脂質自由基誘導氧化對花生蛋白功能特性的影響

楊曦，程群，劉江，陳瓊，王振興，張雪春，*，孫健

1(西南林業大學 生命科學學院，云南 昆明，650224)2(廣西農業科學院 農產品加工研究所，廣西 南寧，530007)

花生是人類膳食中主要的植物蛋白來源之一，花生仁經制油后的副產物花生粕含47%～55%的蛋白質[1]，具有資源豐富、成本低效益高、必需氨基酸含量和消化吸收率高等優點[2-3]，是一種優質的蛋白質資源，可作為食品添加劑廣泛應用于食品生產。

在食品體系中，脂質尤其是多不飽和脂肪酸在外部作用下易發生氧化，產生脂質過氧化產物如醛類、酮類、活性氧和自由基，進一步與蛋白質的氨基酸主鏈和側鏈相作用，使蛋白質的二級、三級結構構象發生變化，造成蛋白質的營養損失、風味惡化及品質下降[4-6]。目前蛋白質氧化已成為研究的熱點，如李艷青[7]發現自由基使鯉魚蛋白的結構明顯改變，從而影響肌肉蛋白的功能性質；周非白[8]發現氧化可使豬肉肌原纖維蛋白的功能特性發生明顯改變；SALIM等[9]發現牛的不同肌肉類型對蛋白氧化的敏感程度不同；尤翔宇[10]發現脂質過氧化產物對米糠蛋白結構、功能性質和消化性質具有影響。但目前這些研究主要集中在肉類蛋白，而對植物蛋白氧化的研究相對較少。

因此，本文建立鐵/過氧化氫/抗壞血酸(Fe/H2O2/Asc)和2,2′-鹽酸脒基丙烷(2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride,AAPH)氧化體系，代表脂質過氧化反應中的自由基，對花生蛋白進行不同程度的氧化修飾，探討脂質自由基誘導氧化對花生蛋白功能特性的影響規律，為花生蛋白在實際生產中功能性質的調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂花生粕，購于河南省桐柏縣；大豆油，市售；牛血清蛋白標準品(純度98%)，購于上海伯奧生物科技有限公司；FeCl3、H2O2、抗壞血酸、AAPH等其他試劑，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

酸度計(FE28-Standard)，上海右一儀器；高速冷凍離心機(3K15)，德國Sigma；多功能臺式高速冷凍離心機(5804R)，德國Eppendorf；真空冷凍干燥機(ModulyoD-230)，賽默飛世爾(中國)科技；紫外可見分光光度計(UV-1000),北京萊伯泰科儀器；凱氏定氮儀(KjeltecTM8400)，丹麥Foss；數顯高速分散均質機(FJ200-SH)，上海滬析；熒光光度計(Lumina)，美國賽默飛世爾。

1.3 實驗方法

1.3.1 花生蛋白的制備

脫脂花生粕按料液比1∶10(g∶mL)加入水，以2 mol/L NaOH調pH至8.5，經室溫提取1 h后于4 ℃，5 000 r/min離心30 min，所得上清液以2 mol/L HCl調節pH至4.5后經同等條件離心，所得沉淀調至中性，凍干為花生蛋白(經測定脂肪含量<0.1%)。

1.3.2 羥自由基氧化花生蛋白的制備

參考PARK等[11]的方法并稍作修改，采用Fe/H2O2/Asc系統產生羥自由基以建立氧化體系。以0.02 mol/L pH 7.9磷酸鹽緩沖液為溶劑，固定體系中FeCl3和抗壞血酸濃度為0.1 mmol/L，改變H2O2濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10、15 mmol/L。體系中花生蛋白的最終質量濃度為10 mg/mL，在37 ℃下氧化1 h后，添加EDTA使其終濃度為1 mmol/L以中止反應。氧化蛋白液于4 ℃透析，凍干為羥自由基氧化花生蛋白。

1.3.3 過氧自由基氧化花生蛋白的制備

參考WU等[12]的方法稍作修改，將花生蛋白溶于0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液，使蛋白質量濃度為10 mg/mL，加入AAPH使其濃度分別為0、0.04、0.2、0.5、1、3、5、10 mmol/L，37 ℃避光反應24 h后，冰浴降溫至4 ℃，于4 ℃透析72 h，凍干為過氧自由基氧化花生蛋白。

1.3.4 花生蛋白羰基含量的測定

參考LEVINE等[13]的方法稍作修改，將花生蛋白樣品配制為10 mg/mL的溶液，并測定溶液中蛋白質的濃度。以2,4-二硝基苯肼比色法進行比色，羰基含量按公式(1)計算：

