發菜是陸生藍藻的一種，藻絲體有多個形如念珠的細胞，藻絲體外包裹膠質鞘，它是原核藍藻，生長環境惡劣，有極強生命力，能夠在逆性環境下正常生長[2]。自然缺水時，發菜呈黑色細絲狀，交纏成團，形如發絲，得名發菜。在全球均有發菜分布[3]，它主要生長在干旱、半干旱地區的草原和荒漠及半荒漠地帶，發菜在我國的分布也較廣泛。它起源于古老的光能自養型低等植物，能夠自給自足，有固氮特性[4]，同時發菜能夠耐高低溫、抗干旱，有很強的自我調節能力[5]。發菜可以食用，在我國，發菜作為食物已有大約2 000年的歷史，其營養豐富，富含蛋白質及錳、鐵、鈣等多種微量元素。焦文東[6]通過研究發現，發菜中必需氨基酸、多不飽和脂肪酸含量都較高，因此可以作為優質蛋白和二十二碳六烯酸(docosahexaenoid acid，DHA)的良好來源[7]。發菜在生長過程中會分泌活性胞外多糖[8]，有很高的生物活性，能夠保護細胞[9]，發菜的食用和藥用價值主要歸功于胞外多糖的存在[10]。但也正是因此，近些年人們對其濫采亂挖，再加上發菜本身生長環境的破壞、土地鹽漬化問題加劇、發菜培養不易、自然狀態下生長慢等諸多因素，發菜的年產量越來越低。1999年，國務院正式批準將野生發菜列為國家二級保護野生植物，并從2000年7月起嚴令禁止對野生發菜的隨意開采和交易[11]。

王貴春[12]通過大量研究得出結論，發菜在0.3 mol/L鹽濃度下培養一段時間后比在正常條件時產生的胞外多糖質量分數增加了50.3%。趙秀霞等[13]分別測定了正常條件下培養的發菜細胞和0.3 mol /L鹽濃度培養的發菜細胞的轉錄組序列[14]，在此項研究中他們共測出 13 170 條基因的表達水平出現了一定變化[15]，有些基因的表達水平上調，也有表達水平下調的基因。他們又對這些表達水平出現變化的基因進行了GO功能聚類[16]和Pathway的代謝通路分析[17]，在此項研究中發現參與發菜細胞的主要鹽離子運輸、光合作用、部分代謝以及各種代謝產物生物合成等眾多過程的基因的表達都有一定的改變[18]。本研究以在不同鹽濃度下表達量變化比較明顯的鉀離子通道蛋白TrKA-N基因作為目的基因，從路苗等[19]的研究結果中可以得出結論，鉀離子通道蛋白TrKA-N基因是影響鹽脅迫下多糖分泌量的關鍵基因之一，通過分子生物學手段[20]克隆得到鉀離子通道蛋白TrKA-N的全基因序列[21]，軟件推譯得到該蛋白的氨基酸序列，通過各種軟件分析該氨基酸編碼蛋白的種類和功能，將該基因與表達載體連接后，誘導基因成功在適當條件下合成具有相應功能的蛋白質。本研究為發菜響應鹽脅迫相關基因及其代謝調控機理的研究提供了一些思路，為各種蛋白基因工程菌株的成功構建[22]打下了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用發菜，由本實驗室自行液體懸浮培養；表達載體質粒，由微生物實驗室-80 ℃保藏；大腸桿菌感受態細胞及其他實驗相關試劑，寶日醫生物技術(北京)有限公司；專用試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設備

THZ-C-1全溫振蕩器，太倉市實驗設備(蘇州培英實驗設備有限公司)；MGC-400型光照培養箱，上海善志儀器設備有限公司；DYY-2C型電泳儀，北京六一儀器廠；ETC811基因擴增儀，蘇州東勝儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發菜細胞培養

BG11培養基配置[23]：硅液為5.8 g/L Na2SiO3·9H2O；磷液為2.38 g/L K2HPO4·2H2O；母液A1為3.6 g/L CaCl2·2H2O；母液A2為7.5 g/L MgSO4·7H2O；母液B成分(g/L)：檸檬酸，6.00；EDTA·2Na，1.00；CoCl2，0.01；CuSO4·5H2O，0.08；ZnSO4·7H2O，0.2；NaMoO4·2H2O，0.4；MnCl2·4H2O，1.8；H3BO3，2.86；FeSO4·7H2O，4.8。

