乳汁中豬流行性腹瀉IgA抗體間接ELISA方法的建立

潘孝成，芮聰杰，2，沈學懷，趙瑞宏，尹 磊，戴 銀，胡曉苗，侯宏艷，周學利，張丹俊

（1.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽省畜禽疫病研究中心，畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031；2.伊寧市動物衛生監督所，新疆 伊寧 835000）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種以水樣腹瀉、脫水、嘔吐為主要特征的急性、高度接觸性腸道傳染病，各個品種和各個年齡階段的豬均易感，尤其對剛出生至10日齡以內的哺乳仔豬影響最為嚴重，表現為高病死率，病死率可高達100%[1-3]。初生仔豬免疫系統不完善，通過母源抗體獲得被動免疫是預防仔豬PED的重要方法[4]。PEDV主要侵害被感染仔豬的小腸上皮細胞，腸道黏膜免疫在抗病毒感染中發揮著重要的作用，IgA抗體的水平與機體抵抗PEDV感染的能力正相關[5-9]。因此建立檢測母豬乳汁中PEDV IgA抗體的間接ELISA方法，開展母豬PEDV免疫水平和效果的有效評估，對PED的防控具有重要的臨床實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2019年1—5月在安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所/安徽省畜禽疫病研究中心進行。

1.2 主要材料

PEDV-SD株，安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫研究室分離保存；Vero細胞、PEDV N蛋白重組質粒（pET-28B-N）及PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽性乳汁樣品和PEDV陰性乳汁樣品由安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫研究室制備保存；BL21（DE3）感受態細胞購自上海生工生物工程有限公司；四甲基聯苯胺（TMB）購于索萊寶生物科技有限公司；山羊抗豬IgA-HRP購于Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；Tween-20購于德國Bio froxx公司；牛血清白蛋白（BSA）購于美國Sigma公司；96孔ELISA包被板購于Corning公司。

1.3 PEDV全病毒純化抗原的制備

將PEDV-SD毒株接種于生長狀態良好、處于對數生長期的Vero單層細胞，當細胞病變達到80%時收獲病毒，反復凍融3次后，收集320 mL病毒液，加入32 mL的Triton X-100，室溫振蕩10 min，6 000 r/min 4℃高速離心20 min，收集上清液，于超速冷凍離心機45 000 r/min 4℃超速離心120 min，棄去上清液，沉淀用適量0.01 mol/L，pH為7.4的PBS充分溶解，即得豬流行性腹瀉病毒純化抗原，測定抗原濃度后分裝，-80℃冷凍保存。

1.4 PEDV重組N蛋白的制備和鑒定

將pET-28B-N重組質粒轉入BL21（DE3），接于含有卡那霉素的LB液體培養基中，250 r/min，37℃振蕩培養，當培養至OD600nm值達到0.4～0.6時，加入0.5 mmol/L的IPTG在15℃條件下誘導表達24 h，收集菌液，超聲波裂解，10 000 g離心2 min，收集上清液過鎳柱進行純化表達的重組N蛋白，并進行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。收集純化蛋白，-80℃保存備用。

1.5 間接ELISA方法的建立及優化

采用方陣滴定法，確定間接ELISA的PEDV N蛋白及純化全病毒兩種抗原的最佳包被濃度（0.5～8 μg/mL），包被液[0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液（CBS，pH 9.6）]，抗原包被條件（37℃孵育2 h后4℃16 h、4℃ 16 h、37 ℃孵育 2 h），封閉液的選擇[1%BSA、5%BSA、5%脫脂奶粉（SMP）]，待檢乳汁樣品的稀釋濃度（1∶10～1∶270），待檢乳汁樣品的反應時間（15～90 min），山羊抗豬 IgA-HRP 稀釋濃度（1∶5 000～1∶100 000），山羊抗豬IgA-HRP作用時間（15～90 min），TMB顯色時間（5～20 min）。

1.6 臨界值的確定

按以PEDV N蛋白及純化全病毒兩種抗原為包被抗原建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作，對36份PEDV IgA抗體陰性乳汁樣品進行檢測，每份樣品做兩個重復孔，計算出所檢測陰性樣品OD450nm值的平均值（X）和標準方差（SD）。樣品OD450nm值≥X+3×SD為陽性；樣品OD450nm值≤X+2×SD為陰性；介于兩者之間為可疑。

1.7 敏感性試驗

將PEDV抗體為陽性的乳汁樣品倍比稀釋，按已建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作測OD450nm，根據陰陽性臨界值，判斷其陰陽性，確定兩種方法的最低檢測稀釋度。

1.8 特異性試驗

按已建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作，對本實驗室制備的TGEV、PRV、CSFV、FMDV、PRRSV陽性乳汁樣品進行檢測，設立PEDV陽性和陰性乳汁對照，測OD450nm，根據陰陽性臨界值，判斷其陰陽性，評估兩種方法的特異性。

1.9 重復性試驗

選取4份陽性乳汁樣品及1份陰性乳汁樣品，每份樣品做4個重復，按已建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作，使用同批次PEDV N蛋白和濃縮純化的全病毒抗原，包被同一批次的酶標板，進行批內重復試驗，另外包被不同3批次的酶標板，進行批間重復試驗。