(1)

式中：A370，樣品在370 nm處的吸光度值；A370對照，對照樣品在370 nm處的吸光度值；b，比色光徑，1 cm；c，蛋白質量濃度，mg/L。

1.3.5 花生蛋白溶解度的測定

參考PEYRANO等[14]方法稍作修改，將花生蛋白樣品配制為1 mg/mL溶液，于4 ℃，8 000 r/min離心5 min，分別測定上清液和樣品中蛋白質的含量。按公式(2)計算溶解度：

(2)

1.3.6 花生蛋白乳化性及乳化穩定性的測定

(3)

(4)

式中：N，稀釋倍數；c，蛋白質量濃度，g/mL；φ，乳狀液油相體積分數，25%；L，比色光徑，1 cm；t，時間間隔,10 min。

1.3.7 花生蛋白起泡性及起泡穩定性的測定

配制30 mL 1 mg/mL花生蛋白液，高速分散后記錄體積V0，放置30 min后再次記錄體積V30。按公式(5)和公式(6)計算起泡性及起泡穩定性：

(5)

(6)

1.3.8 花生蛋白內源熒光的測定

采用熒光光度計采集樣品的內源熒光光譜。激發波長240 nm，掃描范圍290～420 nm，激發和發射狹縫寬度5 nm。以溶劑為空白，蛋白質量濃度為0.1 mg/L進行測定。

1.3.9 數據處理與分析

每個實驗均進行3次重復平行實驗，采用Microsoft Excel 2010進行數據處理與分析，Origin 2018進行圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 氧化對花生蛋白羰基含量的影響

蛋白質被自由基氧化修飾后往往涉及到羰基的產生，其可判斷蛋白質氧化受損的程度[16]。如圖1所示，隨著H2O2和AAPH濃度的增加，花生蛋白的羰基含量均逐漸增加，說明脂質自由基氧化使其發生了一定程度的羰基化反應。Fe/H2O2/Asc體系中(圖1-a)，隨著H2O2濃度的增加，花生蛋白的羰基含量從16.88 nmol/mg增加到40.88 nmol/mg，增幅為1.42 倍，這可能是由于金屬鐵離子的存在，使羥自由基等氧化產物與花生蛋白堿性氨基酸反應，增加了羰基含量[17]；AAPH體系中(圖1-b)，隨著AAPH濃度增加，羰基含量從20.17 nmol/mg增加到53.65 nmol/mg，增幅為1.66 倍，這可能是由于花生蛋白結構展開，暴露的氨基酸殘基受到AAPH分解產生的過氧自由基攻擊，羰基衍生物逐漸積累，導致羰基含量增加[4]。

a-Fe/H2O2/Asc體系;b-AAPH體系圖1 脂質自由基氧化對花生蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of lipid free radical oxidation on the carbonyl derivatives of peanut protein

2.2 氧化對花生蛋白溶解度的影響

如圖2所示，在2種氧化體系中，隨著H2O2和AAPH濃度的增加，花生蛋白的溶解度均逐漸降低。Fe/H2O2/Asc體系中(圖2-a)，隨著H2O2濃度的增加，花生蛋白的溶解度從71.35%降低到40.63%，降幅為43.06%；AAPH體系中(圖2-b)，隨著AAPH濃度的增加，溶解度從66.17%降低到33.33%，降幅為49.62%。說明羥自由基和過氧自由基破壞了花生蛋白的天然構象，使蛋白質失去穩定性，一些疏水性基團暴露，導致花生蛋白的溶解度降低[14]。另外，失去穩定性的花生蛋白易產生共價交聯，形成聚集或沉淀，并隨著氧化程度的增加，氨基酸側鏈的氧化變得劇烈，花生蛋白進一步發生聚集，最終轉變為不溶性聚集體[4]。

a-Fe/H2O2/Asc體系;b-AAPH體系;圖2 脂質自由基氧化對花生蛋白溶解度的影響Fig.2 Effect of lipid free radical oxidation on the solubility of peanut protein

