基于比較基因組學的丁酸梭菌遺傳多樣性及生物學特性

易至，丁潔瓊，王鴻超，陸文偉,2，趙建新,2，陳衛,2，張灝,2*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫，214122)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是健康人類和動物腸道菌群的重要組成部分，其分布廣泛，由于能形成芽孢而具有較好的耐酸耐膽鹽等特性，可長期滯留于環境中。一般認為丁酸梭菌是非致病菌，它可以維持腸道菌群平衡，此外還具有增強機體免疫力、抗癌等功能[1-2]。丁酸梭菌現已廣泛用于動物養殖、水產和臨床醫藥等領域[3-5]，一些菌株已被成功開發微生態制劑，用作人類和動物的益生菌[6-9]。鑒于丁酸梭菌眾多的益生特性，丁酸梭菌的遺傳多樣性及其變化規律逐漸成為研究熱點。

近年來，隨著分子生物學技術和基因組測序技術的發展，采用比較基因組學等手段探究物種的遺傳多樣性逐漸成為研究重點。MO等[10]采用比較基因組學技術分析發現丁酸梭菌菌株DKU-01可代謝多種碳水化合物。BENAMAR等[11]使用全基因組測序和多間隔序列分型的方法分析了15株分離菌株和17株參考菌株，發現菌株之間存在高度變異性。此外，研究表示丁酸梭菌的許多益生作用歸因于其代謝產物，最重要代謝產物便是丁酸，對人類腸道健康發揮著重要作用[12]。丁酸梭菌還能代謝淀粉酶和果膠酶等酶類，這些酶可以產生促進有益菌增殖的因子，有助于宿主對碳水化合物等營養物質的吸收和消化[13-14]。因此丁酸梭菌的益生作用與其糖代謝能力有密切關系。PRUDEN等[15]提出抗生素抗性基因是一種新型環境污染物，存在耐藥基因轉移的風險，若通過轉移使致病菌獲得耐藥基因將帶來更大的危害。并且在實際應用中，抗生素的大量使用已經導致一些耐藥細菌的出現，所以用于開發微生態制劑的益生菌株的抗生素耐受性需要重視。此外，微生態制劑是否發揮作用關鍵在于是否能在人體內定植，而定植的必要條件是益生菌必須要有較高的胃液腸液耐受性，才能有效發揮其益生作用[16]。大量研究表明，丁酸梭菌菌株因可以形成芽孢而具有良好的胃腸道耐受性[17-18]。

本研究從150份健康人糞便樣品中分離出9株丁酸梭菌，采用比較基因組學的手段對其基因組進行分析，并測定其生物學特性，包括同源基因和特有基因、系統進化關系、碳源利用能力、抗生素耐受性和耐酸耐膽鹽能力。并通過基因層面結合表型實驗結果，綜合評估了丁酸梭菌的遺傳多樣性及生理特性多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和培養基

9株丁酸梭菌，分離于6份來自6個地區(黑龍江、新疆、四川、浙江、寧夏和上海)的健康人糞便，保藏于江南大學菌種保藏中心。

梭菌增殖培養基(reinforced clostridial medium，RCM)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉3 g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，NaCl 5 g，無水乙酸鈉3 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，刃天青4 mL(體積分數0.025%)，去離子水定容至1 L，pH值為6.8±0.1，115 ℃滅菌20 min。

1.1.2 實驗試劑

菊粉、赤蘚糖醇、甘露糖、纖維二糖、鼠李糖，上海生工公司；低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖，上海源葉生物科技有限公司；阿莫西林、紅霉素、環丙沙星、甲氧芐氨嘧啶、卡那霉素、克林霉素、利福平、鏈霉素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、四環素、萬古霉素、新霉素、胃蛋白酶，生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司；膽鹽，英國Oxoid公司。所有試劑均為分析純。

模擬胃液：稱取定量胃蛋白酶溶于無菌生理鹽水，調pH值為3，用0.22 μm無菌濾膜過濾后，使終質量濃度達到3 g/L；模擬腸液：稱取定量胰蛋白酶和膽鹽溶于無菌生理鹽水，調pH值為8，用0.22 μm無菌濾膜過濾，使終質量濃度分別達到1和3 g/L。模擬胃腸液現配現用。