1.10 臨床樣品的檢測

按已建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作，對采集自河南、江蘇、安徽地區的6家開展PEDV免疫的種豬場（免疫次數為2次或3次）的共計198份母豬初乳樣品進行檢測，測OD450nm，根據陰陽性臨界值，判斷其陰陽性。

2 結果

2.1 表達蛋白的分析和純化

重組質粒轉入BL21（DE3），誘導表達后，菌液經超聲波裂解，離心后，收集上清液，過親和層析柱純化獲取重組N蛋白，SDS-PAGE分析顯示（圖1A），上清液、沉淀和純化后的產物均出現一條分子量約為58 KDa的條帶，與預期大小一致，目的蛋白以可溶性表達為主。利用PEDV陽性血清進行Westernblot檢測（圖1B），在目的位置出現明顯的特異性條帶。

2.2 間接ELISA方法的建立及反應條件確定

經測定純化后的PEDV全病毒和重組N蛋白濃度分別為3.95 mg/mL和1.23 mg/mL，以它們為包被抗原，分別建立檢測PEDV IgA抗體的間接ELISA檢測方法。通過方陣滴定法，確定了最佳反應條件（表1）。

表1 間接ELISA檢測方法反應條件優化結果

2.3 陰陽性臨界值的確定

用本試驗建立的兩種間接ELISA方法分別檢測36份陰性乳汁樣品，結果顯示，以PEDV全病毒作為包被抗原，樣品OD450nm≥0.431時，判定為陽性；OD450nm≤0.367時，判定為陰性；介于二者之間為可疑。以重組N蛋白為包被抗原，樣品OD450nm≥0.446時，判定為陽性；OD450nm≤0.381時，判定為陰性；介于二者之間為可疑。

2.4 特異性試驗

用本試驗建立的兩種間接ELISA方法在相同的反應條件下，分別對TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV陽性樣品進行檢測，并設置PEDV陰陽性乳汁樣品作為對照，結果顯示（表2），除陽性乳汁樣品外，其余樣品結果均為陰性，表明本試驗所建立的兩種間接ELISA方法均具有較好的特異性。

表2 間接ELISA特異性檢測結果

2.5 敏感性試驗

對本試驗建立的兩種間接ELISA方法進行敏感性檢測，結果顯示（圖2），以PEDV全病毒作為包被抗原，當陽性乳汁樣品稀釋到1∶960時，仍可檢測為陽性（OD450nm=0.699）；以PEDV重組N蛋白為包被抗原，當陽性乳汁樣品稀釋到1∶320時，仍可檢測為陽性（OD450nm=0.485）。說明建立的兩種間接ELISA方法均具有良好的敏感性。

2.6 重復性試驗

從表3的檢測結果可以看出，兩種間接ELISA方法的批內變異系數和批間變異系數均在3.39%～8.87%之間，變異系數均小于10%，表明本試驗建立的兩種間接ELISA方法均具有良好的可重復性。

表3 間接ELISA重復性試驗（n=5）

2.7 臨床樣品的檢測

用本試驗建立的兩種間接ELISA方法，分別檢測198份來自6家種豬場的乳汁樣品，結果顯示，以PEDV全病毒作為包被抗原，檢測樣本的陽性率為92.93%（184/198）；以重組N蛋白為包被抗原，檢測樣本的陽性率為90.40%（179/198）。兩種方法的檢測符合率為97.48%。

3 討論

本試驗以純化的PEDV全病毒抗原和重組N蛋白作為包被抗原，分別建立了檢測母豬乳汁中IgA抗體的間接ELISA方法，其陽性樣品檢測的最低稀釋度分別是1∶960和1∶320，批內和批間變異系數均小于 10%（3.39%～8.87%），與 TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV陽性樣品無交叉反應，兩種方法對臨床樣品的檢測符合率為97.48%。說明本試驗建立的兩種檢測PEDV IgA抗體的間接ELISA方法均具有良好的敏感性、重復性和特異性，能夠用于檢測和評估母豬乳汁中PEDV感染和免疫產生的IgA抗體水平，可為PEDV的感染和免疫效果的評價提供有效的檢測方法。

豬流行性腹瀉雖有多家商品化疫苗上市應用，但疫苗免疫對豬流行性腹瀉的控制成效并不顯著，免疫豬場的發病哺乳仔豬仍呈現高發病率和高病死率，豬流行性腹瀉目前在我國呈常態化，仍是嚴重危害養豬生產的重要疫病之一[10]。這種免疫效果不顯著的原因究竟是免疫程序不合理，還是疫苗毒株問題，有待進一步分析確定。PEDV主要侵害哺乳仔豬，并造成其大量死亡，特別10日齡內仔豬，而斷奶豬和成年豬，雖然也可感染發病，但大多可康復[1-2]。大量研究表明，哺乳仔豬主要通過母豬初乳中IgA抗體而獲得PED的被動免疫保護，因此母源抗體中IgA抗體水平高低對保護初生仔豬抗PEDV感染極為關鍵[11-12]。因此，本試驗建立的乳汁中IgA抗體檢測間接ELISA方法，可用于評估PEDV疫苗免疫效果和水平以及免疫程序的合理性，將有助于更好開展PED的防控。