山東省副豬嗜血桿菌流行現狀調查及啟示

寧慧波，王 鵬，劉 偉

[1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.海博萊生物科技咨詢（北京）有限公司，海淀 100086]

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,Hps）自1910年以來就被認為是豬格拉瑟氏病（Gl?sser's disease）的病原菌。該菌是上呼吸道的常在菌，通常定植在豬的鼻腔、扁桃體、氣管前段等部位，與豬的免疫系統保持著脆弱的平衡狀態。在應激等多種因素作用下，Hps可突破鼻黏膜的屏障，引起全身性的感染。臨床上主要表現為漿液性纖維蛋白性-化膿性多發性漿膜炎、多發性關節炎、腦膜炎、支氣管肺炎和敗血癥[1]。

豬是Hps的天然宿主。該病主要通過空氣傳播，一年四季均可感染，臨床上主要感染2周至4月齡的豬，尤其是5～8周齡仔豬。發病率在10%～15%，有窩發特點，死亡率可高達50%以上[2-3]。臨床死亡率取決于豬群感染菌株的毒力、仔豬的免疫力、豬群中并存病毒等其他病原體的穩定性及宿主遺傳抗性[4]。

隨著規模化養豬的發展，此病的發病率和死亡率均呈顯著上升趨勢。豬只即使能耐過，也會造成生長發育不良，因此Hps可給養豬業造成嚴重的經濟損失。美國、加拿大、西班牙等養豬業較發達國家早已有此病的報道，我國是世界上的養豬大國，由于多種病毒病的存在，導致養殖場對該病的防控并不予以重視。本研究通過臨床剖檢、PCR方法、細菌分離鑒定和藥敏試驗初步了解山東省副豬嗜血桿菌病最新流行及耐藥情況，為山東省副豬嗜血桿菌病的防控提供數據參考。

1 調查對象

從2017年10月至2018年5月，對山東省20家規模化豬場（存欄母豬＞500頭）進行現場調查，對疑似發病豬剖檢進行初步診斷。發病豬多表現為發熱、咳嗽、打噴嚏、呼吸困難、鼻腔有分泌物，消瘦（圖1）、生長緩慢、跛行等癥狀。部分病豬剖檢可見腹股溝淋巴結腫大出血（圖2）；脾臟邊緣出血（圖3）；腫脹關節切開呈膠凍樣，關節腔內有漿液性炎性滲出液（圖4）；心外膜與心臟粘連在一起，形成“絨毛心”狀（圖5）；腹腔內臟器官粘連，呈現纖維性腹膜炎（圖6）；肝臟表面覆有一層干酪樣滲出物，形成肝周炎（圖7）。參照Magyara及Donkó等[5-6]的方法：沿第1、第2前臼齒之間垂直鋸開豬鼻進行鼻甲骨病變評分，呈現重度萎縮（圖8）。

2 臨床材料

分別從20個調查豬場剖檢采集病料，從心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腹腔積液和關節液等部位無菌操作取樣。

3 實驗室檢測

3.1 主要試劑

TSA（胰蛋白胨大豆營養瓊脂培養基）、TSB（胰蛋白胨肉湯營養瓊脂培養基）、NAD（氧化型輔酶1，終濃度終濃度0.1 g/mL）、犢牛血清（終濃度10%）、1×PBS、1.5%瓊脂糖凝膠。

3.2 PCR檢測

采取病豬淋巴結、肺臟、大腦研磨提取DNA/RNA，進行PCR檢測，具體見表1。

表1 PCR/RT-PCR引物片段

3.3 組織病理學檢測

對剖檢豬的腦、肺、淋巴結及扁桃體取樣，10%中性福爾馬林溶液固定，常規石蠟切片，HE染色，鏡檢。

3.4 細菌分離鑒定

將無菌采集的豬心包液、關節液等分別接種于血瓊脂培養基，37℃培養48 h，挑取可疑單個菌落進行純培養。挑取菌落涂片，經革蘭氏染色、鏡檢。

3.5 藥敏試驗

通過PCR鑒定菌株的懸液，將TSB純培養物吸取0.2 mL無菌棉棒涂布含犢牛血清（終濃度10%）和NAD（終濃度0.1 g/mL）的TSA培養基，待干后，用無菌鑷子將藥敏片等距平貼于培養基表面，置37℃培養24～48 h后觀察結果。判定標準：抑菌圈直徑d≥20 mm為高度敏感，15 mm＜d＜20 mm為中度敏感，d≤15 mm為低度敏感，無抑菌環為不敏感。選取藥物為：頭孢噻呋鈉30 μg/片、強力霉素30 μg/片、氟苯尼考 30 μg/片、恩諾沙星 5 μg/片、阿米卡星 30 μg/片、阿莫西林 10 μg/片、慶大霉素 10 μg/片。