1.1.3 儀器與設備

超凈工作臺，江蘇蘇凈集團有限公司；Whitley DG25厭氧工作站，英國Don Whitley Scientific公司； pH計，奧豪斯儀器(常州)有限公司；酶標儀，美國Thermo Fisher SCIENTIFIC公司；UV1800紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養和DNA提取

9株丁酸梭菌在補充有0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽的RCM培養基中，于厭氧條件下37 ℃培養菌株24～48 h，8 000 r/min離心5 min收集菌體。根據制造商的說明，使用TIANamp Bacteria DNA試劑盒提取基因組DNA。分別采用NanoDrop2000、picogreen和瓊脂糖凝膠電泳檢測方法對提取好的基因組DNA純度、濃度和完整性進行質量評估，達到測序要求后上機測序。

1.2.2 基因組測序及比較基因組分析

采用二代測序Illumina HiSeq×10平臺，對質檢合格的DNA樣品構建插入約400 bp的片段，進行PE150(pair-end)測序，測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。利用短序列組裝軟件SOAPdenovo v2.0進行組裝[19]，局部內間隙用GapCloser軟件進行填充。使用Glimmer v3.02 預測基因組中的蛋白編碼序列[20]。利用Orthomcl v2.0.9軟件基于蛋白序列進行BLAST比對(保持50%一致性；截點參數 E-value<1e-4)，再用 Markov 聚類算法進行聚類[21]。利用MAFFT v7.3軟件比對直系同源基因，提取聚類結果，利用鄰接法并使用phyML v3.1軟件構建系統發育樹[22]。使用HMMER v3.1軟件對菌株進行注釋，獲得碳水化合物活性酶基因注釋結果并將其與碳水化合物活性酶(CAZy, http://www.cazy.org/)數據庫進行比較[23]。與綜合抗生素研究數據庫(CARD 1.0.6, http://arpcard.Mcmaster.ca)進行比對分析，以獲得基因組中預測的抗生素抗性基因信息[24]，若抗性基因的序列匹配度達到30%(E-value <1e-5)，則認為該抗性基因存在。使用HemI v1.0.0軟件基于預測的基因繪制熱圖。

1.2.3 碳水利用能力測定

低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、赤蘚糖醇、甘露糖、纖維二糖和鼠李糖過濾除菌后，添加到不含糖的RCM液體培養基中，使其終質量濃度為10 g/L。將待測試的菌株接種于含不同碳源的培養基中，37 ℃厭氧培養48 h，酶標儀測定OD600，判定丁酸梭菌的碳源利用情況，若OD600值>0.3，則認為菌株可利用該碳源。以正常RCM培養基和不含糖的RCM培養基分別作為陽性和空白對照。

1.2.4 抗生素耐受能力測定

參照ISO標準ISO10932-2010，測定14種抗生素對丁酸梭菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，抗生素包括阿莫西林、紅霉素、環丙沙星、甲氧芐氨嘧啶、卡那霉素、克林霉素、利福平、鏈霉素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、四環素、萬古霉素和新霉素。

使用二倍稀釋法按標準稀釋抗生素。將倍比稀釋后不同濃度的抗生素溶液分別加入無菌的96孔板中，第1孔為空白對照，加入無菌水和RCM培養基各100 μL；第2～11孔中按照濃度由低到高加抗生素稀釋液各100 μL；第12孔為菌株生長陽性對照。將菌株活化后稀釋至105～106CFU/mL，取100 μL菌懸液加入96孔板中，37 ℃厭氧培養48 h后，酶標儀測定OD625來判定菌株對抗生素的MIC值。菌株不出現生長的抗生素濃度即為該抗生素對菌株的MIC值。

1.2.5 產孢能力測定

將活化的菌株以2%的接種量接種于RCM培養基中，于40 ℃、210 r/min搖晃厭氧培養24～48 h以激發芽孢萌發。將菌懸液在85 ℃下水浴加熱15 min，滅活營養細胞，得到芽孢懸液。熱處理前后的懸液分別梯度稀釋并傾注計數，根據營養細胞+芽孢總數、芽孢數量計算產孢率，如公式(1)所示。實驗設3次平行。

(1)

1.2.6 耐酸耐膽鹽能力測定

按照1.2.5的方法得到芽孢懸液，用無菌生理鹽水洗滌2～3次后離心收集芽孢體，再重懸于無菌生理鹽水。取1 mL芽孢懸液8 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸于1 mL模擬胃液，置于37 ℃厭氧孵育2 h后計數。同樣取1 mL芽孢懸液離心后，重懸于1 mL模擬腸液，置于37 ℃厭氧孵育4 h后計數。計算菌株存活率。實驗設營養細胞對照，并設3次平行。

