MC4R基因、SIM1基因在從江香豬不同組織中的mRNA表達規律研究

李 俊，毛世明，周 迪，馮文武，李 平，陳大芳，龍清孟，李建偉，謝 艷，王 舍，唐明宗

（貴州省種畜禽種質測定中心，貴州 貴陽 550021）

黑素皮質激素受體-4（Meloaocrtin Recepto-4,MC4R）是下丘腦腹內側核（ventromadial hypothalam,VMH）分泌的一種肽類物質，在哺乳動物中主要與食欲和能量穩態的調節有關，是第一個發現的與人類顯性遺傳性肥胖相關的靶位點[1]。而SIM1（Singleminded 1）基因是一種編碼與神經發生有關的轉錄因子，是堿性-螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）轉錄因子超家族中新發現的亞家族成員之一[2]，通過影響下丘腦視上核和室旁核神經內分泌細胞在哺乳動物能量平衡調節中的作用，從而影響動物的采食行為，可導致食欲過盛、肥胖和體重增加[3]。相關研究發現，SIM1+/-和SIM1-/-小鼠食量增加，比同窩正常小鼠肥胖，且催產素（Oxytocin）和黑素皮質激素（MC4R）在下丘腦內的表達量顯著降低[4]；由此推測，SIM1基因可能參與瘦素—黑素皮質激素—催產素這一調控途徑，進而導致肥胖[5]。本研究擬從mRNA水平，研究MC4R基因和SIM1基因在從江香豬不同組織中的表達差異，為進一步探索MC4R基因和SIM1基因的遺傳效應和肉質調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗時間與地點 試驗于2018年3月至2019年6月在貴州省貴陽市烏當區羊昌鎮綠生源香豬生態福利養殖場和中心實驗室進行。

1.1.2 試驗動物 試驗對象選取8月齡從江香豬2頭，采自貴陽市烏當區綠生源畜牧科技公司香豬生態福利養殖場；取其脂肪、脾臟、心臟、肺、胃、腎臟、小腸、背肌、肝臟9種組織樣，用生理鹽水或DEPC水沖洗后，再用錫箔紙包好立即放入液氮速凍，然后轉入-80℃保存。

1.1.3 主要試劑和儀器 Trizol總RNA抽提試劑盒、熒光染料UltraSYBR Mixture SYBR GreenⅠ、異丙醇、DEPC（焦碳酸二乙酯）處理水購于北京鼎國生物工程技術有限公司；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、DL 2 000 DNA Marker購自上海生工生物工程技術服務有限公司；去離子水、無水乙醇、TAE緩沖液等試劑實驗室自備。熒光定量PCR儀（CFX96），凝膠成相系統（G：BOX F3），紫外分光光度計（NanoDrop-ONE），去離子純水儀（Milli-Q Intergral 3），微量移液器（eppendorf）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取 用Trizol總RNA抽提試劑盒提取RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統照相保存，并用紫外分光光度計測量每個RNA樣品濃度3次，取其平均值，用ddH2O將所有DNA樣品調至100 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1.2.2 cDNA第一鏈合成 本試驗中第一鏈cDNA合成參照上海生工生物工程技術服務有限公司MMuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明進行操作，逆轉錄產物可直接用于PCR反應或-80℃保存。

1.2.3 引物設計與PCR擴增 參照GenBank上公布的豬MC4R基因mRNA序列（登錄號：DQ482582.1）、SIM1基因mRNA序列（登錄號：NM_001172585.2）、GAPDH內參基因mRNA序列（登錄號：KJ786424.1）為模板，按照目的片段橫跨2個外顯子的原則，運用NCBI中的Primer-BLAST設計引物，委托賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成，引物序列及擴增條件見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.2.4 PCR反應體系及條件 采用20 μL PCR反應體系，即 cDNA 模板 1 μL，2×2×UltraSYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，RNase-Free water 8 μL。PCR反應條件為：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，退火30 s（退火溫度見表1），72℃延伸32 s，共34個循環；溶解曲線分析：95℃ 30 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60 ℃ 15 s。

1.2.5 數據處理 采用SPSS 18.0軟件單因素方差分析對數據進行統計分析，利用Excel對數據結果進行作圖。目的基因相對表達量采用2-△△Ct方法計算，計算公式如下：目的基因相對表達量=2-△△Ct。其中△△Ct=（處理組目的基因Ct值-處理組內參基因Ct值）-（對照組目的基因Ct值-對照組內參基因Ct值）。

