2型豬鏈球菌河南株的生物學特性研究

王治方，徐引弟，張青嫻，朱文豪，焦文強，李海利，許 峰，王克領，張 彬，婁治國

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的一類急性、熱性傳染性疾病，屬于國家規定的二類動物傳染病，臨床上主要引起豬的敗血癥、腦膜炎、關節炎等病癥，是世界范圍內養豬業最常見的細菌性疾病之一[1]。

豬鏈球菌血清型較多，基于豬鏈球菌莢膜多糖抗原的不同，豬鏈球菌一度被分為35個血清型，分別是1～34和1/2型。2005年，Hill等[2]進一步驗證，32型和34型并不是豬鏈球菌，豬鏈球菌劃分為 33個血清型（1/2型、1～31型、33型）；而有最新的研究報告指出，血清型20型、22型、26型和33型屬于其他新的物種，應該從豬鏈球菌中分離出來[3]。因此，目前認為豬鏈球菌有29個血清型，其中豬鏈球菌2型毒力最強、流行最廣，能夠引起人類的感染發病和死亡，是國內防控豬鏈球菌病的主要血清型之一，在畜牧業和公共衛生方面意義重大。

近年來，隨著我國養豬業集約、規模化的發展，豬鏈球菌病的發生呈現上升趨勢，而且經常作為主要病原繼發于豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒病等病毒性疾病，給豬場臨床疾病診療控制帶來不小的困難，給養豬企業造成不小的經濟損失。試驗于2019年5—8月在河南省農業科學院畜牧所動物傳染病研究室進行，通過對河南省豫東某規模化豬場疑似豬鏈球菌病例采集病料，進行實驗室的分離純化、病原及血清型鑒定為2型豬鏈球菌，同時對該株豬鏈球菌做了動物試驗、藥敏試驗、毒力基因和耐藥基因檢測研究，旨在為2型豬鏈球菌病的防控提供參考依據。

1 材料

1.1 病料

2019年5月河南省豫東某規模化豬場保育豬群發生呼吸困難、關節腫大，部分豬只有神經癥狀的病例，剖檢瀕死期病豬，采集腦、肺臟、肝臟、血液和關節液等病料。

1.2 主要試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）購自美國Difco公司；新生牛血清購自鄭州益康生物工程有限公司；革蘭氏染液試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；抗生素藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；微生物微量生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；微生物DNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker、Lording buffer、2×Taq Master Mix等均購自寶生物（大連）工程有限公司；相關引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 試驗動物

體重20 g左右的健康小白鼠5只，購自鄭州大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 病原的分離、純化

無菌采集的腦、肺臟、肝臟、血液和關節液分別劃線接種于TSA平板（含5%的新生牛血清），放置于培養箱37℃培養18～24 h后，挑選可疑菌落純化、革蘭氏染色鏡檢。

2.2 可疑菌PCR檢測和血清型檢測鑒定

2.2.1 引物設計 通過聚合酶鏈式反應（PCR）對純化好的可疑菌株進行鑒定和血清型分型鑒定。參照文獻[4-6]設計合成豬鏈球菌通用引物和33種血清型引物，引物序列和擴增片段長度見表1。

表1 豬鏈球菌PCR分型引物序列及相關信息

表1 豬鏈球菌PCR分型引物序列及相關信息（續）

2.2.2 PCR檢測鑒定 DNA提取：取上述TSB液體培養物1 mL于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清液收集菌體沉淀；按照DNA提取試劑盒說明書提取菌體DNA，以提取可疑菌的DNA為模板，進行PCR擴增鑒定。

PCR 反應體系（25 μL）：2×Taq Master Mix 13 μL，上、下游引物各 1 μL，ddH2O 8 μL，模板 DNA 2 μL。PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環；72℃延伸5 min；4℃保存備用。

電泳：取10 μL PCR擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測，紫外透射分析儀觀察結果，比照DL 2 000 DNA Marker確定條帶大小。陽性PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果進行BLAST軟件比對。

2.3 毒力基因檢測

2.3.1 引物設計 參考文獻[7-9]設計合成了3對豬鏈球菌毒力基因（胞外因子epf基因、溶血素sly基因、溶菌酶釋放蛋白mrp基因）引物，各對引物序列和擴增片段長度見表2。

表2 毒力基因引物序列及相關信息

2.3.2 DNA提取及毒力基因檢測 DNA提取方法同上述2.2.2。

PCR 反應體系（25 μL）：2×Taq Master Mix 13 μL，上、下游引物各 1 μL，ddH2O 8 μL，模板 DNA 2 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，進入循環：95℃1 min，57℃ 1 min，72℃ 30 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min，PCR產物4℃保存備用。電泳：取10 μL PCR擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測，紫外透射分析儀觀察結果，比照DL 2 000 DNA Marker確定條帶大小。