1.2.7 數據分析

所有測定指標均進行3次重復實驗，所得數據用SPSS v20.0軟件進行統計分析，獨立樣本t檢驗用于分析組間顯著性差異，P<0.05被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 丁酸梭菌基因組概況及系統發育分析

本研究從150份健康人糞便樣品中分離得到9株丁酸梭菌。分別來源于6個地區，如表1所示，其中從FHLJZD47樣品中篩得4株丁酸梭菌。分離菌株的基因組大小在4.46～4.65 Mb，基因組大小變異度較小；鳥嘌呤和胞嘧啶含量(guanine & cytosine，GC)在28.49%～28.54%。分離自同一樣本的菌株基因組大小在4.48～4.65 Mb，GC含量在28.49%～28.54%。

表1 九株丁酸梭菌的來源信息及基因組概況Table 1 Source information and genomes of 9 Clostridium butyricum

基于全基因組序列比較分析丁酸梭菌的遺傳多樣性，包括9株實驗室分離得到的菌株與25株NCBI數據庫中已知的丁酸梭菌菌株(附表1，http://doi/org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023385)。如圖1所示，同源性分析結果顯示，34株丁酸梭菌共有346個同源基因，包括用于次生代謝產物的生物合成、氨基酸和碳水化合物轉運、代謝等基因，以及大量未知功能的基因。每個菌株的特有基因個數為4～1 501個，特有基因個數占該菌株的總基因數為6%～29%，表明菌株之間存在明顯差異。其中來自NCBI庫中的菌株INCQS635、NEC8和DORA_1特有基因數量與其他菌株差別較大。本實驗分離得到的9株丁酸梭菌的特有基因個數為24～109。其中FHLJZD47樣品分離得到4株菌的總基因數在4 006～4 203，特有基因數在23～68，即同一樣本分離的不同菌株基因組存在差異。

圖1 丁酸梭菌的特有和同源基因Fig.1 Venn diagram displaying the unique and orthologues gene of Clostridium butyricum

基于單拷貝直系同源基因，對34株丁酸梭菌菌株和NCBI數據庫中8株同屬不同種的相似模式菌株進行系統進化分析，如圖2所示。34株丁酸梭菌菌株成一亞簇，確定本研究所篩選菌株為丁酸梭菌。34株丁酸梭菌的進化與宿主來源沒有明顯相關性。根據本研究分離得到的9株菌的進化結果，可知菌株進化與地理來源之間也無明顯相關性；該9株菌系統進化關系遠近不同，表明菌株基因存在豐富的多樣性。根據FHLJZD47T2、FHLJZD47T4、FHLJZD47T8和FHLJZD47T9這4株菌的系統發育結果，發現4株菌分成2個小分支，可知來自同一個樣品里的菌株同源性高，但是也存在差異。BENAMAR等[11]通過系統發育分析，提出丁酸梭菌是一個在遺傳上具有多樣性的物種，這與本文研究結果一致。綜上，根據丁酸梭菌菌株基因組大小、GC含量、特有基因以及系統進化等方面，表明丁酸梭菌存在菌株水平上的基因組多樣性。

圖2 丁酸梭菌基于同源基因的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on homologous genes of Clostridium butyricum注：藍底：篩選菌株；紅底：NCBI丁酸梭菌菌株；灰底：NCBI相似種菌株；紫圈：人類糞便；黃圈：動物糞便；綠圈：牛瘤胃；橙圈：窖泥、污泥、廢水

2.2 丁酸梭菌碳源利用的特性

為了評估丁酸梭菌不同碳源利用能力，選取了8種不同碳源進行體外特性測定。結果如圖3所示，所有測試菌株都能夠利用甘露糖和纖維二糖，這結果與伯杰氏系統細菌學手冊[25]的結論一致。除菌株FHLJZD47T6外，其他菌株均能利用低聚果糖;除菌株FZJHZD6M2外，其他菌株均不能利用菊粉、赤蘚糖醇以及鼠李糖，可能是由于菌株的特異性。低聚木糖和低聚半乳糖的利用能力在所測試菌株中是可變的。同時該結果表明FHLJZD47樣品中的菌株碳源利用能力存在差異，這與系統進化分析結果一致。根據其他研究結果可知[13]，丁酸梭菌對甘露糖、纖維二糖能利用，對鼠李糖不能利用，與本實驗結果基本相符。