2 結果與分析

2.1 PCR產物特異性及擴增效率分析

對內參基因及目的基因進行熒光定量檢測，觀察其擴增結果。GAPDH基因、MC4R基因和SIM1基因溶解曲線均為單峰，說明所設計引物特異性良好，無引物二聚體及非特異性擴增產物出現，滿足下一步試驗要求。從擴增動力學曲線可以看出，3個基因擴增曲線均呈“S”形、拐點清晰、基線平緩且無上揚趨勢，說明這3個基因的動力學線性整體平行性較好。由3個基因的標準曲線可見，其擴增效率E在1左右，相關系數R2大于0.990，可認為GAPDH基因、MC4R基因、SIM1基因3個基因擴增效率基本相同，可用于2-△△Ct相對定量分析。

2.2 表達差異分析

本試驗通過對8月齡從江香豬不同組織進行熒光定量PCR，以脂肪中的mRNA表達量作為對照，結果發現MC4R基因和SIM1基因mRNA在從江香豬不同組織中均有表達差異（表2）。

表2 不同組織間的mRNA表達量

由表2可知，對于MC4R基因，mRNA在從江香豬脾臟組織中相對表達量最高，為脂肪表達量的1.54倍；其他組織依次為小腸、脂肪、肝臟、肺、胃、心臟、腎臟、背肌，其相對表達量分別為脂肪表達量的1.21、1.00、0.22、0.17、0.10、0.08、0.04、0.02 倍。經過SPSS 18.0統計分析，從江香豬脾臟、小腸、脂肪組織之間mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05），但與其他組織相對表達量均達到差異顯著水平（P<0.05）；而肝臟、肺、胃、心臟、腎臟、背肌組織之間mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

由表2可知，對于SIM1基因，mRNA在從江香豬脾臟組織中相對表達量最高，為脂肪表達量的2.23倍；其他組織依次為腎臟、脂肪、肝臟、小腸、胃、肺、心臟、背肌，其相對表達量分別為脂肪表達量的2.15、1.00、0.60、0.56、0.14、0.08、0.04、0.03 倍。經過SPSS 18.0統計分析，從江香豬脾臟、腎臟、脂肪組織之間mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05），但與其他組織相對表達量均達到差異顯著水平（P<0.05）；而肝臟、小腸、胃、肺、心臟、背肌組織之間mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 MC4R基因表達規律

黑素皮質激素受-4作為G-蛋白偶聯受體（G-protein coupled receptors,GPCRs）超家族的組成成員之一，屬于含7個跨膜區的G蛋白偶聯受體，在哺乳動物的采食量、體重和維持能量穩態等方面起著重要的調控作用，它能夠通過多條信號通路調節采食和能量代謝[6]。Huszar等[7]利用基因敲除的方法首次證明了MC4R在能量平衡中的關鍵作用；而在豬的調查研究中發現，敲除MC4R基因的小型豬表現出高厭食癥、胰島素抵抗、高胰島素血癥、脂質代謝紊亂，并且肝臟積聚了大量脂肪[8]。張子軍等[9]對山羊的研究發現，MC4R基因在山羊心臟、肝臟等10種組織中均有表達，并在腎臟組織中的表達量最高，大腸和小腸組織中的表達量最低。黃萌等[10]研究中國西門塔爾牛發現，MC4R基因在睪丸、小腸、心臟、胰腺、淋巴、腎臟、脾臟、肝臟、肺臟、肌肉和脂肪組織中均有不同程度的表達。王婕等[11]發現MC4R基因在北京鴨腦組織中表達最高，脾臟、心臟、腿肌、腹脂、腎臟次之，而在肝臟和肺臟中表達量最低。本研究發現，MC4R基因mRNA在從江香豬9種組織中均有表達，但表達存在差異，在脾臟組織中相對表達量最高，其他組織依次為小腸、脂肪、肝臟、肺、胃、心臟、腎臟、背肌。

