羅伊氏乳桿菌CCFM8631緩解小鼠非酒精性脂肪性肝病與其對腸道菌群及短鏈脂肪酸的調節顯著相關

焦婷，朱慧越，司倩，許夢舒，孫姍姍，馬方勵，王剛*，趙建新，張灝，陳衛

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州，510623)

在亞洲地區，隨著人們生活方式和飲食結構的變化，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率逐年升高，由此演變的非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化以及肝癌的發病率也隨之增加[1]。由于非酒精性脂肪性肝病的預后性較好，治療NAFLD已成為預防惡性肝臟類疾病的重要措施。NAFLD的發病原因復雜，目前尚無明確完整的病理機制[2]。研究表明，NAFLD患者多具有明顯的肝臟脂肪變性、血脂代謝紊亂、胰島素抵抗、腸道菌群紊亂等癥狀[3]。目前緩解NAFLD的方式主要為加強運動、降低能量攝入，尚無專門針對NAFLD的藥物[2， 4]。

腸道菌群是腸道屏障中的重要成員，影響著宿主的營養吸收、能量代謝以及免疫應答[5]。在健康人群中，腸道菌群種類及數量繁多，作為優勢菌群的Firmicutes與Bacteroidetes在腸道菌群結構中呈現相對穩定的比例，腸道菌群失調則使腸道菌群結構的穩定性和豐度有所降低，改變腸道菌群代謝產物，促進疾病的形成[6]。肝臟是外源化合物和微生物產物通過腸道后接觸到的第一個可以產生免疫應答的器官，腸道菌群的結構以及腸道微生物產物的組成對肝臟代謝的正常運行有著非常重要的影響[7]。近年來，越來越多的研究表明，NAFLD的形成跟腸道菌群失調有著密切的聯系[8]，因而調節腸道微生物已成為緩解NAFLD的重要方式。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)能夠緩解高脂飲食誘導的NAFLD的疾病癥狀(高血脂、高血糖以及肝損傷癥狀等)[9]。目前的研究主要集中在分析菌株對NAFLD癥狀的影響，對于菌株緩解NAFLD途徑尚無定論[10]。本文旨在研究LAB干預NAFLD后腸道中短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的變化、腸道菌群變化以及腸道內變化與NAFLD癥狀的相關性，以期發現菌株在腸道內緩解NAFLD的途徑，為后期的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高脂高膽固醇飲食(high-gat and high-cholesterol diet，HFHCD)(能量為19.67 kJ/g，蛋白質、脂肪和碳水化合物所提供的能量分別占總能量的16%、42%和43%)，低脂低糖飼料(能量為16.74 kJ/g，其中蛋白質、脂肪和碳水化合物所提供的能量分別占總能量的20%、12%和68%)，南通特洛菲有限公司。色譜純乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸，中國國藥試劑公司；糞便DNA快速提取試劑盒，MP biomedicals有限公司；膠回收試劑盒，倍沃醫學科技有限公司；甘油三酯(triglyceride，TG)檢測試劑盒、總膽固醇(total cholestenone,TC)檢測試劑盒以及蛋白定量試劑盒，南京建成生物技術公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin,HE)染色液套裝，南昌雨露實驗器材有限公司；IL-6，IL-1β，TNF-α ELISA試劑盒，R&D有限公司；辛伐他汀片，美國默沙東有限公司；羅格列酮片，成都恒瑞制藥有限公司；胰島素檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；植物乳桿菌L1(FSDJN73M1)、兩歧雙歧桿菌B1(FJSWX26M9)和羅伊氏乳桿菌CCFM8631,均來源于江南大學食品生物技術中心菌種保藏庫。

1.2 儀器與設備

SX-300高溫高壓滅菌鍋，日本Tomy公司；BC-5000 Vet全自動生化分析儀，深圳邁瑞醫療有限公司；氣相色譜質譜聯用儀、多功能酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；手動輪轉式切片機，德國徠卡公司；數字切片掃描儀，匈牙利3DHISTCH公司；5804R高速冷凍離心機，德國艾本德公司；恒溫恒濕培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；Illumina miseq pe300高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 LAB懸浮液的制備