圖3 丁酸梭菌對不同碳源的利用情況Fig.3 Utilization of different carbohydrates of Clostridium butyricum

為進一步驗證丁酸梭菌碳源利用能力，我們基于碳水化合物活性酶庫(carbohydrate-active enzyme,CAZY)對丁酸梭菌的碳水化合物活性酶基因進行預測(圖4)，結果顯示其碳水化合物活性酶基因包括39個糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)、13個糖苷轉移酶(glycosyltransferase,GT)、9個碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases,CE)、8個碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding module,CBM)和2個多糖裂解酶(polysaccharide lyase,PL)家族，它們與甘露糖和纖維二糖等糖原利用相關。可見GH家族基因最多，其中GH13家族的基因最為豐富，基因個數在17～20個。GH13家族是淀粉酶等多糖利用相關基因。GH5家族可編碼β-甘露聚糖酶基因，GH94家族可編碼纖維二糖磷酸化酶基因，它們分別可以參與甘露糖和纖維二糖利用過程，與表型實驗結果一致。除FZJHZD-6M2外，其他8株菌株均存在木糖苷酶基因，但是FXJWS2T9、FSHCM43T2和FNXYCHL33卻不能利用低聚木糖。所有菌株均預測到β-半乳糖苷酶基因，而半乳糖是β-半乳糖苷酶代謝的底物之一，可是也存在3株菌不能利用。以上研究結果表明,個別菌株在基因層面和表型上存在差異，推測是因為編碼木糖苷酶的基因不能轉錄表達。其次，未預測到與菊粉、赤蘚糖醇和鼠李糖利用相關酶編碼基因，這與表型實驗結果一致性較高。

圖4 丁酸梭菌GH家族基因的預測Fig.4 Prediction of GH family genes of Clostridium butyricum

2.3 丁酸梭菌對抗生素的耐受性

本研究測試了9株丁酸梭菌對14種抗生素的MIC值，并根據EFSA[26]對芽孢桿菌屬抗生素耐受閾值的規定，將菌株劃分為耐受(R)和不耐受(S)，結果如圖5所示。這9株丁酸梭菌菌株普遍對氨基糖苷類抗生素(新霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素)耐受，半數菌株不耐受甲氧芐氨嘧啶，而絕大部分菌株都對阿莫西林、氨芐青霉素和四環素敏感，所有菌株對氯霉素、紅霉素、環丙沙星、萬古霉素、克林霉素和利福平敏感。ISA等[27]研究發現丁酸梭菌MIYAIRI 588和ATCC 19398T對卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素具有抗性，而對其他常用抗生素都特別敏感，這與本研究結果一致。同時，我們也發現FHLJZD47樣品中的菌株對甲氧芐氨嘧啶的耐受性存在差異，證明同一樣品中存在株水平的遺傳多樣性。

圖5 丁酸梭菌對不同抗生素的耐受性Fig.5 Resistance of Clostridium butyricum to different antibiotics注：上端抗生素斜體表示EFSA還未制定該抗生素芽孢桿菌屬耐受閾值

基于CARD數據庫對菌株基因組進行注釋，進一步探究丁酸梭菌抗生素基因型與表型的關系。如圖6所示，如圖6所示，9株丁酸梭菌菌株共預測到109種抗性基因，其中共有的抗性基因共63種，包括糖肽類抗性基因(vanWI，vanRI，vanRG，vanRF)、四環素抗性基因(tet35)、氟喹諾酮耐受基因(gyrA，mfd)、氨基糖苷類抗性基因(rpsL)、利福平耐受基因(rpoB、rpoC)、甲氧芐氨嘧啶抗性基因(dfrK)、林可酰胺類抗性基因(lmrC，lmrD)、β-內酰胺抗性基因(blaI，mecC，PBP1a)、大環內酯類抗性基因(macB)、氯霉素抗性基因(catB8)。可見在抗生素抗性基因層面，丁酸梭菌的抗性基因差異不大。