4 結果

4.1 臨床剖檢調查結果

現場剖檢發現，40%的豬場存在典型的副豬嗜血桿菌發病癥狀，如胸腹腔積液、肝周炎、心包炎等。所調查的豬場100%存在萎縮性鼻炎感染發病的情況，并且鼻甲骨均為重度萎縮。

4.2 PCR檢測結果

經PCR檢測，Hps的檢出率為45%（圖9），藍耳病的檢出率為 40%（圖 10），55.56%（5/9） 的 Hps感染豬場存在藍耳病混合感染現象。

4.3 組織病理學檢測結果

鏡檢可見化膿性腦膜炎病變，腦膜血管充血，大量中性粒細胞浸潤（圖11）；肺泡壁毛細血管充血，肺泡腔和支氣管內大量中性粒細胞浸潤（圖12）；淋巴結呈漿液性淋巴結炎病變，淋巴小梁及實質中毛細血管充血，水腫（圖13）；扁桃體毛細血管充血，隱窩擴張，內含中性白細胞（圖14）。

4.4 細菌分離鑒定結果

TSA培養基可見無色透明、邊緣整齊的小菌落（圖15）；革蘭氏染色可見散在絲狀、大小不等的革蘭氏陰性細小桿菌（圖16）。

細菌分離培養發現，35%的豬場存在副豬嗜血桿菌的感染，其中部分剖檢存在典型副豬嗜血桿菌感染的豬場未分離出該菌，這與抗生素的治療使用或許存在一定關系。另外部分剖檢未發現典型副豬嗜血桿菌感染的豬場分離出該菌，這或許與感染的副豬嗜血桿菌血清型存在一定聯系。對于副豬嗜血桿菌某些血清型，如 3、6、7、9、11 型，豬感染后通常無明顯臨床癥狀及病理變化。

4.5 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，分離到7株副豬嗜血桿菌整體對恩諾沙星、頭孢噻呋鈉高度敏感；對阿米卡星、慶大霉素中度敏感；對阿莫西林、氟苯尼考、強力霉素低度敏感（表2）。

表2 藥敏試驗結果 mm

5 調查啟示

5.1 Hps在山東省規模化豬場廣泛存在

本次調查中，現場剖檢發現，40%的豬場存在較為典型的Hps病理變化；通過對病料進行PCR鑒定，45%的豬場病料為陽性；通過細菌分離培養，35%的豬場分離到該菌。3種診斷方法的結果一致表明，Hps在山東省規模化豬場普遍存在。

5.2 臨床混感較為普遍

Hps是一種上呼吸道的常在菌，也是一種條件性致病菌，在不利的飼養環境、應激及其他病原菌侵襲下，可突破鼻黏膜屏障，引發全身性的感染。所以臨床上該菌常與萎縮性鼻炎、藍耳病、圓環病毒病等疾病混合感染[7-9]。鋸鼻結果顯示，所有豬場均存在重度萎縮性鼻炎病變；PCR鑒定結果顯示，55.56%的Hps感染豬場存在藍耳病混合感染現象；應引起高度重視。

5.3 抗生素預防及治療效果不佳

豬細菌病可以選用敏感藥物來預防及治療，但是Hps的耐藥性產生較快，大量長期使用抗生素會造成藥物的敏感度日趨下降，從而影響該病的防控效果[10-11]。另外，Hps屬于革蘭氏陰性菌，被抗生素殺滅的同時會釋放內毒素，使機體發熱，容易造成多重感染。盡管抗生素可以殺滅細菌，但是其不能抑制內毒素的生物活性。此次調查的豬場均在哺乳仔豬階段進行了藥物預防，從發病率來看，藥物預防效果并不理想。對分離菌株進行的藥敏試驗，進一步說明了該菌的耐藥性較強。

5.4 臨床剖檢需與其他疾病鑒別診斷

臨床剖檢疑似Hps感染病例多以纖維素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、腦膜炎、關節炎等為特征。但這些全身性感染的臨床癥狀及病變并非該病原的特異性變化。非溶血性大腸桿菌、放線桿菌、豬鼻支原體會引發纖維素性多漿膜炎[12]；鏈球菌、豬丹毒、豬滑液支原體可以引發跛行與關節炎[13]；豬偽狂犬病病毒及鏈球菌會引發中樞神經系統癥狀；因此診斷時需要與其他病原進行鑒別診斷。如不能確診，可以通過PCR和細菌分離等方法進行確診，以避免因誤診而造成不必要的損失[14]。