菌株的活化及擴培參照司倩等[11]的方法進行，菌體的收集與凍存參照朱廣素等[12]的方法進行。臨用前，加入9倍體積的無菌蒸餾水重懸菌株，即菌株濃度稀釋為5.0×109CFU/mL。

1.4 動物實驗設計

42只4周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠購買于上海斯萊克，飼養在SPF級12 h明暗交替的恒溫恒濕環境中，溫度為(23±3) ℃，濕度為(55±15)%。適應喂養1周后，按表1隨機分成7組，每組各6只，并做相應處理23周。每周稱體重、換水1次，飼料每2天換1次且稱重。在23周時，收取小鼠糞便凍存于-80 ℃冰箱，禁食不禁水12 h后，稱取小鼠體重，注射50 mg/(kg·bw) 10 g/L戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，采血取樣。

表1 動物實驗設計方案Table 1 The animal experiment design

注：3%蔗糖溶液為質量分數

1.5 血清中生化指標的測定

血清中的TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density liptein cholesterol，LDL-C)、谷丙轉氨酶(alanine aminotrasferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)以及葡萄糖(glucose，GLU)水平用全自動生化分析儀測定。

1.6 肝臟中的細胞因子

肝臟中的白介素-1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)的含量用ELISA試劑盒測定，結果用蛋白水平進行校準。

1.7 肝臟組織病理分析

肝臟切片的制作及觀察按前人所述操作[11]，肝臟評分采用SAF評分系統，根據BEDOSSA等[13]的方法進行。

1.8 結腸中的SCFAs分析

糞便中SCFAs的提取及分析操作參照WANG等[14]的方法進行。

1.9 腸道宏基因組

用MP biomedicals DNA快速提取試劑盒提取糞便中的DNA，16S rDNA測序及分析按照WANG等[15]的方法進行。

1.10 統計與繪圖

所有實驗數據采用SPSS進行單因素方差分析及相關性分析。采用Graphpad Prism6、TBtools作圖。LEfSe分析在http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/上完成。所有實驗結果均表示為Mean±SD。

2 結果與分析

2.1 CCFM8631的攝入減少NAFLD小鼠體重增量

肥胖是NAFLD的重要危險因素，一般表現為體重增量和白色脂肪指數增加。不同干預對NAFLD小鼠體重增量和白色脂肪指數的影響結果如圖1所示。HFHC組的體重增量和白色脂肪指數顯著高于NC組，與HFHC組相比，藥物和LAB的干預均能顯著降低HFHCD喂養小鼠的體重增量。此外，羅格列酮和CCFM8631的干預還能夠顯著緩解HFHCD誘導的白色脂肪指數上升。雖然L1和B1也能夠顯著減少小鼠的體重增量，但對白色脂肪指數的控制無顯著效果。由此可知，羅格列酮和CCFM8631對肥胖的進程具有阻礙作用，與朱廣素等的研究結果一致[16]。

a-體重增量；b-白色脂肪指數圖1 不同干預對NAFLD小鼠體重水平的影響Fig.1 The effect of different treatment on body weight of NAFLD mice注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 CCFM8631的攝入能夠改善NAFLD小鼠的血脂代謝紊亂