培養基處理：取母液A1、A2各5 mL、母液B 500 μL于燒杯，定容到300 mL，移入錐形瓶1； Si液、P液各取5 mL，定容至200 mL，移入錐形瓶2。將瓶1和瓶2分別封口后高溫滅菌(121 ℃，20 min)[24]。滅菌后把培養基放到凈化工作臺中，降至室溫，在工作臺中將瓶1和瓶2混合均勻，以200 mL/瓶的量分裝至錐形瓶。發菜細胞轉接量為10%，培養箱設置兩段式條件循環培養,第一段為30 μmol/(m2·s)光照， 25 ℃培養12 h； 第二段為0 μmol/(m2·s)光照， 10 ℃培養12 h，培養15 d左右，可以進行后續操作。

1.3.2 目的蛋白基因TA克隆及序列測定

參照購買的植物基因組提取純化試劑盒說明書提取發菜基因組 DNA，質量檢測后于-20 ℃冰箱保藏待用[25]。

通過功能注釋、代謝通路分析及美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數據庫比對，篩選出鉀離子通道蛋白TrKA-N基因，同源比對發現該基因與點狀念珠藻鉀離子通道蛋白TrKA-N基因的相似度為92.41%。根據轉錄組測序結果與NCBI相似基因序列同源比對分析后設計引物，并在上下游引物分別加入BamH I和XhoI的酶切位點，最終設計引物為上游引物ATF：5′-CGCGGATCCGTGAATCTTTCATCATTAAGT-3′，下游引物ATR：5′-CCGCTCGAGAATCCGGCAAACGATTGATAT-3′，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。20 μL PCR 反應體系為發菜DNA 2 μL，設計合成的上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，超純水6 μL。PCR條件為95 ℃反應5 min，95 ℃反應30 s，50 ℃，30 s，72 ℃反應2 min，重復反應30次，72 ℃反應5 min。反應完成后，電泳檢測純化后產物與pMD19-T載體重組。將重組基因轉化到大腸桿菌DH5α 感受態細胞，菌液進行PCR驗證成功后，擴大培養，抽提質粒，質粒送至北京奧科鼎盛生物科技公司測序。

1.3.3 序列分析

將測序序列與NCBI數據庫中序列進行BLAST比對，確認基因信息，用DNAMAN推譯出相應氨基酸序列，再用DNAstar和ProtParam進行分析，利用TMHMM分析目標蛋白質的跨膜區，用ProtScale分析該蛋白的親水性及疏水性，分別用DNAMAN 和SOPMA分析預測該蛋白的二級結構，用NetPhos3.1 Server分析該蛋白的磷酸化位點及個數。

1.3.4 TrkA-N鉀通道蛋白基因原核表達

參考測序結果，重新設計引物，并且在上下游引物的 5′端分別添加BamH I 和XhoI的酶切位點及保護堿基，最終設計引物為上游引物ATF1:5′-GGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGTGAATCTTTCATCA-TTAAGT-3′，下游引物ATR1:5′-CGACGGAGCTCGA-ATTCGGATCCAATCGGCAAACGATTGATAT-3′，合成引物后，以重組質粒為模板，PCR擴增體系與前面實驗一致，退火溫度改為52 ℃，其他條件不變。擴增完成后檢測并純化產物，產物和pET28a質粒分別用2種酶BamH I 和XhoI做雙酶切反應，然后連接2個片段，連接成功的重組基因就是蛋白基因表達載體。將重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α培養，挑選陽性克隆進行菌液PCR及雙酶切驗證，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導表達進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。

2 結果與分析

2.1 目的蛋白基因TA克隆

抽提發菜DNA，電泳30 min，結果如圖1-a所示，提取的發菜DNA條帶清晰，沒有雜帶，說明其質量較好。目的基因體外擴增反應的電泳結果如圖1-b所示，在預期大小的分子質量標準附近(700 bp)有特異條帶，說明實驗正確。TrkA-N鉀通道蛋白基因連接pMD19-T載體并轉化感受態細胞后的菌液PCR電泳結果如圖1-c所示，克隆位點大小是140 bp，加上目的基因700 bp左右，在800 bp左右出現特異清晰條帶，說明結果正確，即發菜的TrkA-N鉀通道蛋白基因與pMD19-T載體連接成功，可以進行后續實驗。

a-發菜DNA電泳圖；b-鋰離子通道蛋白TrkA-N基因的PCR擴增；c-鉀離子通道蛋白TrkA-N基因重組質粒陽性轉化(DH5a/AT)PCR驗證圖1-a：泳道M-分子質量標準λDNA HindⅢ，泳道1～3-發菜DNA；圖1-b：泳道M-分子質量標準D2000，泳道1-目的基因；圖1-c：泳道M-分子質量標準D2000，泳道1-成功重連的產物條帶圖1 發菜DNA提取、目的基因體外擴增及重組質粒陽性轉化驗證Fig.1 DNA extraction, PCR amplification of the target gene in vitro and positive transformation of recombinant plasmids were verified