5.5 實驗室檢測工作繁瑣且要求嚴格

現實生產中可以通過豬群的臨床癥狀及病理剖檢進行初步診斷。如要確診，還需要通過PCR、組織病理學及細菌分離培養等方法。臨床采集的病料可以直接用于PCR檢測，若要進行藥敏試驗或細菌分型，則需要進行細菌分離培養。但是Hps生長條件要求苛刻、生長速度緩慢、死亡快，培養難度較大[15]。細菌培養時首先應選取臨床癥狀典型且未經過抗生素治療的發病初期的病豬，用棉拭子在心包、關節、腦膜等封閉狀態部位采集。鑒于Hps是上呼吸道的常在菌，健康豬的鼻腔、扁桃體、氣管部位可分離出該菌；盡管其可以引發肺炎，但未必是引發肺炎的真正病原，可能是豬感染其他病原或者死亡后，該菌沿呼吸道下行侵入的，故臨床中一般不建議肺組織采樣。由于該菌很難在室溫下存活，所以采集的病料應12～24 h內盡快送檢，以提高細菌的檢出幾率。

5.6 需采取更合理有效的方法進行防控

我國養豬水平逐年提升，但是作為常在菌和條件性致病菌的Hps，在豬群受到各種應激或者其他疾病感染時，其常常并發或者繼發而在臨床中呈現，給豬場的疾病防控帶來了很大的困擾。盡管可以采取口服或者肌注抗生素來預防，但必須要在臨床癥狀出現前使用才會有效果；而一旦該菌進入了漿膜、腦組織及關節后，抗生素將難以發揮作用。長期使用抗生素預防勢必造成耐藥性的增強，并且治療時會產生內毒素，最終影響治療效果。因此，需采取更加合理有效的防控手段。

在豬場生產中，Hps在豬群中反復循環，可以通過水平傳播和垂直傳播。出生1周齡內的仔豬，其鼻腔黏膜很容易存在該菌的寄生。因此，來自母豬的母源抗體和天然免疫是控制該病的關鍵性因素[15]。母豬免疫不僅能減少降低本身感染的幾率，同時也能減少仔豬上呼吸道Hps的定居數量以及定居菌株的血清型種類[16]，從而降低仔豬全身性感染的風險。通常情況下，母豬未免疫，其母源抗體一般2周內消退非常明顯；而母豬免疫，其母源抗體可對6周內的仔豬產生保護。若仔豬后期感染壓力較大，可考慮對2～3周齡仔豬進行免疫。

Hps血清型眾多，盡管目前定型的有15種，但是依然有20%以上的菌株不能分型。雖然我國分離的血清型和歐美報道的一致，都是以4型和5型為主[17-18]，但是一個豬群中常出現幾個菌株或血清型，甚至在單個豬上不同部位可以分離多個菌株或血清型[19]。所以，選擇具有良好交叉免疫力的菌株及血清型的疫苗尤為重要[20]。

6 小結

近幾年，我國養豬產業取得了快速的發展，但副豬嗜血桿菌病已成為規模化豬場主要的細菌性傳染病之一，該病的高發病率和死亡率使廣大豬場蒙受較大的經濟損失，同時也使得豬場耐藥性及用藥成本增加的現象頻頻發生。本次調查研究發現山東省規模化豬場普遍感染副豬嗜血桿菌，并存在與豬萎縮性鼻炎、藍耳病混合感染的情況；分離菌株的耐藥性較為嚴重。該研究為副豬嗜血桿菌的流行病學研究奠定了基礎，也為該病的臨床預防提供了理論依據。

病毒是否通過糞口傳播待查

這兩天在湖北省武漢市、廣東省深圳市甚至在美國的首例病例中都在確診患者的糞便中檢測到了新型冠狀病毒核酸。2月2日，在國家衛健委新聞發布會上，中國疾控中心傳染病處研究員馮錄召表示，這個現象說明了病毒可以在消化道復制并且存在，但是不是通過糞口傳播，或者通過含有病毒的飛沫形成氣溶膠的方式再傳播，需要流行病學調查和研究進一步證實這個現象。國家衛健委疾控局副局長王斌表示，隨著假期臨近結束，各行各業的人陸續返回工作崗位。針對這樣一個防控形勢，已針對不同人群，分類制定了不同的防護規范和指南。

（摘自《健康報》2020.02.03葉龍杰/文）