不同組別的脂肪代謝水平如圖2所示。與NC組相比，HFHCD喂養23周的小鼠血清中的TC、HDL-C和LDL-C水平均顯著升高，血清TG水平無明顯差異。HFHCD導致肝臟TC和TG水平顯著升高。肝臟TG水平升高而血清TG水平保持穩定，提示模型小鼠脂肪肝的形成。與HFHC組相比，3株LAB均顯著降低了肝臟中TC、TG的水平，但對血清中TC水平的影響并無統計學差異。這說明3株LAB均能有效地緩解小鼠肝臟中的脂質堆積，但可能由于血清中TC水平受飼料的即時影響更大，因此在血清TC指標上并無顯著差異。但從HDL-C和LDL-C水平來看，尤其是LDL-C的水平的恢復，CCFM8631的干預表現出了非常顯著的效果，L1和B1對血清LDL-C水平的影響并無顯著性差異。結合血清TC水平的變化，雖然3株LAB對血清TC的影響相對HFHC組均無顯著性差異，但從趨勢上看，CCFM8631對血清TC水平的升高具有相對明顯的緩解作用。這提示相比L1和B1，CCFM8631對HFHCD導致的TC水平的即時升高具有更為顯著的減緩作用?？赡苷怯捎贑CFM8631的攝入使得小鼠血清中TC水平更快下降，機體產生的LDL-C水平才會相應的降低。以上結果表明，3株LAB均能夠阻止小鼠肝臟的脂肪堆積，但CCFM8631可能更傾向于在更短的時間內降低血清中由HFHCD導致的高水平TC，可能跟羅伊氏乳桿菌菌株中的高活性膽鹽水解酶有關[17]。高活性的膽鹽水解酶有助于分解胃腸道中的結合態膽鹽，將其轉變成氨基酸和游離膽汁酸，游離膽汁酸能與TC共沉淀，以糞便的形式排出體外[18]。

a-血清TC；b-血清HDL-C；c-血清LDL-C；d-血清TG；e-肝臟TC；f-肝臟TG圖2 不同干預對NAFLD小鼠脂肪代謝的影響Fig.2 The effect of different treatment on lipid metabolism of NAFLD mice

2.3 CCFM8631的攝入能夠改善NAFLD小鼠的胰島素抵抗

小鼠空腹血糖、胰島素水平以及胰島素抵抗指數結果如圖3所示。與NC組相比，HFHCD喂養23周的小鼠空腹血糖水平顯著升高，胰島素水平顯著降低，胰島素抵抗指數升高，表明HFHCD喂養23周造成了小鼠血糖代謝紊亂。羅格列酮和辛伐他汀的攝入均顯著降低了小鼠的胰島素抵抗指數，但對小鼠的空腹胰島素水平沒有表現出顯著的恢復作用。此外，辛伐他汀還顯著下調了小鼠的空腹血糖水平。3株LAB中，CCFM8631和B1顯著恢復了小鼠的空腹胰島素水平并降低了空腹血糖，但只有CCFM8631對胰島素抵抗指數表現出了更為顯著的降低作用。

a-空腹血糖；b-空腹胰島素；c-胰島素抵抗指數圖3 不同干預對NAFLD小鼠胰島素抵抗的影響Fig.3 The effect of different treatment on insulin resistance of NAFLD mice

2.4 CCFM8631的攝入能夠緩解NAFLD小鼠的肝臟損傷

小鼠肝功能指標如圖4所示。HFHCD喂養23周的小鼠肝臟指數顯著增加，同時血清中ALT、AST和CHE水平顯著升高。辛伐他汀顯著降低了血清中ALT和AST水平，但對肝臟指數和CHE水平未表現出顯著影響，羅格列酮表現出了強烈的肝損傷作用。羅格列酮的攝入導致ALT、AST以及肝臟指數的進一步升高。與羅格列酮和辛伐他汀不同，LAB的干預在肝臟損傷上表現出了顯著的優勢，尤其表現在AST水平的恢復上，3株LAB均表現出了顯著的緩解效果。而在這3株LAB中，CCFM8631表現出了更好的預防HFHCD導致肝臟損傷的能力，具體表現在對肝臟指數以及ALT水平的恢復能力上。而L1和B1能夠減緩肝臟線粒體的損傷，但對肝細胞損傷修復效果不明顯。

同樣，肝臟組織切片病理結果如圖4所示，與NC組相比，HFHC組的肝臟細胞排列松散且不規則，其中肝脂滴將細胞核擠向一側，形成大量中大型脂肪空泡，同時伴有少量炎性細胞浸潤。另外，部分肝細胞發生了氣球樣病變。羅格列酮的干預促進肝臟進一步發生氣球樣病變，加重肝臟損傷程度。CCFM8631的干預改善了HFHCD喂養小鼠的肝臟病變程度，同時肝臟病理評分顯著低于HFHC組。

a-肝臟指數；b-ALT；c-AST；d-CHE；e-病理切片；f-肝臟病理評分圖4 不同干預對NAFLD小鼠肝臟損傷的影響Fig.4 The effect of different treatment on liver damage of NAFLD mice