2.3 氧化對花生蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

如圖3所示，經脂質自由基氧化后，花生蛋白的乳化性及乳化穩定性均有所降低。Fe/H2O2/Asc體系中(圖3-a)，隨著H2O2濃度的增大，花生蛋白的乳化性從105.35 m2/g降低到38.02 m2/g，降幅為63.91%，乳化穩定性從32.98 min降低到17.55 min，降幅為46.79%；AAPH體系中(圖3-b)，隨著AAPH濃度的增大，乳化性從107.97 m2/g降低到76.16 m2/g，降幅為28.91%，乳化穩定性從26.63 min降低到17.82 min，降幅為33.08%。乳化性能降低的原因可能是花生蛋白氧化形成不溶性聚集體，使分子間柔韌性降低、蛋白表面積縮小，從而導致乳化性及乳化穩定性下降[4,18-19]。然而,當AAPH濃度較低(0～0.2 mmol/L)時，花生蛋白乳化穩定性略為上升，可能是因低濃度AAPH氧化時，所形成的不溶性聚集體表面積較大，在油滴表面形成有張力的蛋白膜，從而使乳化穩定性得以提高[20]，而隨著AAPH濃度繼續增加，過氧自由基劇烈攻擊蛋白質使其變性，導致乳化穩定性的持續下降。

a-Fe/H2O2/Asc體系;b-AAPH體系圖3 脂質自由基氧化對花生蛋白乳化性及乳化穩定性的影響Fig.3 Effect of lipid free radical oxidation on the emulsifying ability and emulsifying stability of peanut protein

2.4 氧化對花生蛋白起泡性及起泡穩定性的影響

如圖4所示，脂質自由基氧化后，花生蛋白的起泡性及起泡穩定性均呈先上升后下降的趨勢，而AAPH體系的起泡性呈持續下降趨勢。Fe/H2O2/Asc體系中(圖4-a)，花生蛋白的起泡性在H2O2濃度為1 mmol/L時最高，起泡穩定性在H2O2濃度為5 mmol/L時最高；AAPH體系中(圖4-b)，起泡性在AAPH濃度為0 mmol/L時最高，起泡穩定性在AAPH濃度為0.5 mmol/L時達到最高。總體上，低濃度氧化可提高花生蛋白的起泡穩定性，而高濃度氧化則會降低其起泡性及起泡穩定性。原因可能是自由基氧化使花生蛋白分子部分展開，其內部疏水殘基暴露，使蛋白質分子能迅速吸附至氣-水界面，從而增強其起泡性，而隨著氧化程度增加，蛋白質分子發生更大交聯，形成不溶性聚集體，使蛋白質分子的界面張力增加，起泡性減小[18-19]。

a-Fe/H2O2/Asc體系;b-AAPH體系圖4 脂質自由基氧化對花生蛋白起泡性及起泡穩定性的影響Fig.4 Effect of lipid free radical oxidation on the foamability and foaming stability of peanut protein

2.5 氧化對花生蛋白內源熒光的影響

蛋白質的內源熒光主要來源于色氨酸殘基，其變化程度可表征花生蛋白氧化損傷的程度[21]。如圖5所示，隨著H2O2和AAPH濃度的增加，花生蛋白的內源熒光強度均持續降低。Fe/H2O2/Asc體系中(圖5-a)，花生蛋白的內源熒光強度隨著H2O2濃度的增加而降低，最大降幅為33.01%，最大熒光峰位λmax從340.3 nm藍移至339.6 nm，說明花生蛋白的色氨酸殘基被羥自由基氧化，并通過再次聚集包埋，使其在蛋白質分子中的暴露程度降低；AAPH體系中(圖5-b)，隨著AAPH濃度的增加，花生蛋白的內源熒光強度呈下降趨勢，最大降幅為28.02%，原因可能是色氨酸殘基被轉化為犬尿氨酸[22]，以及花生蛋白發生共價交聯和聚集[4]，使內源熒光強度下降。上述結果進一步說明自由基氧化會導致花生蛋白的聚集及結構的變化。

a-Fe/H2O2/Asc體系;b-AAPH體系圖5 脂質自由基氧化對花生蛋白內源熒光的影響Fig.5 Effect of lipid free radical oxidation on the intrinsic fluorescence of peanut protein

3 結論

脂質過氧化反應產生的自由基可誘導花生蛋白氧化。通過建立Fe/H2O2/Asc和AAPH模擬氧化體系，發現脂質自由基氧化對花生蛋白的功能特性有較大影響。隨著氧化體系中自由基濃度的增大，花生蛋白的羰基含量上升，說明其發生了不同程度的氧化；羥自由基和過氧自由基氧化使花生蛋白的溶解度降低，乳化性及乳化穩定性下降，這可能對其在食品生產加工中的應用不利；在Fe/H2O2/Asc體系中，花生蛋白的起泡性能呈先上升后下降的趨勢，說明適度氧化可增強其起泡性能，有助于在花生蛋白的生產加工中實現調控。這些結果揭示了脂質自由基氧化對花生蛋白功能特性的影響規律，可為改善花生蛋白的品質，提高其應用價值提供一定科學依據。