2.2 目的蛋白核酸及氨基酸序列分析

2.2.1 核苷酸及氨基酸序列

鉀離子通道蛋白TrkA-N基因與pMD19-T載體成功連接后，用pMD19-T載體通用引物對其雙向測序，結果如圖2所示，發菜鉀離子通道蛋白TrkA-N基因片段大小為696 bp，推譯得到的氨基酸序列表明，該蛋白共有231個氨基酸，DNAstar分析可知，帶電荷的氨基酸有55個，占總氨基酸殘基個數的23.81%，其中25個帶正電荷，30個帶負電荷。極性氨基酸有53個，占22.94%。疏水性氨基酸92個，占39.83%，酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占13.42%和10.82%。在鉀離子通道蛋白TrkA-N中包含較多的氨基酸為 Leu(10.8%)、Val(10.0%)、Ala (7.8%)和Gly(6.9%)，其不穩定值為34.74(<40)，說明鉀離子通道蛋白TrkA-N為穩定蛋白。

圖2 鉀離子通道蛋白TrkA-N基因核苷酸及氨基酸序列Fig.2 Nucleic acid and amino acid sequence of potassium channel protein TrkA-N gene

用DNAMAN把目的蛋白的核苷酸序列和它對應的氨基酸(amino acid，AA)序列與NCBI數據庫里的同源物種比對，結果如圖3所示，通過分析比對發現，發菜鉀離子通道蛋白TrkA-N基因保守性較高，核苷酸序列與念珠藻(Nostocsp.′Peltigera membranacea cyanobiont N6′)的相似度為93.25%，與點狀念珠藻(NostocpunctiformePCC73102)的相似度為92.41%，與念珠藻(NostoclinckiaNIES-25)的相似度為90.12%，與筒孢藻(Cylindrospermumsp. NIES-4074)的相似度為85.42%，與絲狀藍藻(Calothrixsp. NIES-2098)的相似度為84.23%，(Anabaenasp. WA102)的相似度為84.02%，與絲狀藍藻(Calothrixsp. PCC 7507)的相似度為83.59%。

目的蛋白的AA序列在進化過程中的變化很小(圖4)，通過分析比對發現，發菜鉀離子通道蛋白TrkA-N序列具有較高的保守性，AA序列與點狀念珠藻(NostocpunctiformePCC73102)的相似度為96.86%，與念珠藻(Nostocsp. KVJ20)的相似度為96.32%，與念珠藻(Nostoclinckia)的相似度為94.12%，與念珠藻(Nostoccalcicola)的相似度為93.32%，與念珠藻(Nostocsp. T09)的相似度為91.78%，與眉藻(Calothrixsp. PCC 7507)的相似度為91.12%，與柱孢藻(Cylindrospermumstagnale)的相似度為90.31%，與魚腥藻(Anabaenasp. 90)的相似度為89.67%，與眉藻(Calothrixsp. NIES-2098)的相似度為90.12%，與魚腥藻(Anabaenasp. AL09)的相似度為89.23%。

圖3 鉀離子通道蛋白TrkA-N核苷酸序列進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of ptassium channel protein TrkA-N nucleotide sequence

圖4 鉀離子通道蛋白TrkA-N氨基酸序列進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ptassium channel protein TrkA-N amino acid sequence

2.2.2 鉀離子通道蛋白TrkA-N基因分析及性能預測

利用軟件ExPASy檢測目的蛋白的疏水性，結果如圖5所示，第15位精氨酸(Arg)親水性最強，第85位異亮氨酸(Ile)疏水性最強，該蛋白的親水性區間多于疏水性區間，因此確定鉀離子通道蛋白TrkA-N為親水性蛋白。

圖5 鉀離子通道蛋白TrkA-N疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of potassium channel protein TrkA-N

利用 TMHMM 程序對目的蛋白進行跨膜區分析，根據數據分析顯示，該蛋白不含跨膜區。

利用NetPhos3.1 Server分析目的蛋白的磷酸化位點及位點個數，結果顯示，目的蛋白氨基酸序列中磷酸化位點個數分別為酪氨酸2個，蘇氨酸6個，絲氨酸10個。

通過2個軟件DNAMAN和SOPMA分析預測目的蛋白的二級結構，雖然2個軟件分析的方式不同，給出結果的形式不同，但是最終得出的結論一致(表1)，即蛋白的二級結構主要為β折疊和α螺旋。