2.5 CCFM8631的攝入降低NAFLD小鼠肝臟中炎癥因子的水平

不同干預對NAFLD小鼠肝臟炎癥水平的影響如圖5所示，與NC組相比，HFHC組的肝臟中的TNF-α，IL-6和IL-1β水平顯著增加。羅格列酮和辛伐他汀在TNF-α水平上表現出了下調作用。而3株LAB對TNF-α水平的影響比藥物更顯著。此外，CCFM8631還顯著地緩解了IL-6和IL-1β水平的上升，而另外2株菌只有B1在IL-1β上表現出了顯著的下調作用。

a-TNF-α；b-IL-6；c-IL-β圖5 不同干預對肝臟中促炎因子的影響Fig.5 The effect of different treatment on lipid metabolism of NAFLD mice

2.6 CCFM8631的攝入提高NAFLD小鼠糞便中SCFAs水平

SCFAs是腸道中的微生物代謝人體未消化吸收的碳水化合物所產生的代謝產物。不同干預對NAFLD小鼠糞便中SCFAs含量的影響如圖6所示。HFHCD喂養23周后，小鼠腸道中的丙酸和異丁酸水平顯著降低，乙酸和丁酸水平無顯著差異。與HFHC組相比，羅格列酮和辛伐他汀均無法恢復下降的SCFAs水平，甚至會進一步降低乙酸的水平。相反，3株LAB的干預均能顯著提高4種SCFAs的濃度。據報道，口服乙酸鹽能夠抑制高脂飲食小鼠體重增加[19]；丙酸鹽能抑制脂肪合成中的幾種限速酶的轉錄以減少肝臟脂肪堆積[8]；丁酸鹽能夠促進線粒體功能增加能量消耗[20]，此外還能夠促進肝臟GLP-1受體表達阻礙NAFLD的進程[19, 21]。3株LAB干預后，腸道中的SCFAs含量均有所提高，而對于NAFLD各癥狀的緩解效果表現卻不一致。很明顯，CCFM8631干預后，NAFLD小鼠的血脂血糖水平以及肝臟損傷程度均有所降低，體現出CCFM8631對NAFLD具有良好的緩解作用，而L1和B1并未表現出緩解作用，暗示除SCFAs以外，還存在著其他機制共同決定NAFLD的緩解。

a-丙酸；b-異丁酸；c-乙酸；d-丁酸圖6 不同干預對NAFLD小鼠糞便中SCFAs含量的影響Fig.6 The effect of different treatment on fecal SCFAs of NAFLD mice

2.7 CCFM8631的攝入對NAFLD小鼠腸道菌群的影響

NAFLD的發生伴隨著腸道菌群紊亂，在腸道菌群上的表現目前并無統一的結論，大多數研究表明高脂飲食誘導的NAFLD小鼠腸道中Firmicutes的豐度上升，Bacteroidetes的豐度下降[22-23]。Firmicutes與Bacteroidetes是人體腸道中的優勢菌群之一，腸道菌群中Firmicutes豐度的增加有利于能量的吸收更容易導致機體肥胖，Firmicutes與Bacteroidetes比值的上升與肥胖密切相關[23]。不同干預條件對NAFLD小鼠腸道菌群門水平改變如圖7所示，與NC組相比，HFHC組的Firmicutes水平保持不變，但Bacteroidetes降低，即Firmicutes與Bacteroidetes的比值上升，Actinobacteria和Proteobacteria在腸道中的比例升高。羅格列酮和辛伐他汀進一步提高了Firmicutes與Bacteroidetes的比值，同時降低了Actinobacteria的豐度，另外羅格列酮的攝入反而進一步增加了Proteobacteria在腸道中的豐度。3株LAB的干預逆轉了Firmicutes與Bacteroidetes的比值升高的現象，但對其他微生物在門水平上的改變呈現出不同的結果。其中CCFM8631和B1的干預增加了腸道中Bifidobacterium所在的Actinobacteria的豐度，降低了Proteobacteria的豐度，L1的干預對腸道中Actinobacteria和Proteobacteria的豐度無影響。Proteobacteria是腸道穩態失調的標志物之一，其豐度的升高通常與宿主的代謝紊亂、炎癥反應有關[24]。