2.4 致病性試驗

挑選純化好的單個菌落接種于TSB（含5%的新生牛血清）液體培養基中，放置于培養箱37℃培養18 h后，計數并用生理鹽水稀釋菌數約為1×108CFU/mL，腹腔注射小白鼠3只，0.2 mL/只，作為試驗組；同時準備小白鼠2只腹腔注射生理鹽水0.2 mL/只，作為空白對照組。接種后觀察記錄每組發病情況，并對發病小鼠進行細菌分離鑒定。

2.5 藥物敏感性試驗

藥敏試驗采用瓊脂擴散法（K-B法）[10-12]。挑取已純化過的TSA平板上若干單個菌落，置于0.9%滅菌生理鹽水中，制成菌懸液，濃度為0.5麥氏單位（比色儀比色），取200 μL用滅菌棉拭子均勻涂抹于TSA平板（含5%的新生牛血清）上，涂抹4個平板。挑取臨床上常用的抗生素藥敏片，用滅菌鑷子把藥敏片均勻貼在涂有菌液的平板上，于37℃培養24 h，取出觀察記錄藥敏片抑菌圈直徑，判斷標準參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）2005版。

2.6 耐藥基因檢測

2.6.1 引物設計 參考文獻[13-15]，設計5大類24個耐藥基因包括β-內酰胺類（blaTEM、blaOXA-1、blaCTX-M-2、blaSHV、blaIMP-1、blaDHA-1）、氨基糖甙類[aadA1、aadA2、strA、strB、aadB、aacC2、aac(3)-IV、aphA1]、四環素類[tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(G)]、喹諾酮類（gyrA、parC） 和磺胺類（sul1、sul2、sul3）基因的引物，用于本菌株的耐藥基因的檢測擴增，5大類24對耐藥基因引物序列及相關信息見表3。

2.6.2 耐藥基因PCR擴增 模板DNA的提取方法同上述2.2.2。用表3中24對耐藥基因的引物進行擴增檢測。

反應體系為 25 μL：2×Taq Mix 12.5 μL，10 μM/L 上下游引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，加ddH2O 至25 μL。反應條件：95 ℃預變性 5 min，進入循環：95℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共 35個循環，最后72℃延伸10 min，PCR產物4℃保存。取10 μL擴增產物電泳，紫外光下觀察結果，陽性產物測序。

表3 不同種類抗生素耐藥基因的引物序列及相關信息

3 結果

3.1 細菌分離培養純化

在接種病死豬腦組織的TSA平板（含5%的新生牛血清）上，形成均一的表面光滑濕潤、邊緣整齊、圓形的半透明、略帶藍色熒光的小菌落；其他樣品接種的TSA平板（含5%的新生牛血清）上未見可疑細菌生長。挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性，菌體呈球形或卵圓形，呈單個、成對或短鏈存在（圖1）。

3.2 菌株鑒定和血清型檢測

通過用豬鏈球菌通用引物對分離菌株進行PCR鑒定，結果分離菌株和豬鏈球菌標準株均在500～750 bp之間的689 bp出現目的條帶（圖2），與預期片段一致。

通過用33對豬鏈球菌血清型引物對分離菌株進行血清型分型鑒定，結果分離菌株在豬鏈球菌2型引物擴增陽性，出現目的條帶557 bp（圖3、圖4），測序與豬鏈球菌LSM102株（GenBank No.:CP016175.1）99%同源，證明所分離菌株為血清型2型豬鏈球菌。

3.3 毒力基因

用3對毒力基因引物對分離菌株進行PCR擴增檢測，結果分別擴增出626 bp、885 bp、1 502 bp大小3個片段，結果見圖5，證明該豬鏈球菌分離菌株攜帶有胞外因子（epf）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）和溶血素（sly）毒力基因。

3.4 致病性試驗結果

在攻毒15 h后，試驗組3只小白鼠相繼發病，先后出現轉圈、共濟失調及抽搐等癥狀，攻毒24 h后試驗組3只小白鼠相繼死亡，立即剖檢用心血、肝臟觸片，革蘭氏染色鏡檢，均發現有革蘭氏陽性球菌，呈單個、短鏈狀排列。同時無菌采集試驗組死亡小白鼠的心血、肝臟接種TSA平板（含5%的新生牛血清，1/10萬的NAD），37℃培養18 h后，經鑒定，均獲得和接種菌株相一致的單一細菌。攻毒48 h后，對照組健康，未見任何臨床癥狀。

3.5 藥敏結果

挑選5類18種抗生素對豬鏈球菌分離菌株作了藥物敏感性試驗，參照藥敏片說明書判斷敏感性，結果見表4。藥敏結果顯示，該株豬鏈球菌對β-內酰胺類（頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、青霉素）、喹諾酮類（左氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星）、磺胺類（復方新諾明）和氨基糖苷類的壯觀霉素敏感；對氨基糖苷類（卡那霉素、阿米卡星）、大環內酯類（阿奇霉素、替米考星）和四環素類（強力霉素、四環素、土霉素）耐藥。