其中macB基因數量最多，它編碼一種ABC轉運蛋白，是一種抗生素外排泵，用于輸出大環內脂類物質，與紅霉素耐受相關。但是丁酸梭菌抗生素表型實驗結果顯示，丁酸梭菌對紅霉素并不耐受，推測該抗性基因在丁酸梭菌中沉默，需后期進一步實驗驗證，亦或是由于macB基因與CARD數據庫序列比對相似度不高(均<40%)。對于氨基糖苷類抗性基因rpsL基因在所有菌株中比對相似度均達到70%以上，該抗性基因可以使氨基糖苷類抗生素失活，由此證實了所測菌株對氨基糖苷類抗生素的普遍抗性。在FSHCM43T2菌株中blaI基因數大于其他菌株，表現出對氨芐青霉素和阿莫西林的抗性。研究表明[28]四環素耐藥的重要機制是tet基因編碼的活性藥物外排的結果，我們發現在菌株FNXYCHL33和FSHCM43T2中tet抗性基因與CARD數據庫序列比對結果的相似度可以達到97.0%，抗生素表型實驗也發現這2株菌對四環素具有抗性。

但對于其他抗生素也存在菌株基因型與表型并不對應的情況，例如在菌株FNXYCHL33中注釋到糖肽類抗性基因并且數量多，相似度最高達到52.6%，但表型顯示出對萬古霉素敏感，推測是由于基因、移動元件及其細菌宿主之間發生了復雜的相互作用[29]，阻礙了基因的表達。

圖6 丁酸梭菌抗性基因的預測Fig.6 Prediction of Clostridium butyricum resistance genes

2.4 芽孢形成顯著提高丁酸梭菌的耐酸和耐膽鹽能力

為探究丁酸梭菌耐酸耐膽鹽的能力，分別測定其營養體和芽孢體在模擬胃液和模擬腸液下的存活率。如表2、表3所示，9株丁酸梭菌的產孢率在34.72%～60.26%，但未能成功得到FSCDJY9T6、FSHCM43T2和FNXYCHL33這3株菌的芽孢體。通過比較營養體和芽孢體耐酸耐膽鹽特性，結果表明，丁酸梭菌芽孢體模擬胃腸液的耐受性相較于營養體得到顯著提升(P<0.05)，如菌株FXJWS2T9模擬胃液存活率從0.21%提升至9.04%，模擬腸液耐受性從1.18%提升至36.35%。丁酸梭菌芽孢體表現出對模擬胃液耐受性不強，但對模擬腸液的耐受性優于周非帆等[30]的實驗結果。菌株產孢率與存活率相比較發現，芽孢不是菌株耐酸耐膽鹽能力的絕對影響因素。推測還與細胞表層蛋白、胞外多糖產量以及分泌的膽鹽水解酶相關[31]。

表2 丁酸梭菌營養體在模擬胃液和模擬腸液下的存活率 單位：%

3 結論

本研究從6份健康人糞便樣品中分離出9株丁酸梭菌并完成了基因組測序，通過比較基因組學的方法，發現菌株在基因組大小、GC含量、特有基因數以及系統進化方面存在差異，表明丁酸梭菌在菌株水平存在基因組多樣性；宿主來源和地理來源與系統進化沒有顯著相關性；菌株的碳水化合物酶活性基因數和抗生素抗性基因數呈現菌株特異性。

表3 丁酸梭菌芽孢體在模擬胃液和模擬腸液下的存活率 單位：%

注：-表示無實驗數據

根據體外生物學特性實驗結果，發現9株丁酸梭菌菌株普遍能利用甘露糖、纖維二糖和低聚果糖，但不能利用菊粉、赤蘚糖醇和鼠李糖；菌株對氨基糖苷類抗生素耐受性高，對其他抗生素氯霉素、克林霉素和萬古霉素等普遍不耐受，菌株FNXYCHL33和FSHCM43T2呈現出對四環素的抗性，可能與菌株攜帶tet抗性基因相關；所有菌株芽孢體耐酸性不強但耐膽鹽能力較強，芽孢形成顯著提高丁酸梭菌的耐酸和耐膽鹽能力。與此同時，同一樣品中的不同菌株生物學特性表型結果存在差異，驗證了基因水平存在多樣性的現象。此外，通過比較基因組學分析丁酸梭菌基因型，并結合生物學特性表型實驗分析，發現菌株基因型和表型之間具有較高一致性，但存在部分菌株基因型與表型不匹配的情況。

附表1 NCBI丁酸梭菌和相似種的來源信息及基因組概況

注：“/”表示無樣本信息