a-Firmicutes;b-Bacteroidetes;c-Firmicutes/Bacterpidetes比值；d-Atinbacteria;e-Proteobateria;f-各門水平所占比例圖7 不同干預對門水平的影響Fig.7 The effect of different treatment on phylum level

如圖8所示，通過LDA Effect Size(LEfSe)分析(LDA=2)發現， HFHCD喂養23周導致小鼠腸道菌群發生顯著改變。如圖9所示，與NC組相比，HFHCD顯著增加了腸道菌群中的以下菌屬的豐度，Mucispirillum、Turicibacter、Dorea以及Allobaculum，同時顯著降低了Desulfovibrio的豐度。CCFM8631和B1的攝入顯著提高了小鼠腸道中的Bifidobacterium、Lactobacillus的豐度，L1的攝入顯著增加了小鼠腸道中的Akkermansia、Bacteroides以及Bilophila的豐度；另外，CCFM8631還顯著提高了小鼠腸道中Desulfovibrio的比例。3株LAB降低了小鼠腸道中的Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的豐度。Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus以及Akkermansia對腸道菌群穩態具有促進作用，其豐度的增加在多種疾病的恢復中發揮著重要影響，越來越多研究表明這些菌能夠在腸道內發揮有益的作用[25-26]。有研究表明，Turicibacter參與炎癥反應[27]，糖尿病的減輕伴隨著Turicibacter豐度的降低[28]。同樣由于高脂飲食誘導的高血脂癥，隨著癥狀緩解也伴隨著Turicibacter豐度的降低[29]。MASANORI等將糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠的腸道菌群對比后發現，SMB53在糖尿病小鼠的豐度遠遠高于正常小鼠[30]。另有研究表明，Allobaculum能夠產生氧化三甲胺(TMAO)[31]，而TMAO能夠通過抑制法尼醇X受體調節膽汁酸代謝促進NAFLD[32]，Allobaculum豐度的升高可能促進NAFLD[33]。這些結果進一步表明3株LAB的干預升高了部分有益菌的豐度，降低了NAFLD小鼠腸道中部分條件致病菌的比例，這可能是保護肝臟損傷的機理之一。

圖8 基于LEfSe分析的腸道微生物菌群圖Fig.8 Cladogram of gut microbiota based on LEfSe analysis

a-Bifidobacterium; b-Mucispirillum; c-Turicibacter; d-Clostridium; e-SMB53; f-Dorea; g-Allobaculum; h-Akkermansia; i-Bacterodes; j-Bilophila; k-Dasulfovibrio; l-Lactobacillus圖9 不同干預對NAFLD小鼠腸道菌群屬水平的影響Fig.9 The effect of different treatment on genus level

2.8 CCFM8631的攝入對NAFLD小鼠影響的相關性分析

為了進一步確定LAB對NAFLD實現干預的主要途徑，我們將所有指標進行可視化處理，結果如圖10所示，將腸道內的因素與NAFLD病理相關指標進行相關性分析，結果如表2所示，將腸道菌群中有差異的OTU與短鏈脂肪酸水平進行相關性分析，結果如表3所示?？梢暬Y果顯示，所有組分為了2個大簇，NC、CCFM8631、L1和B1組位于同一簇，而RC、SC和HFHC組則位于另一簇，表明菌株干預組結果和NC組具有相似性，且與藥物干預組以及HFHC組具有差異。所有指標聚成了3個大簇，Turicibacter、Clostridium、SMB53和Allobaculum與肝臟病理主要指標(ALT、AST、肝臟TG和TNF-α等)聚集在同一大簇中，Clostridium同時與ALT、AST和肝臟指數聚集在一小簇，表明Turicibacter、Clostridium、SMB53、Allobaculum豐度的變化可能與肝臟病理形成相關。