表1 發菜鉀離子通道蛋白TrkA-N二級結構預測結果Table 1 Prediction results of TrkA-N secondary structure of potassium channel protein in Nostoc flagelliforme

2.3 鉀離子通道蛋白TrkA-N在大腸桿菌中的表達

構建目的蛋白基因的表達載體pET28a-TrkA-N potassium channel protein gene，然后轉化 DH5α 挑選陽性克隆，在液體培養基擴大培養后進行菌液PCR驗證，得到1 000 bp左右的特異條帶(加上克隆位點300 bp左右)，如圖6所示。抽取質粒后進行雙酶切驗證反應，電泳后可以看到兩條比較清晰的條帶，大小分別在700 bp和5 000 bp左右，與預期大小一致(圖7)。測序結果表明插入片段就是鉀離子通道蛋白TrkA-N基因。

泳道M-分子質量標準D2000；泳道1-鉀離子通道蛋白TrkA-N基因重連產物圖6 目的蛋白基因重組質粒陽性轉化的PCR驗證Fig.6 PCR identification of positive transformant

泳道M-分子質量標尺D15 000+2 000；泳道1-目的蛋白基因的雙酶切圖7 鉀離子通道蛋白TrkA-N基因重組質粒陽性轉化子的酶切驗證Fig.7 Enzymatic digestion of recombinant plasmid positive inverters of potassium channel protein TrkA-N gene

將表達載體轉化到大腸桿菌BL21細胞，挑選陽性菌接種到含有卡那霉素的 LB 培養基，37 ℃，200 r/min培養，10 h后每隔1 h測定1次菌液OD600值，OD值達到0.8時，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoproyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，保證其終濃度為1 mmol/L，對照組分別為加了IPTG且終濃度為1 mmol/L的pET-28a空質粒菌和沒有加IPTG的陽性菌，37 ℃，120 r/min培養20 h后取樣進行SDS-PAGE電泳，結果如圖8所示，表明有我們預期的外源蛋白表達，目的蛋白分子質量為31.41 kDa，外源蛋白分子質量與預測的目的蛋白分子質量相符，說明鉀離子通道蛋白TrkA-N表達成功。

泳道M-基因表達驗證參考10～180 kDa；泳道1-1 mmol /LIPTG誘導20 h的空白質粒；泳道2-不加誘導劑的陽性質粒轉化子；泳道3-1 mmol /L IPTG誘導20 h的目標質粒圖8 鉀離子通道蛋白TrkA-N基因在大腸桿菌BL21中的表達Fig.8 Expression of TrkA-N potassium channel protein in E.coli BL21

3 結論與討論

隨著土地鹽漬化問題的加劇，鹽脅迫問題已經成為了一個非常常見的非生物脅迫，在一定濃度的鹽脅迫作用下，發菜細胞的胞外多糖產量增加，其內在因素是發菜中與鹽脅迫相關基因的轉錄水平發生了一些不同程度的改變，一部分基因轉錄水平上調，另一部分基因表達水平下降，其中鉀離子通道蛋白TrkA-N基因的轉錄水平出現了較明顯的下調，說明該基因可能是參與一定鹽濃度作用下胞外多糖代謝過程重要的基因之一，可能在發菜鹽脅迫作用下的一些相關反應中發揮了比較重要的作用。鉀離子通道蛋白TrkA-N基因可以參與多糖合成，也驗證了發菜可以通過改變一些基因的轉錄水平對鹽脅迫做出相應緩解作用的反應，該結果從分子水平解釋了鹽脅迫下發菜多糖產量提高的調控機理，為該結論提供了有力的依據。本研究利用分子生物學方法體外擴增鉀離子通道蛋白TrkA-N編碼基因，與pET28a質粒重連構建表達載體并轉化大腸桿菌BL21(DE3)誘導表達，最佳表達條件為液體培養10 h后待菌液OD600值達到0.8時，添加終濃度為1 mmol/L誘導劑 IPTG，繼續誘導20 h，最終在大腸桿菌中成功表達出分子質量為31.41 kDa的蛋白，本實驗在成功構建表達載體的基礎上進一步摸索出誘導目的基因在該載體中成功表達的最優條件，為更多基因的研究提供了較成熟的研究思路，也為更深入的研究打下了良好基礎。然而，正如前文所說，參與鹽脅迫反應的基因還有很多，在該作用下多糖產量變化的過程和機制也相當復雜，因此，要研究的基因以及這些基因編碼蛋白質的種類及功能還有很多，它們在鹽脅迫下的響應機理以及調控多糖代謝機制還需進一步研究。