表4 藥敏試驗結果

3.6 耐藥基因檢測

用24對耐藥基因引物對該豬鏈球菌分離菌株進行耐藥基因擴增檢測，結果blaTEM和strB基因擴增出現目的條帶（857 bp和509 bp），與預期條帶大小一致（圖6），證明該豬鏈球菌分離株攜帶有β內酰胺類耐藥基因blaTEM和氨基糖苷類耐藥基因strB。

4 討論

豬鏈球菌病仍是養豬行業的重要細菌性疾病，常常單獨發生或作為繼發病原繼發感染于病毒病之后，給養豬行業造成不小的經濟損失。豬鏈球菌血清型較多，其中血清型1/2、1型、2型、7型、9型致病性較強[4，16]，臨床檢出率較高，常常引起豬的敗血癥、腦膜炎、關節炎及心內膜炎等病癥，2型豬鏈球菌病更能引起人的感染發病或死亡。本試驗從病死豬腦組織中分離得到一株豬鏈球菌，通過血清型分型鑒定和測序比對，證實該臨床分離菌株為2型豬鏈球菌。

豬鏈球菌菌株的致病性強弱與其攜帶的毒力基因密切相關，一般把胞外因子（epf）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、溶血素（sly）作為豬鏈球菌毒力指示蛋白用來區分菌株毒力的強弱，epf+/mrp+/sly+常被認為與高致病性菌株相關[3，17]。通過毒力基因檢測結果表明，該2型豬鏈球菌分離菌株同時攜帶胞外因子（epf）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）和溶血素（sly）3種毒力基因，證明該菌株是高致病性菌株，致病性試驗結果再次印證了該菌株的毒力。

通過藥敏試驗結果表明，該株2型豬鏈球菌對頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、青霉素、復方新諾明、左氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、壯觀霉素敏感，而對卡那霉素、阿米卡星、阿奇霉素、替米考星、四環素、強力霉素、土霉素表現出高度耐藥，說明該株豬鏈球菌對大部分氨基糖苷類、大環內酯類和四環素類藥物產生較為廣泛的耐藥性。與國內的有關研究報道[18-19]，國內豬鏈球菌對環丙沙星、阿奇霉素、四環素、磺胺類等藥物耐藥嚴重有一定不同。治療該株豬鏈球菌引發疾病首選藥物還是β-內酰胺類藥物，考慮到臨床有腦炎神經癥狀，應當配合磺胺類藥物聯合使用，該發病豬場臨床實踐用藥效果證實了聯合用藥效果。對該株豬鏈球菌進行24個耐藥基因檢測，只檢測出β-內酰胺類的blaTEM基因和氨基糖苷類的strB基因，對比表型耐藥結果，再次說明耐藥菌株耐藥基因的檢測結果和表型耐藥結果的不一定符合性，進一步說明細菌耐藥性產生機理的復雜性，需要進一步進行深入研究和探索。

喝咖啡可延年益壽

【美聯社美國芝加哥7月2日電】新的研究顯示，咖啡可能有助于延長壽命，即使是那些每天飲用至少8杯的人也是如此。

在一項對英國近50萬名成年人進行的研究中發現，喝咖啡者的死亡風險比堅決不喝者略低。

這種延年益壽的效果對于速溶、研磨和脫因的咖啡來說都有效。美國進行的研究也是相同效果。這是第一次有大型研究表明，即使對于那些有基因缺陷、影響到機體攝取咖啡因的人來說，喝咖啡也是有好處的。

總體而言，在為期10年的跟蹤研究中，喝咖啡者比堅決不喝者的死亡風險低10%到15%。

并未參與這項研究的美國塔夫茨大學營養專家艾麗斯·利希滕斯坦說，這個結果并不能證明咖啡壺就是“不老泉”，也不應成為不喝咖啡者開始喝咖啡的理由。但她說，這些結果印證了此前的研究，并給喝咖啡者提供了額外的信心。

利希滕斯坦說：“很難相信我們那么喜歡的一個東西對我們來說有這么大的好處。或者說，至少不是壞事。”

這項研究結果今天發表在《美國醫學會雜志·內科學卷》雙周刊上。

目前尚不完全清楚喝咖啡是如何影響壽命的。

研究負責人、美國國家癌癥研究所研究員埃麗卡·洛夫特菲爾德說，咖啡含有1 000多種化合物，其中包括有助于保護細胞免受損傷的抗氧化物。

其他研究表明，咖啡中的物質可以減輕炎癥并改善人體對胰島素的用法，從而降低患糖尿病的幾率。

咖啡因可導致血壓短期升高。一些較小規模的研究表明，咖啡因可能與高血壓有關。不過，在英國進行的這項研究表明，喝咖啡者并不比不喝者在心臟病和其他與血壓有關的疾病方面風險更高。

和以前的研究一樣，喝咖啡者比不喝咖啡者更有可能飲酒和抽煙，但即使研究人員考慮了這些因素，喝咖啡似乎也能抵消掉這些因素。

（轉自 參考消息[N]，2018-07-04）