圖10 各指標可視化結果Fig.10 The visualization of indicators

相關性結果顯示，4種SCFAs水平與肝臟TG、AST、CHE、TNF-α呈中度負相關性(r>0.4)。與已有的研究結論一致，表明4種SCFAs產量的提升可能通過減緩炎癥進一步延緩NAFLD的進程。Bifidobacterium、Bacteroides和Bilophila與肝臟的TNF-α呈強負相關，Lactobacillus和Desulfovibrio與肝臟IL-6以及IL-1β水平呈中度負相關。有報道稱，脂肪肝患者血清炎癥因子與Bifidobacterium、Bacteroides和Lactobacillus呈負相關[34]，炎性疾病的緩解伴隨著Bifidobacterium和Lactobacillus豐度的增加[35]，提示Bifidobacterium、Bacteroides、Bilophila、Lactobacillus和Desulfovibrio可能參與炎癥反應的負調控。Turicibacter、SMB53以及Allobaculum與促炎因子TNF-α、IL-6以及IL-1β呈中度正相關，表明Turicibacter、SMB53以及Allobaculum可能參與炎癥，與前人研究一致[27, 31]。肝硬化患者和NAFLD患者腸道菌群中Dorea豐度顯著高于健康人群[36-37]，Turicibacter和Dorea與肝臟TG、CHE呈中度正相關性，提示Turicibacter和Dorea可能促進肝臟線粒體損傷，從而加重肝臟脂肪堆積。綜上所述，小鼠腸道中Turicibacter、SMB53、Allobaculum和Dorea的豐度增加可能促進NAFLD的形成，Bifidobacterium、Bacteroides、Bilophila、Lactobacillus和Desulfovibrio的豐度增加可能阻礙NAFLD的形成，4種SCFAs水平的提高可能也是NAFLD緩解的因素之一。

表2 腸道內影響因素與NAFLD主要指標的相關性

注：*表示P≤0.05，**表示P≤0.01(下同)

表3 SCFAs與腸道菌群的相關性Table 3 Correlation between SCFAs and gut microbiota

腸道菌群中有差異的OTU與4種SCFAs的相關性結果顯示，乙酸、丙酸和異丁酸與Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus以及Bilophila呈中度正相關，因而Bifidobacterium、Bacteroides以及Bilophila的豐度與這3種SCFAs的產量有關。Turicibacter、SMB53、Allobaculum以及Clostridium與4種SCFAs呈強負相關，提示Turicibacter、SMB53、Allobaculum以及Clostridium可能與4種SCFAs的含量減少有關。CCFM8631的攝入顯著提高了腸道中4種SCFAs的含量，上調了Bifidobacterium、Lactobacillus和Desulfovibrio的豐度，降低了Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的豐度，因而CCFM8631緩解NAFLD可能與降低條件致病菌的豐度以及通過調節腸道菌群影響腸道內SCFAs的水平有關。然而L1和B1對NAFLD的緩解效果不佳，推測除以上調節方式外，CCFM8631可能還存在其他途徑共同參與了NAFLD的緩解。

3 結論

本研究通過對HFHCD小鼠灌胃3株LAB(CCFM8631、L1和B1)探究LAB對NAFLD形成的影響。其中CCFM8631具有相對最為良好的緩解NAFLD的能力。此外，CCFM8631的攝入顯著提高了腸道中4種SCFAs的含量，上調了Bifidobacterium、Lactobacillus和Desulfovibrio的豐度，降低了Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的豐度。對腸道內因素與病理指標進行相關性分析后發現，CCFM8631緩解NAFLD可能與降低條件致病菌的豐度以及通過調節腸道菌群影響腸道內SCFAs的水平有關。該研究為腸道菌群與NAFLD發生之間的關系提供參考，同時為實現膳食干預NAFLD提供依據。