3.2 SIM1基因表達規律

SIM1基因控制下丘腦內多種主要神經細胞形態最終階段的分化，在哺乳動物中樞神經系統（尤其是下丘腦-垂體軸的視旁核細胞）和腎臟高水平表達，影響下丘腦內視前核和室旁核細胞的發育和形成，對食欲調節起決定作用[12]。Dahmane等[13]利用原位雜交技術35S標記探針，發現在16周胎兒內SIM1基因mRNA主要表達在中樞神經系統，在面部、頭骨、下頜和脊椎內也有適量表達。而Yamaki等[14]發現SIM1基因mRNA主要表達在小鼠間腦區，Ema等[15]發現在肌肉和肺臟也有少量表達。陳哲[16]研究發現，SIM1蛋白在腦和下丘腦表達量最高，在睪丸的表達量次之，在肝臟、皮脂和甲狀腺表達量較高，在肌肉表達量最低，結果提示SIM1基因在神經細胞發育、脂肪代謝和性腺發育過程都可能起到重要作用。本研究發現，SIM1基因mRNA在從江香豬9種組織中均有表達，但表達存在差異，在脾臟組織中相對表達量最高，其他組織依次為腎臟、脂肪、肝臟、小腸、胃、肺、心臟、背肌。

4 結論

本研究采用熒光定量PCR技術檢測MC4R基因和SIM1基因mRNA在從江香豬不同組織中的表達規律，結果表明，MC4R基因和SIM1基因在所檢測的從江香豬9種組織中均有表達，但在不同組織存在一定表達差異，均在脾臟中相對表達量最高，在背肌中最低，說明MC4R基因和SIM1基因在不同組織中參與調控能量代謝，但造成這種差異表達的原因還需進一步的深入研究。

聯合國秘書長發出團結抗疫疾呼—“新冠疫情是二戰以來最大挑戰”

【英國廣播公司網站3月31日報道】題：聯合國秘書長稱新冠疫情是“二戰以來最大的挑戰”

聯合國秘書長安東尼奧·古特雷斯警告說，目前這場新冠疫情是二戰以來世界面臨的最大挑戰。

他說，它可能會引發一場“近代歷史上無可比擬的”衰退。

古特雷斯是在聯合國發布有關新冠疫情可能造成的社會經濟影響的報告時發表上述講話的。

目前全球確診病例超過85萬，死亡人數超過4.1萬。

古特雷斯在紐約聯合國總部說：“新冠肺炎正在攻擊社會的核心，奪走人們的生命和生計。”

古特雷斯說：“世界現在需要的是團結。新冠疫情是自聯合國成立以來我們共同面臨的最大考驗。”

聯合國秘書長呼吁“立即采取協調一致的衛生應對措施，以阻止病毒的傳播，消滅這場疫情”。

古特雷斯敦促工業化國家幫助那些欠發達國家，否則可能“面對疾病像野火一樣蔓延的噩夢”。

聯合國的報告估計，此次疫情可能在全球造成多達2 500萬個工作崗位流失。報告還預測全球外國直接投資量將面臨最高40%的“下行壓力”。

【德國電視一臺網站3月31日報道】題：“二戰以來最大挑戰”

聯合國估計，新冠疫情使世界面臨二戰以來最大挑戰。聯合國秘書長古特雷斯在一場視頻會議上說，疫情將帶來一場“近期不曾有過的”經濟衰退。

他對國際社會的行動感到失望。我們正在朝正確的方向緩慢移動，但如果想打敗病毒，我們必須加快速度并且做更多事情。”他說，應對危機的程度必須與危機本身的規模相稱—各國和國際社會應在世界衛生組織領導下進行協調且全面應對。

古特雷斯說，不僅要遏制病毒，還要共同應對疫情帶來的經濟后果。對發達國家來說，這更容易。它們必須幫助欠發達國家，支持后者的醫療系統應對新冠疫情。聯合國正在與幾個伙伴合作成立一個專門的基金，幫助較貧窮國家應對經濟沖擊。

古特雷斯談到了一個選擇：有朝一日，危機結束，人們是想回到和從前一樣的世界，還是果斷解決掉使世界容易遭受此類危機的事情？從危機中復蘇也應促成更公平、更環保的經濟。

【德新社紐約3月31日電】聯合國秘書長古特雷斯周二表示，世界在協同抗擊新冠病毒方面正漸漸落后。與此同時，他啟動了一項計劃，以應對此次疫情造成的社會經濟影響。

聯合國秘書長在視頻記者會上說：“我們距離在全球范圍內有效抗擊新冠疫情并解決其對全球經濟和全球社會造成的負面影響這個目標仍然非常遙遠。”

古特雷斯還說：“我們遠沒有制定一個幫助發展中國家的全球一攬子方案。動用的大部分資金都是發達國家用來支持它們自己經濟的。”

他說，應該通過擴大國際貨幣基金組織的能力來增加窮國可以獲得的資源，必須把重點放在受影響最深的人身上，包括處于戰火中的國家的婦女和人民。

（轉自 參考消息[N]，2020-04-02）